CN113490749A - 改进的核酸扩增 - Google Patents

改进的核酸扩增 Download PDF

Info

Publication number
CN113490749A
CN113490749A CN201980092708.5A CN201980092708A CN113490749A CN 113490749 A CN113490749 A CN 113490749A CN 201980092708 A CN201980092708 A CN 201980092708A CN 113490749 A CN113490749 A CN 113490749A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
mit
weight
composition
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980092708.5A
Other languages
English (en)
Inventor
T·克鲁平斯基
J·D·维特希克
黄诗海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Molecular Inc
Original Assignee
Abbott Molecular Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Molecular Inc filed Critical Abbott Molecular Inc
Publication of CN113490749A publication Critical patent/CN113490749A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D275/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings
    • C07D275/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D275/03—Heterocyclic compounds containing 1,2-thiazole or hydrogenated 1,2-thiazole rings not condensed with other rings with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本文提供了技术，所述技术涉及核酸扩增，并且特别地但不排他地涉及用于改进聚合酶链式反应和提供具有改进的稳定性的聚合酶链式反应的试剂的组合物和方法。

Description

改进的核酸扩增
本申请要求2018年12月31日提交的美国临时专利申请序列号62/786,860的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文提供了技术，所述技术涉及核酸扩增，并且特别地但不排他地涉及用于进行聚合酶链式反应和提供具有改进的稳定性的聚合酶链式反应的试剂的组合物和方法。
背景技术
基于聚合酶链式反应(PCR)的许多体外诊断测定依赖于快速聚合酶。因此，快速PCR酶已经被工程化以提供增加的速度和持续合成能力(processivity)，但也可能表现出从非特异性引发和/或二聚体-引物形成产生虚假扩增产物的增加的倾向。这些非特异性产物的形成可通过干扰靶扩增和/或通过消耗反应资源而对PCR和/或RT-PCR的整体效率产生负面影响。
已经开发了许多技术来改进核酸的扩增，例如通过PCR。例如，可获得减少PCR中的非特异性引发和/或二聚体-引物形成的组合物和方法。一种具体的策略包括使用经热不稳定化学修饰产生的“热启动”引物和“热启动”dNTP，所述热步温度化学修饰防止在热循环程序开始时在升高的温度下在孵育之前的延伸。然而，“热启动”机制可能对RT-PCR产生负面影响，因为大多数逆转录酶被“热启动”热循环步骤的升高的温度不可逆地灭活。其他PCR和RT-PCR增强剂包括甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、甲酰胺和二甲基亚砜(DMSO)，它们通常通过增加杂交的特异性和增加引物/探针的Tm发挥作用。
虽然非特异性引发和/或二聚体-引物形成可能发生在逆转录和/或PCR步骤期间，但也可能发生在主混合物制备期间和反应设置期间。这些问题对PCR和RT-PCR测定的制造商来说是挑战，尤其是当制造步骤需要组装完整的主混合物(例如，包含酶、活化试剂、引物和/或探针的主混合物)作为单一的批量试剂时。通常与制备、混合和填充此类批量试剂相关的较长前置时间可增加制造期间非特异性引发和/或二聚体-引物形成的可能性，从而导致测定性能下降。
发明内容
本文提供的技术涉及2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)作为PCR的增强剂的用途。MIT已被用作灭菌剂(例如，在以商品名PROCLIN 950出售的防腐剂中)。本文提供的技术包括使用MIT作为PCR的增强剂并提供活化的PCR和/或RT-PCR主混合物的增加的稳定性(例如，在主混合试剂制造期间)。在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以测试MIT在PCR中破坏和/或防止非特异性引发和/或引物-二聚体形成的用途。在这些实验期间收集的数据表明，将MIT包括在PCR/RT-PCR反应中防止和/或破坏非特异性引发和/或引物-二聚体形成，从而减少非特异性产物的积聚(参见例如，实施例1和实施例2)。此外，这些数据表明MIT提供PCR/RT-PCR测定性能的一般增强(参见例如，实施例3和实施例4)和活化的主混合物的改进的稳定性(参见例如，实施例5)。
因此，该技术可用作PCR和/或RT-PCR应用中的通用增强剂；以及2)可用于改进PCR和/或RT-PCR主混合物的稳定性(例如在主混合试剂制造期间)。在一些实施方案中，该技术提供了一种核酸扩增组合物。在一些实施方案中，核酸扩增组合物包含聚合酶、一个或多个引物(例如，第一引物和第二引物)、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT))。在一些实施方案中，核酸扩增组合物包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，核酸扩增组合物还包含靶模板。
在一些实施方案中，核酸扩增组合物还包含可检测标记的探针或***染料。该技术不限于可检测标记或***染料。例如，在一些实施方案中，可检测标记为荧光部分，例如可合成或商购获得的染料(例如，来自Operon Biotechnologies，Huntsville，Alabama)。大量染料(大于50种)可应用于荧光激发应用。这些染料包括来自荧光素、罗丹明、AlexaFluor、Bodipy、香豆素和花菁染料家族的染料。荧光团的具体实例包括但不限于FAM、TET、HEX、Cy3、TMR、ROX、VIC(例如，来自Life Technologies)、Texas red、LC red 640、Cy5和LC red 705。在一些实施方案中，具有410nm(例如，Cascade Blue)至775nm(例如，AlexaFluor 750)的发射最大值的染料可用且可使用。当然，本领域普通技术人员将认识到，也可使用具有在这些范围之外的发射最大值的染料。在一些情况下，范围在500nm至700nm之间的染料具有在可见光谱中的优势，并且可使用现有的光电倍增管进行检测。在一些实施方案中，广泛范围的可用染料允许选择具有分布在整个检测范围内的发射波长的染料组。能够区分多种染料的检测***是本领域已知的。
在一些实施方案中，核酸扩增组合物不包含引物二聚体(例如，包含所述第一引物和所述第二引物)(例如，可检测水平的引物二聚体)。
在一些实施方案中，该技术提供了一种寡核苷酸试剂。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂包含一个或多个引物(例如，第一引物和第二引物)、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.001％至0.01％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂还包含第二可检测标记的探针(例如，包含如上所述的荧光部分)。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂还包含参考染料(例如，如上所述的荧光染料)。在一些实施方案中，寡核苷酸试剂还包含第三引物和/或第四引物。
在一些实施方案中，该技术提供了试剂盒(例如，用于通过实时PCR(例如，RT-PCR)检测核酸的试剂盒)。例如，在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含寡核苷酸试剂，所述寡核苷酸试剂包含一个或多个引物(例如，第一引物和第二引物)、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT；以及活化试剂，所述活化试剂包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，试剂盒还包含在缓冲溶液中的热稳定聚合酶。在一些实施方案中，热稳定聚合酶为rTth聚合酶。然而，该技术不限于此特定聚合酶并且包含含有本领域已知的其他聚合酶(例如，如本文所述的)的实施方案。在一些实施方案中，试剂盒还包含内部对照，所述内部对照包含对照核酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
该技术涉及提供储存稳定(shelf-stable)的试剂(例如，用于实时PCR的试剂)。在一些实施方案中，该技术提供了一种商业规模的主混合物组合物，所述组合物的体积大于10mL(例如，大于100mL、大于1升)，并且包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)的MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)。在一些实施方案中，商业规模的主混合物组合物包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)的MIT。
在一些实施方案中，该技术提供了一种商业规模的主混合物组合物，所述组合物的体积大于10mL(例如，大于100mL、大于1升)，并且包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)的MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)。在一些实施方案中，商业规模的主混合物组合物包含氯化锰和0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，技术提供了用于检测核酸的方法(例如，通过实时PCR)。例如，在一些实施方案中，方法包括提供反应组合物，所述反应组合物包含聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)。在一些实施方案中，方法包括提供反应组合物，所述反应组合物包含聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，方法还包括向所述反应组合物中加入样品。在一些实施方案中，方法还包括提供可检测标记的探针(例如，其中所述标记是如本文所述的荧光部分)或***染料。在一些实施方案中，方法还包括热循环所述反应组合物。在一些实施方案中，方法还包括测量所述反应组合物的荧光发射。
在一些实施方案中，用于检测核酸的方法(例如，通过实时PCR)包括储存实时PCR试剂至少1天、1周或1个月，所述实时PCR试剂包含0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)以及聚合酶、第一引物、第二引物和/或核苷酸中的至少一种。在一些实施方案中，实时PCR试剂用于制备反应组合物，所述反应组合物包含聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)。在一些实施方案中，方法包括使用实时PCR试剂来制备反应组合物、聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种生产实时PCR试剂的方法，所述方法包括将0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT(例如，0.001％至0.01％(重量/重量)MIT)与聚合酶、第一引物、第二引物和/或核苷酸中的至少一种混合。在一些实施方案中，生产实时PCR试剂的方法包括将0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT与聚合酶、第一引物、第二引物和/或核苷酸中的至少一种混合。在一些实施方案中，实时PCR试剂的体积大于10mL(例如，大于100mL、大于1升)。在一些实施方案中，生产实时PCR试剂的方法包括储存所述实时PCR试剂至少1天、1周或1个月。在一些实施方案中，生产实时PCR试剂的方法包括将参考染料、可检测标记的探针、***染料、第三引物和/或第四引物混合到实时PCR试剂中。
在一些实施方案中，技术提供了用于检测核酸的***。在一些实施方案中，***包含寡核苷酸试剂，所述寡核苷酸试剂包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT；以及活化试剂，所述活化试剂包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，***还包含实时热循环仪。本文提供的技术的一些实施方案还包括用于收集、存储和/或分析数据的功能。例如，在一些实施方案中，装置包括用于例如存储和执行指令、分析数据、使用数据执行计算、转换数据和存储数据的处理器、存储器和/或数据库。此外，在一些实施方案中，处理器被配置为控制装置。在一些实施方案中，处理器用于启动和/或终止测量和数据收集。在一些实施方案中，装置包括用于接收由处理器用来引导测量的用户输入的用户界面(例如，键盘、按钮、拨号盘、开关等)。在一些实施方案中，装置还包括用于将数据发射到外部目的地(例如，计算机、显示器、网络和/或外部存储介质)的数据输出。一些实施方案规定装置是并入这些特征和组件的小型、手持、便携式装置。在一些实施方案中，***还包含被配置来确定Ct值的计算机。在一些实施方案中，***还包含在缓冲溶液中的热稳定聚合酶。在一些实施方案中，热稳定聚合酶为rTth聚合酶。
基于本文所包含的教导内容，另外的实施方案对于相关领域的技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
参考以下附图将更好地理解本技术的这些和其他特征、方面和优点。在附图中，“Proclin”是指PROCLIN 950(9.5％(重量/重量)溶于水的MIT)。
图1是RT-PCR数据的图，其指示将MIT包括在主混合物中减少非特异性产物的积聚。所述图示出dRn根据包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的样品的循环数变化。
图2是RT-PCR数据的图，其示出将MIT包括在RT-PCR主混合物中减少在长期储存期间非特异性产物的积聚。所述图示出dRn根据包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的样品的循环数变化。
图3是RT-PCR数据的图，其指示将MIT添加到HIV-1测定主混合物中增强RT-PCR性能。所述图示出dRn根据包含50个HIV-1靶RNA拷贝并且包含0.015％(重量/重量)PROCLIN950(0.0015％(重量/重量)MIT)或不包含PROCLIN 950的样品的循环数变化。
图4是RT-PCR数据的图，其指示将MIT添加到CT/NG(沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae))主混合物中增强RT-PCR性能。所述图示出dRn根据包含0.1个沙眼衣原体包涵体形成单位并且包含0.015％(重量/重量)PROCLIN 950(0.0015％(重量/重量)MIT)或不包含PROCLIN 950的样品的循环数变化。
图5是RT-PCR数据的图，其指示MIT改进PCR主混合物的稳定性。所述图示出dRn根据在包含50个HIV-1RNA拷贝的反应混合物中使用之前，在2℃至8℃下孵育16小时的包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的主混合物的循环数变化。
应当理解，附图不一定按比例绘制，附图中的对象也不一定按彼此的关系按比例绘制。附图是旨在使本文公开的设备、***和方法的各种实施方案清楚和理解的描绘。在可能的情况下，将在整个附图中使用相同的参考数字来指相同或类似的部件。此外，应当理解，附图并非旨在以任何方式限制本教导的范围。
具体实施方式
本文提供了技术，所述技术涉及核酸扩增，并且特别地但不排他地涉及用于进行聚合酶链式反应和提供具有改进的稳定性的聚合酶链式反应的试剂的组合物和方法。
在各种实施方案的这种详细描述中，为了解释的目的，阐述了许多特定细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，这些不同的实施方案可在有或没有这些特定细节的情况下实施。在其他情况下，结构和装置以框图形式示出。此外，本领域技术人员可容易地理解，呈现和执行方法的特定顺序是说明性的，并且设想所述顺序可变化并且仍保持在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论著和互联网网页，均出于任何目的明确地以引用的方式整体并入。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本文所述的各个实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。当并入的参考文献中术语的定义似乎与本教导中提供的定义不同时，应以本教导中提供的定义为准。本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为以任何方式限制所描述的主题。
定义
为促进对本技术的理解，以下定义多个术语和短语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语采用与本文明确相关的含义。如本文所用，短语“在一个实施方案中”不一定指同一实施方案，尽管它可以。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可以。因此，如下所述，可容易地组合本发明的各种实施方案而不脱离本发明的范围或精神。
另外，如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”是包含性的“或”运算符，并且等同于术语“和/或”。除非上下文另有明确规定，否则术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的另外的因素。另外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
如本文所用，术语“约”、“大约”、“基本上”和“显著”为本领域普通技术人员所理解，并且将根据使用它们的上下文在一定程度上变化。如果所述术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，则考虑到这些术语使用的上下文，“约”和“大约”意指特定术语的加或减小于或等于10％(重量/重量)，并且“基本上”和“显著”意指特定术语的加或减大于10％(重量/重量)。
如本文所用，范围的公开包括整个范围内所有值和进一步划分的范围的公开，包括为范围给出的端点和子范围。
如本文所用，后缀“-无(-free)”是指省略附加“-无”的词的基本词根的特征的技术的实施方案。即，如本文所用，术语“无X”意指“没有X”，其中X是在“无X”技术中省略的技术的特征。例如，“无钙”组合物不包含钙，“无混合”方法不包括混合步骤等。
尽管术语“第一”、“第二”、“第三”等可在本文中用于描述各种步骤、元素、组合物、组分、区域、层和/或部分，但是除非另有说明，否则这些步骤、元素、组合物、组分、区域、层和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语用于区分一个步骤、元素、组合物、组分、区域、层和/或部分与另一个步骤、元素、组合物、组分、区域、层和/或部分。除非上下文明确指出，否则本文使用的诸如“第一”、“第二”和其他数字术语的术语不暗示顺序或次序。因此，在不脱离技术的情况下，本文讨论的第一步骤、元素、组合物、组分、区域、层或部分可称为第二步骤、元素、组合物、组分、区域、层或部分。
如本文所用，“dRn”是指在每个时间点和/或循环数的RT-PCR期间产生的荧光信号的幅度。dRn值由以下公式(Rn+)-(Rn-)确定。Rn(归一化报告信号)是报告染料的荧光发射强度除以被动参考染料的荧光发射强度。Rn+是含有所有组分(包括模板)的反应的Rn值。Rn-是未反应的样品的Rn值。Rn-值可从RT-PCR的早期循环(例如，荧光显著增加之前的循环)或在不包含模板的反应中获得。
如本文所用，术语“Ct”或“阈值循环”是指反应内产生的荧光穿过阈值时的循环数。Ct与初始拷贝数的对数呈负相关。因此，分配给特定反应的Ct值反映了在反应期间积聚了足够数量的扩增子的点。
如本文所用，术语“***染料”或“dsDNA结合剂”是指相对于不与双链DNA(dsDNA)结合时，与dsDNA结合时具有更高荧光发射的分子。因此，在一些实时PCR中，荧光强度与dsDNA(扩增子)浓度成比例增加。示例性dsDNA结合剂为SYBR Green I，它是在溶液中时几乎不发射荧光，但在与双链DNA结合时发射强荧光信号的荧光小沟结合染料。类似的dsDNA结合荧光染料包括EvaGreen和LCGreen。
如本文所用，术语“快速PCR”是指由于扩增子设计、试剂化学、热循环条件和仪器(例如，具有快速升温速率的PCR机器)的改进而在小于90分钟(例如，30、35、40、45、50、55或60分钟或更少时间)的运行时间内完成的修改的PCR方案。
如本文所用，术语“无扩增对照”或“NAC”是不包含聚合酶的对照。在mRNA分析中，NAC是含有除逆转录酶外的所有RT-PCR试剂的模拟逆转录。如果使用cDNA或基因组DNA作为模板，则缺乏Taq聚合酶的反应混合物可作为NAC包括在测定中。不应在NAC中合成产物。
如本文所用，术语“无模板对照”或“NTC”是不包含样品或靶核酸的对照。NTC包括除RNA模板外的所有RT-PCR试剂。不应在NTC中合成产物。
如本文所用，术语“核酸靶标”或“靶模板”或“靶核酸”是指被扩增或意图被扩增的DNA或RNA序列。用于扩增靶序列的核酸样品称为模板。在典型的qPCR中，反应中包括的cDNA样品为模板。
如本文所用，术语“实时PCR”是指在整个循环中连续收集来自聚合酶链式反应的荧光信号。
如本文所用，术语“阈值”是指被认为高于背景水平或噪声的荧光信号水平。在一些实施方案中，阈值是早期PCR循环的Rn标准偏差的10倍且/或设置在与PCR产物的指数增长相关的区域中，并且没有曲线的线性或平台部分那么高。在一些实施方案中，阈值高于最高基线信号水平。
如本文所用，“核酸”应意指包括但不限于DNA、RNA及其杂合体的任何核酸分子。形成核酸分子的核酸碱基可为碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物在本领域中是众所周知的。应当理解所述术语包括作为等同物的由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。如本文所用，术语还涵盖cDNA，即例如通过逆转录酶的作用由RNA模板产生的互补的或复制的DNA。
对碱基、核苷酸或另一分子的提及可为单数或复数。即，例如在溶液中，“碱基”可指该碱基的单个分子或指多个碱基。
“多核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指通过核苷间键联连接的核苷(包括脱氧核糖核苷、核糖核苷或其类似物)的线性聚合物。通常，多核苷酸包含至少三个核苷。通常，寡核苷酸的大小范围在几个单体单元(例如3至4个)至几百个单体单元内。每当诸如寡核苷酸的多核苷酸由诸如“ATGCCTG”的字母序列表示时，将理解核苷酸从左到右以5′到3′的次序，并且“A”或“a”表示脱氧腺苷，“C”或“c”表示脱氧胞苷，“G”或“g”表示脱氧鸟苷，并且“T”或“t”表示胸苷，除非另有说明。字母A、C、G和T可用于指碱基本身、核苷或包含碱基的核苷酸，这是本领域的标准。
在一些实施方案中，核酸包含通用或修饰的碱基，诸如脱氧肌苷、肌苷、7-脱氮-2′-脱氧肌苷、2-氮杂-2′-脱氧肌苷、2′-O-Me肌苷、2′-F肌苷、脱氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2′-O-Me 3-硝基吡咯、2′-F 3-硝基吡咯、1-(2′-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脱氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2′-O-Me 5-硝基吲哚、2′-F 5-硝基吲哚、脱氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脱氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脱氧水粉蕈素(deoxynebularine)、2′-F水粉蕈素、2′-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚(PNA-5-introindole)、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、吗啉代-5-硝基吲哚、吗啉代-水粉蕈素、吗啉代-肌苷、吗啉代-4-硝基苯并咪唑、吗啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2′-O-甲氧基乙基肌苷、2′-O-甲氧基乙基水粉蕈素、2′-O-甲氧基乙基5-硝基吲哚、2′-O-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑、2′-O-甲氧基乙基3-硝基吡咯及其组合。
如本文所用，如本领域技术人员所理解的，“互补”通常是指特定的核苷酸双链体以形成规范的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。然而，互补还包括能够与增强双链体热稳定性的A、T、G或C核苷酸和锁核酸进行通用碱基配对的核苷酸类似物的碱基配对。本领域技术人员将认识到，杂交严格性是通过杂交形成的双链体中匹配或错配程度的决定因素。
如本文所用，术语“聚合酶”是指通常用于连接3′-OH 5′-三磷酸核苷酸、寡聚体以及它们的类似物的酶。聚合酶包括但不限于DNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、DNA聚合酶1、Klenow片段、水生嗜热菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶(例如，重组Tth(rTth)聚合酶；参见例如，Abu al-Soud和Radstrom(1998)“Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediateDNA amplification in the presence of PCR-Inhibiting samples”Appl EnvironMicrobiol.64：3748-53；Myers和Gelfand(1991)“Reverse transcription and DNAamplification by a thermus-thermophilus DNA-polymerase”Biochemistry30：7661-66，其各自以引用的方式并入本文)、Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)、Deep VentDNA聚合酶(New England Biolabs)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、DNA聚合酶大片段、Stoeffel片段、9°N DNA聚合酶、9°Nm聚合酶、高温嗜热菌(Pfu)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Tfl)DNA聚合酶、RepliPHI Phi29聚合酶、海滨嗜热球菌(Tli)DNA聚合酶、真核DNA聚合酶β、端粒酶、Therminator聚合酶(New England Biolabs)、KOD HiFi.DNA聚合酶(Novagen)、KOD1DNA聚合酶、Q-β复制酶、末端转移酶、AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、Phi6逆转录酶、HIV-1逆转录酶、通过生物勘探和/或分子进化发现的新聚合酶以及美国专利申请公布第2007/0048748号及美国专利第6,329,178号；第6,602,695号；和第6,395,524号中引用的聚合酶。这些聚合酶包括野生型、突变同工型和基因工程化的变体，诸如外切-聚合酶；具有最小化的、不可检测的和/或降低的3′→5′校对核酸外切酶活性的聚合酶以及其他突变体，例如，耐受标记的核苷酸并将其并入到核酸链中的突变体。在一些实施方案中，聚合酶被设计用于例如实时PCR、高保真PCR、下一代DNA测序、快速PCR、热启动PCR、粗样品PCR、稳健PCR和/或分子诊断中。此类酶可从许多商业供应商处获得，例如Kapa Enzymes、Finnzymes、Promega、Invitrogen、Life Technologies、Thermo Scientific、Qiagen、Roche等。在一些实施方案中，聚合酶具有5′→3′核酸外切酶活性，并且因此除了催化从核酸的3′-OH(例如，从引物，例如发夹引物)合成核酸之外，还可从5′末端降解核酸。在一些实施方案中，聚合酶(例如，高保真聚合酶)包含校对活性、3′外切核酸酶活性和/或链置换活性，但缺乏5′外切核酸酶活性。
如本文所用，术语“引物”是指寡核苷酸，无论是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起始点。引物优选为单链的，以获得最大扩增效率，但也可替代地为双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物之前，引物首先被处理以分离其链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。如本文所用，发夹引物的单链(例如，扩增子特异性)部分可用于引发核酸的合成。
如本文所用，术语“退火”或“引发”是指寡脱氧核苷酸或核酸与模板核酸的并置，由此所述并置使得聚合酶能够将核苷酸聚合成与模板核酸或其部分互补的核酸分子。如本文所用，术语“杂交”是指由互补单链核酸形成双链核酸。术语“退火”和“杂交”之间没有有意的区别，并且这些术语将互换使用。引物的序列可包含一些错配，只要它们可与模板杂交并用作引物。术语“基本互补的”在本文中用于表示引物足够互补以在指定的退火条件或严格条件下与模板核酸序列选择性杂交，使得退火的引物可被聚合酶延伸以形成互补的模板拷贝。
如本文所用，术语“样品”以其最广泛的意义使用。在一种意义上，所述样品可指动物细胞或组织。在另一种意义上，所述样品意在包括从任何来源获得的样本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可从植物或动物(包括人)获得，并且涵盖流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。在特定实施方案中，样品包含靶核酸。
描述
化合物2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)是已知通过抑制特定的Kreb循环酶来遏制微生物呼吸的灭菌化合物。MIT具有CAS编号2682-20-4、经验式C4H5NOS和分子量115.15。MIT具有根据以下的结构：
Figure BDA0003221809830000201
MIT是抗微生物剂PROCLIN 950(9.5％(重量/重量)溶于水的MIT)中的活性成分，将其用于防止微生物生长。本文提供的技术的实施方案涉及使用MIT来改进PCR。在一些实施方案中，技术包括在用于扩增核酸(例如，PCR)的试剂中以不具有灭菌活性或具有较差或不希望水平的灭菌活性的浓度使用MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含聚合酶和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含探针和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含***染料和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含聚合酶、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含聚合酶、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、探针和MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含聚合酶、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料和MIT。
在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以测试RT-PCR中MIT的浓度。在实验期间收集的数据表明，通过向反应混合物中加入MIT改善核酸扩增(例如，PCR(例如，RT-PCR))。特别地，生产包含0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT的反应混合物。因此，在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含大约0.001％至0.002％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含大约0.0001％至0.01％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含大约0.0045％至0.0055％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物包含大约0.001％至0.1％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，技术提供了一种用于核酸扩增的组合物，所述组合物包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，MIT作为水中的混合物(例如，作为包含9.5％(重量/重量)溶于水的MIT和任选的其他组分(例如，PROCLIN950)的溶液)提供。在一些实施方案中，技术提供了一种用于核酸扩增的组合物，所述组合物包含0.010、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.020、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.030、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039、0.040、0.041、0.042、0.043、0.044、0.045、0.046、0.047、0.048、0.049或0.050PROCLIN950。
在一些实施方案中，技术提供了体积的范围从纳升至微升(例如，PCR或RT-PCR反应)到毫升至厘升(例如，PCR或RT-PCR主混合物)到分升至升到十升至更大体积(例如，以商业规模生产的PCR或RT-PCR试剂)的组合物。因此，在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物的体积为1nl、5nl、10nl、20nl、30nl、40nl、50nl、60nl、70nl、80nl、90nl、100nl、110nl、120nl、130nl、140nl、150nl、160nl、170nl、180nl、190nl、200nl、210nl、220nl、230nl、240nl、250nl、260nl、270nl、280nl、290nl、300nl、310nl、320nl、330nl、340nl、350nl、360nl、370nl、380nl、390nl、400nl、410nl、420nl、430nl、440nl、450nl、460nl、470nl、480nl、490nl、500nl、510nl、520nl、530nl、540nl、550nl、560nl、570nl、580nl、590nl、600nl、610nl、620nl、630nl、640nl、650nl、660nl、670nl、680nl、690nl、700nl、710nl、720nl、730nl、740nl、750nl、760nl、770nl、780nl、790nl、800nl、810nl、820nl、830nl、840nl、850nl、860nl、870nl、880nl、890nl、900nl、910nl、920nl、930nl、940nl、950nl、960nl、970nl、980nl、990nl或1000nl，并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物的体积为1μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、110μl、120μl、130μl、140μl、150μl、160μl、170μl、180μl、190μl、200μl、210μl、220μl、230μl、240μl、250μl、260μl、270μl、280μl、290μl、300μl、310μl、320μl、330μl、340μl、350μl、360μl、370μl、380μl、390μl、400μl、410μl、420μl、430μl、440μl、450μl、460μl、470μl、480μl、490μl、500μl、510μl、520μl、530μl、540μl、550μl、560μl、570μl、580μl、590μl、600μl、610μl、620μl、630μl、640μl、650μl、660μl、670μl、680μl、690μl、700μl、710μl、720μl、730μl、740μl、750μl、760μl、770μl、780μl、790μl、800μl、810μl、820μl、830μl、840μl、850μl、860μl、870μl、880μl、890μl、900μl、910μl、920μl、930μl、940μl、950μl、960μl、970μl、980μl、990μl或1000μl，并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物的体积为1ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、110ml、120ml、130ml、140ml、150ml、160ml、170ml、180ml、190ml、200ml、210ml、220ml、230ml、240ml、250ml、260ml、270ml、280ml、290ml、300ml、310ml、320ml、330ml、340ml、350ml、360ml、370ml、380ml、390ml、400ml、410ml、420ml、430ml、440ml、450ml、460ml、470ml、480ml、490ml、500ml、510ml、520ml、530ml、540ml、550ml、560ml、570ml、580ml、590ml、600ml、610ml、620ml、630ml、640ml、650ml、660ml、670ml、680ml、690ml、700ml、710ml、720ml、730ml、740ml、750ml、760ml、770ml、780ml、790ml、800ml、810ml、820ml、830ml、840ml、850ml、860ml、870ml、880ml、890ml、900ml、910ml、920ml、930ml、940ml、950ml、960ml、970ml、980ml、990ml或1000ml，并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种组合物，所述组合物的体积为1L、5L、10L、20L、30L、40L、50L、60L、70L、80L、90L、100L、110L、120L、130L、140L、150L、160L、170L、180L、190L、200L、210L、220L、230L、240L、250L、260L、270L、280L、290L、300L、310L、320L、330L、340L、350L、360L、370L、380L、390L、400L、410L、420L、430L、440L、450L、460L、470L、480L、490L、500L、510L、520L、530L、540L、550L、560L、570L、580L、590L、600L、610L、620L、630L、640L、650L、660L、670L、680L、690L、700L、710L、720L、730L、740L、750L、760L、770L、780L、790L、800L、810L、820L、830L、840L、850L、860L、870L、880L、890L、900L、910L、920L、930L、940L、950L、960L、970L、980L、990L或1000L，并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。
在一些实施方案中，相对于不包含MIT的PCR反应，向PCR反应混合物中加入MIT使实时PCR(例如，实时RT-PCR)的信号增加1.1倍至10倍或更多倍(例如，1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5.0倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6.0倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7.0倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8.0倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9.0倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍或10.0倍或更多倍)。
在一些实施方案中，相对于不包含MIT的PCR反应，向PCR反应混合物中加入MIT使指示靶核酸存在的Ct(实时PCR(例如，实时RT-PCR)的信号)降低1至20个循环(例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0个循环)。
在一些实施方案中，向PCR反应混合物中加入MIT使非特异性产物的量降低1％至100％(例如，1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％、15.0％、15.5％、16.0％、16.5％、17.0％、17.5％、18.0％、18.5％、19.0％、19.5％、20.0％、20.5％、21.0％、21.5％、22.0％、22.5％、23.0％、23.5％、24.0％、24.5％、25.0％、25.5％、26.0％、26.5％、27.0％、27.5％、28.0％、28.5％、29.0％、29.5％、30.0％、30.5％、31.0％、31.5％、32.0％、32.5％、33.0％、33.5％、34.0％、34.5％、35.0％、35.5％、36.0％、36.5％、37.0％、37.5％、38.0％、38.5％、39.0％、39.5％、40.0％、40.5％、41.0％、41.5％、42.0％、42.5％、43.0％、43.5％、44.0％、44.5％、45.0％、45.5％、46.0％、46.5％、47.0％、47.5％、48.0％、48.5％、49.0％、49.5％、50.0％、50.5％、51.0％、51.5％、52.0％、52.5％、53.0％、53.5％、54.0％、54.5％、55.0％、55.5％、56.0％、56.5％、57.0％、57.5％、58.0％、58.5％、59.0％、59.5％、60.0％、60.5％、61.0％、61.5％、62.0％、62.5％、63.0％、63.5％、64.0％、64.5％、65.0％、65.5％、66.0％、66.5％、67.0％、67.5％、68.0％、68.5％、69.0％、69.5％、70.0％、70.5％、71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％、87.0％、87.5％、88.0％、88.5％、89.0％、89.5％、90.0％、90.5％、91.0％、91.5％、92.0％、92.5％、93.0％、93.5％、94.0％、94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、100.0％)。
在一些实施方案中，相对于不包含MIT的PCR反应，向PCR反应混合物中加入MIT使荧光高于阈值的非特异性产物的形成延迟1-20个循环(例如，1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9或20.0个循环)。
在一些实施方案中，技术提供了用于产生用于扩增核酸的组合物的方法(例如，通过PCR(例如，通过RT-PCR))。例如，在一些实施方案中，方法包括提供、产生和/或获得组合物，所述组合物包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及MIT。在一些实施方案中，MIT通过提供、产生和/或获得包含PROCLIN950的组合物来提供。
在一些实施方案中，方法包括将包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)的组合物与0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT混合。
在一些实施方案中，方法包括将样品(例如，核酸)添加到包含MIT的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将引物添加到包含MIT的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将探针添加到包含MIT的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将***染料添加到包含MIT的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将聚合酶添加到包含MIT的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)添加到包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物中。
在一些实施方案中，方法包括将包含MIT的组合物添加到包含样品(例如，核酸)的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将包含MIT的组合物添加到包含引物的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将包含MIT的组合物添加到包含探针的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将包含MIT的组合物添加到包含***染料的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将包含MIT的组合物添加到包含聚合酶的组合物中。在一些实施方案中，方法包括将包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物添加到包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)的组合物中。
在一些实施方案中，方法包括将包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物储存1至60分钟(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5或60.0分钟)、1至24小时(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5或24.0小时)、1至30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天)、1至12个月(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0个月)或1至10年(例如，1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00、8.25、8.50、8.75、9.00、9.25、9.50、9.75或10.00年)。
在一些实施方案中，方法包括将包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物储存在-5℃至30℃(例如，-5.0℃、-4.5℃、-4.0℃、-3.5℃、-3.0℃、-2.5℃、-2.0℃、-1.5℃、-1.0℃、-0.5℃、0.0℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.0℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃、14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃、23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃、25.5℃、26.0℃、26.5℃、27.0℃、27.5℃、28.0℃、28.5℃、29.0℃、29.5℃或30.0℃)下。
在一些实施方案中，方法包括将包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物储存在-5℃至30℃(例如，-5.0℃、-4.5℃、-4.0℃、-3.5℃、-3.0℃、-2.5℃、-2.0℃、-1.5℃、-1.0℃、-0.5℃、0.0℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.0℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃、14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃、23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃、25.5℃、26.0℃、26.5℃、27.0℃、27.5℃、28.0℃、28.5℃、29.0℃、29.5℃或30.0℃)下1至60分钟(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5或60.0分钟)、1至24小时(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5或24.0小时)、1至30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天)、1至12个月(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0个月)或1至10年(例如，1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00、8.25、8.50、8.75、9.00、9.25、9.50、9.75或10.00年)。
在一些实施方案中，方法包括将体积为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000nl、μl、ml或L并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物储存1至60分钟(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5或60.0分钟)、1至24小时(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5或24.0小时)、1至30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天)、1至12个月(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0个月)或1至10年(例如，1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00、8.25、8.50、8.75、9.00、9.25、9.50、9.75或10.00年)。
在一些实施方案中，方法包括将体积为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000nl、μl、ml或L并且包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物储存在-5℃至30℃(例如，-5.0℃、-4.5℃、-4.0℃、-3.5℃、-3.0℃、-2.5℃、-2.0℃、-1.5℃、-1.0℃、-0.5℃、0.0℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.0℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃、14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃、23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃、25.5℃、26.0℃、26.5℃、27.0℃、27.5℃、28.0℃、28.5℃、29.0℃、29.5℃或30.0℃)下1至60分钟(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5、50.0、50.5、51.0、51.5、52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5或60.0分钟)、1至24小时(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5或24.0小时)、1至30天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天)、1至12个月(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12.0个月)或1至10年(例如，1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75、3.00、3.25、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75、5.00、5.25、5.50、5.75、6.00、6.25、6.50、6.75、7.00、7.25、7.50、7.75、8.00、8.25、8.50、8.75、9.00、9.25、9.50、9.75或10.00年)。
在一些实施方案中，技术提供了一种方法，所述方法包括将包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)以及0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT的组合物等分成多个较小体积。
在一些实施方案中，方法包括热循环如本文所述的组合物，例如由本文所述的方法提供的组合物。在一些实施方案中，方法包括记录荧光发射根据时间和/或循环数的变化，以例如提供实时PCR和/或实时RT-PCR数据。
在一些实施方案中，样品制备和测定性能是自动化的(例如，使用自动化样品处理、扩增和分析***)。在一些实施方案中，利用可商购获得的***(例如，可从Abbott，Abbott Park，IL获得；参见例如，美国专利第8,703,445号；以引用的方式并入本文)。
在一些实施方案中，技术包括用于分析和显示数据的软件和计算机处理器和显示屏(例如，计算机、膝上型计算机、智能电话、平板计算机等)。
在一些实施方案中，测定组分以***或试剂盒的形式提供。在一些实施方案中，试剂盒包含测定试剂(例如，核酸引物或探针、缓冲液、对照、dNTP等)、对照、软件、说明书等。在一些实施方案中，试剂提供在一个或多个单独的容器(例如、小瓶、孔、管等)。例如，在一些实施方案中，试剂各自提供在单独的容器中。
在一些实施方案中，技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如本文所述的一种或多种组合物(例如，包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)的组合物)，其中试剂盒的组合物中的至少一种包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。在一些实施方案中，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种组合物包含MIT。在一些实施方案中，一种组合物包含MIT。
在一些实施方案中，技术提供了一种***，所述***包含如本文所述的一种或多种组合物(例如，包含PCR的一种或多种组分(例如，聚合酶、引物、探针、核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP单体中的一种或多种)、***染料、水、缓冲液、样品和/或靶核酸)的组合物)，其中试剂盒的组合物中的至少一种包含0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0101％、0.0102％、0.0103％、0.0104％、0.0105％、0.0106％、0.0107％、0.0108％、0.0109％、0.0110％、0.0111％、0.0112％、0.0113％、0.0114％、0.0115％、0.0116％、0.0117％、0.0118％、0.0119％、0.0120％、0.0121％、0.0122％、0.0123％、0.0124％、0.0125％、0.0126％、0.0127％、0.0128％、0.0129％、0.0130％、0.0131％、0.0132％、0.0133％、0.0134％、0.0135％、0.0136％、0.0137％、0.0138％、0.0139％、0.0140％、0.0141％、0.0142％、0.0143％、0.0144％、0.0145％、0.0146％、0.0147％、0.0148％、0.0149％或0.0150％(重量/重量)MIT。在***的一些实施方案中，***包括所述组合物以及以下中的一种或多种：热循环仪、荧光检测器、计算机、用于控制所述热循环仪和/或所述荧光检测器的软件、显示器、移液器、样品容器、配置用于容纳主混合物的管、冰箱、存储单元、培养箱和/或冰箱。
技术可用于生产用于商业规模制造用于核酸扩增的试剂(例如，PCR(例如RT-PCR))的主混合物，并且可用于由最终用户(例如研究人员、临床医生等)进行核酸扩增。
在一些实施方案中，技术可用于PCR。可用于本文的实施方案的PCR的某些基本原理描述于例如美国专利第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；和第4,965,188号中，其各自以引用的方式整体并入。碱性PCR用于扩增靶目标DNA样品以用于分析或其他用途。PCR使用多个变性、使引物对与相反链退火和引物延伸的循环，以通过指数方式增加靶核酸序列的拷贝数。碱性PCR反应涉及复制靶DNA的链，然后在随后的循环中使用所述拷贝来产生另外的拷贝。将双链靶DNA的温度升高到“变性温度”(例如，85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、97℃、98℃、99℃或它们之间的范围(例如，92℃至97℃))以使DNA变性，然后将温度降低到“退火温度”(例如，48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、72℃、74℃或它们之间的范围(例如，62℃至72℃))以使至少一个引物与变性的靶DNA的每条链退火。在一些实施方案中，引物作为一对使用-正向引物和反向引物-并且可称为引物对或引物组。在一些实施方案中，引物组包含能够与变性靶DNA的一条链的5′末端杂交的5′上游引物和能够与变性靶DNA的另一条链的3′末端杂交的3′下游引物。一旦给定的引物与变性靶DNA的链结合，引物就通过聚合酶的作用延伸(例如，在退火温度或不同的“延伸温度”(例如，65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃或它们之间的范围)下)。在一些实施方案中，聚合酶为热稳定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶(或其合适的变体(例如，AMPLITAQ GOLD、CRIMSON TAQ、DEEP VENTR等))。然后延伸产物(有时也称为扩增子)从所得的链变性，并重复所述过程。在一些实施方案中，本文提供的装置和方法可用于通过PCR反应的各个温度步骤使含有核酸的样品循环。在一些实施方案中，PCR是本领域已知的逆转录酶聚合酶链式反应(“RT-PCR”)；参见例如，Bustin(2000)“Absolute quantification of mRNA usingreal-time reverse transcription polymerase chain reaction assays”Journal ofMolecular Endocrinology 25：169-93，其以引用的方式并入本文。
尽管本文的公开是指某些例示的实施方案，但是应当理解，这些实施方案是通过实例而非限制的方式呈现的。
实施例
实施例1
在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行了实验，其中包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的主混合物用于制备不含模板的RT-PCR反应混合物(每种条件2次重复)。反应混合物中的引物和探针靶向HIV-1核酸。将荧光DNA***染料EVA Green包括在每个反应中，以监测非特异性扩增产物的积聚。来自包含0％、0.15％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950的RT-PCR反应的实时EVA Green荧光信号在图1中示出。与不包含MIT的反应相比，包含MIT(通过添加PROCLIN 950)的主混合物表现出非特异性产物形成的水平降低(如延迟的EVA Green信号所证明)。
实施例2
在本文提供的技术的实施例的开发期间，进行实验以模拟通过商业制造过程制备批量RT-PCR试剂。特别地，将包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的原型HIV-1测定主混合物在2℃至8℃下孵育16小时。然后在不存在HIV-1靶RNA的情况下用每种主混合物进行RT-PCR(每种条件2次重复)。将荧光DNA***染料EVA Green包括在每个反应中，以监测非特异性扩增产物的积聚。来自包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950的RT-PCR反应的实时EVA Green荧光信号在图2中示出。与不包含MIT的反应相比，包含MIT的主混合物表现出非特异性产物形成的水平降低(如延迟的EVAGreen信号所证明)。数据还表明，与实施例1中描述的实验相比，此实验中在含有MIT和不含MIT的情况下反应的Ct值差异更显著。因此，数据表明MIT和/或PROCLIN 950为主混合物提供改进的稳定性。
实施例3
在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以在原型HIV-1测定主混合物中存在MIT的情况下测试RT-PCR。通过RT-PCR测试包含50个HIV-1靶RNA拷贝并且包含0.015％(重量/重量)PROCLIN 950(0.0015％(重量/重量)MIT)或不包含PROCLIN 950的原型HIV-1测定主混合物(每种条件8次重复)。来自包含0％或0.015％(重量/重量)PROCLIN950的HIV-1RT-PCR反应的HIV特异性实时荧光信号在图3中示出。数据表明，与不含PROLCIN的反应相比，包含PROCLIN 950的RT-PCR表现出增加的信号。
实施例4
在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以在原型CT/NG测定主混合物中存在MIT的情况下测试RT-PCR。通过RT-PCR测试包含0.1个沙眼衣原体包涵体形成单位并且包含0.015％(重量/重量)PROCLIN 950(0.0015％(重量/重量)MIT)或不包含PROCLIN950的原型CT/NG测定主混合物(每种条件8次重复)。来自包含0％或0.015％(重量/重量)PROCLIN 950(0.0015％(重量/重量)MIT)的CT/NG RT-PCR反应的CT特异性实时荧光信号在图4中示出。数据表明，与不含PROCLIN 950的反应相比，包含PROCLIN 950的反应表现出改善的信号。此外，与实施例3中描述的原型HIV-1测定相比，原型CT/NG测定使用不同的引物组和探针组。因此，数据表明MIT的PCR增强功能不限于特定的引物/探针序列。
实施例5
在开发本文提供的技术的实施方案期间，进行实验以模拟产生用于HI V-I测定的批量PCR试剂。特别地，将包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950(分别对应于0％、0.0015％、0.005％和0.01％(重量/重量)MIT浓度)的主混合物在2℃至8℃下孵育16小时。然后使用50个HIV-1RNA拷贝用每种主混合物进行RT-PCR(每种条件8次重复)。来自包含0％、0.015％、0.05％和0.1％(重量/重量)PROCLIN 950的HIV-1RT-PCR反应的HIV特异性实时荧光信号在图5中示出。数据表明，与不含PROCLIN 950的反应相比，包含PROCLIN950的主混合物表现出改进的稳定性(如RT-PCR曲线的增强的信号所证明)。
上述说明书中提及的所有出版物和专利出于所有目的以引用的方式整体并入本文。在不偏离所述技术的范围和精神的情况下，所述技术的所描述组合物、方法和用途的各种修改和更改对于本领域技术人员而言将是明显的。尽管已结合具体示例性实施方案对技术进行了描述，但是应当理解所要求保护的本发明不应当不适当地限定于此类具体实施方案。实际上，用于进行本发明的所述方式的各种修改对于本领域技术人员而言是明显的，并且旨在包含在以下权利要求书的范围内。

Claims (35)

1.一种核酸扩增组合物，其包含聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)。
2.如权利要求1所述的核酸扩增组合物，其包含0.001％至0.01％(重量/重量)MIT。
3.如权利要求1所述的核酸扩增组合物，其还包含靶模板。
4.如权利要求1所述的核酸扩增组合物，其还包含可检测标记的探针或***染料。
5.如权利要求1所述的核酸扩增组合物，其中所述组合物不包含引物二聚体，所述引物二聚体包含所述第一引物和所述第二引物。
6.一种寡核苷酸试剂，其包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸试剂，其还包含第二可检测标记的探针。
8.如权利要求6所述的寡核苷酸试剂，其还包含参考染料。
9.如权利要求6所述的寡核苷酸试剂，其还包含第三引物和第四引物。
10.一种试剂盒，其包含：
a)寡核苷酸试剂，其包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT；以及
b)活化试剂，其包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其还包含在缓冲溶液中的热稳定聚合酶。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述热稳定聚合酶为rTth聚合酶。
13.如权利要求10所述的试剂盒，其还包含内部对照，所述内部对照包含对照核酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
14.一种商业规模的主混合物组合物，所述组合物的体积大于1升，并且包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
15.一种商业规模的主混合物组合物，所述组合物的体积大于1升，并且包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
16.一种检测实时PCR组合物中的核酸的方法，所述方法包括提供包含聚合酶、第一引物、第二引物、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT的反应组合物。
17.如权利要求16所述的方法，其还包括向所述反应组合物中加入样品。
18.如权利要求16所述的方法，其还包括提供可检测标记的探针或***染料。
19.如权利要求16所述的方法，其还包括热循环所述反应组合物。
20.如权利要求16所述的方法，其还包括测量所述反应组合物的荧光发射。
21.如权利要求16所述的方法，其还包括将包含所述0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT以及所述聚合酶、所述第一引物、所述第二引物和/或所述核苷酸中的至少一种的实时PCR试剂储存至少1天。
22.如权利要求21所述的方法，其包括将所述实时PCR试剂储存至少1周。
23.如权利要求21所述的方法，其包括将所述实时PCR试剂储存至少1个月。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述实时PCR试剂用于制备所述反应组合物。
25.一种生产实时PCR试剂的方法，其包括将0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT与聚合酶、第一引物、第二引物和/或核苷酸中的至少一种混合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述实时PCR试剂的体积大于1升。
27.如权利要求25所述的方法，其还包括将所述实时PCR试剂储存至少1天。
28.如权利要求25所述的方法，其还包括将所述实时PCR试剂储存至少1周。
29.如权利要求25所述的方法，其还包括将所述实时PCR试剂储存至少1个月。
30.如权利要求25所述的方法，其还包括将参考染料、可检测标记的探针、***染料、第三引物和/或第四引物混合到所述实时PCR试剂中。
31.一种用于检测核酸的***，所述***包含：
a)寡核苷酸试剂，其包含第一引物、第二引物、可检测标记的探针、核苷酸和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT；以及
b)活化试剂，其包含氯化锰和0.0001％至0.1％(重量/重量)MIT。
32.如权利要求31所述的***，其还包含实时热循环仪。
33.如权利要求31所述的***，其还包含被配置来确定Ct值的计算机。
34.如权利要求31所述的***，其还包含在缓冲溶液中的热稳定聚合酶。
35.如权利要求34所述的***，其中所述热稳定聚合酶为rTth聚合酶。
CN201980092708.5A 2018-12-31 2019-12-20 改进的核酸扩增 Pending CN113490749A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862786860P 2018-12-31 2018-12-31
US62/786860 2018-12-31
PCT/US2019/067749 WO2020142255A1 (en) 2018-12-31 2019-12-20 Improved amplification of nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113490749A true CN113490749A (zh) 2021-10-08

Family

ID=71123859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980092708.5A Pending CN113490749A (zh) 2018-12-31 2019-12-20 改进的核酸扩增

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11274086B2 (zh)
EP (1) EP3906314A4 (zh)
JP (1) JP2022516731A (zh)
CN (1) CN113490749A (zh)
BR (1) BR112021013020A2 (zh)
CA (1) CA3125435A1 (zh)
WO (1) WO2020142255A1 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130252232A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-26 Abbott Molecular Inc. Hepatitis b virus typing and resistance assay
US20130323727A1 (en) * 2012-05-29 2013-12-05 Abbott Molecular Inc. METHOD OF DESIGNING PRIMERS, METHOD OF DETECTING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs), METHOD OF DISTINGUISHING SNPs, AND RELATED PRIMERS, DETECTABLE OLIGONUCLEOTIDES, AND KITS
CN108184327A (zh) * 2015-07-14 2018-06-19 雅培分子公司 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
CN108913758A (zh) * 2018-07-18 2018-11-30 贝南生物科技（厦门）有限公司 一种用于荧光pcr扩增试剂的冻干方法及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
WO1998023733A2 (en) 1996-11-27 1998-06-04 University Of Washington Thermostable polymerases having altered fidelity
US6329178B1 (en) 2000-01-14 2001-12-11 University Of Washington DNA polymerase mutant having one or more mutations in the active site
US20070048748A1 (en) 2004-09-24 2007-03-01 Li-Cor, Inc. Mutant polymerases for sequencing and genotyping
JP5178528B2 (ja) 2005-12-29 2013-04-10 アボット ポイント オブ ケア インコーポレイテッド 分子診断用増幅システムおよび方法
BR112017024191B1 (pt) 2015-05-11 2024-01-02 3M Innovative Properties Company Composição aquosa, método de amplificação de ácido nucleico e kit

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130252232A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-26 Abbott Molecular Inc. Hepatitis b virus typing and resistance assay
US20130323727A1 (en) * 2012-05-29 2013-12-05 Abbott Molecular Inc. METHOD OF DESIGNING PRIMERS, METHOD OF DETECTING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs), METHOD OF DISTINGUISHING SNPs, AND RELATED PRIMERS, DETECTABLE OLIGONUCLEOTIDES, AND KITS
CN108184327A (zh) * 2015-07-14 2018-06-19 雅培分子公司 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
CN108913758A (zh) * 2018-07-18 2018-11-30 贝南生物科技（厦门）有限公司 一种用于荧光pcr扩增试剂的冻干方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US11274086B2 (en) 2022-03-15
CA3125435A1 (en) 2020-07-09
US20200207729A1 (en) 2020-07-02
EP3906314A4 (en) 2022-11-23
EP3906314A1 (en) 2021-11-10
US20220169622A1 (en) 2022-06-02
JP2022516731A (ja) 2022-03-02
BR112021013020A2 (pt) 2021-09-14
WO2020142255A1 (en) 2020-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6480511B2 (ja) 試料中の核酸配列を定量するための組成物および方法
JP5680078B2 (ja) ライゲーションに基づく核酸の正規化した定量化方法
JP2015037427A (ja) アンカーオリゴヌクレオチドおよびアダプターオリゴヌクレオチドを用いる核酸の正規化した定量化方法
AU2017287852B2 (en) Improvements in or relating to Nucleic Acid amplification processes
JP3909010B2 (ja) 高度ダイナミックレンジを有する定量的多重ｐｃｒ
JP2014502496A5 (zh)
EP2118297B1 (en) Generation of nucleic acid molecules
JP6029636B2 (ja) Ｒｎａの検出方法
JP2015033390A (ja) Ｒｎａの正規化した定量化方法
US20110262918A1 (en) Improved nanoparticulate compositions of poorly soluble compounds
CN113490749A (zh) 改进的核酸扩增
JP7234598B2 (ja) 核酸増幅試薬および当該試薬を用いた核酸増幅制御方法
JP7226926B2 (ja) ｃＤＮＡの合成方法、標的ＲＮＡの検出方法及び試薬キット
EP2446061A1 (en) Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors
CN117043355A (zh) 用于新发传染病的即时需求诊断的保护性等温核酸扩增(pina)方法
EP4232602A1 (en) Detection of pathogens in wastewater
JPWO2020027096A1 (ja) プライマー及びその使用
JP2011087534A (ja) 夾雑物の影響を排除する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20211008

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication