JP7234598B2 - 核酸増幅試薬および当該試薬を用いた核酸増幅制御方法 - Google Patents
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Description
ピロリン酸分解酵素をさらに含む、前記増幅試薬。
(1)標的核酸を含む試料を、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素と、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、前記標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、ピロリン酸分解酵素とを含む反応液(ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その5’末端側に前記RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している)に添加する工程
(2)試料を添加した前記反応液を、ピロリン酸マグネシウムを含む開始剤に添加し、一定温度で核酸増幅反応させる工程
[7]以下の(1)から(5)の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
(1)標的核酸を含む試料を、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素と、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、前記標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとを含む反応液(ただし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その5’末端側に前記RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している)に添加する工程
(2)試料を添加した前記反応液を、ピロリン酸マグネシウムまたはピロリン酸分解酵素を含む開始剤に添加し、混合する工程
(3)前記で得られた混合溶液を微細孔空間に分配する工程
(4)前記(2)でピロリン酸マグネシウムを添加する場合は、前記微細孔空間にピロリン酸分解酵素を添加し、
前記(2)でピロリン酸分解酵素を添加する場合は、前記微細孔空間にピロリン酸マグネシウムを添加する工程
(5)一定温度で核酸増幅反応させる工程
[8]反応液に、5’末端側にRNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーに対して5’末端側の位置にある、標的核酸の一部と相補的(前記プライマーが第一のプライマーの場合)もしくは相同的(前記プライマーが第二のプライマーの場合)な配列を有する第三のプライマー、および/または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、[6]または[7]に記載の増幅方法。
本発明の増幅試薬は、NASBA法、TMA法、TRC法といった比較的低温(例えば、41℃から46℃)の一定温度で一本鎖RNAを増幅可能な方法で用いる酵素およびプライマーに加え、ピロリン酸(PPi)分解酵素をさらに加えることを特徴としている。本発明の増幅試薬が、標的RNAを増幅する試薬である場合の一態様として、以下の(A)から(J)の成分を含む試薬があげられる。なお以下の(A)および(B)のいずれか一方には、その5’末端側に以下の(G)のプロモータ配列を付加している。また一般的に使用される増幅反応に必要という理由以外の理由で、より好ましい別の成分を添加してもよい。
(A)標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチド(第一のプライマー)、
(B)標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド(第二のプライマー)、
(C)RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
(D)デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTPs)、
(E)RNaseH活性を有する酵素、
(F)DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
(G)DNA依存性RNAポリメラーゼ活性を有する酵素、
(H)リボヌクレオシド三リン酸(NTPs)、
(I)PPi分解酵素
(J)マグネシウム塩
本発明の増幅試薬で増幅される増幅核酸は、他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を(A)および(B)に含んでいる限り、任意に決定できる。
(a-1)標的核酸を含む試料を(A)から(I)の成分を含む反応液に添加する工程
(a-2)試料を添加した前記反応液に(J)の成分を含む開始剤を添加し、一定温度で核酸増幅反応させる工程
なお(a-2)の工程のうち(J)の成分を含む開始剤を添加する際の操作温度は、その後の核酸増幅反応を行なう際の温度(例えば41℃から46℃)と同じ温度としてもよく、当該反応温度よりも低い温度(例えば0℃前後の氷冷や25℃前後の室温)としてもよい。特に(I)の成分が耐熱性酵素(例えば、New England BioLabs社製Thermostable Inorganic Pyrophosphatase[M0296])の場合、後者の温度とすると、(I)および(J)の成分による標的核酸増幅反応の制御をより効率的に行なえる。
(K)鎖置換活性を有する酵素
(L)5’末端側にRNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマーに対して5’末端側の位置にある、標的核酸の一部と相補的(前記プライマーが第一のプライマーの場合)または相同的(前記プライマーが第二のプライマーの場合)な配列を有する第三のプライマー
(M)(K)および(L)の成分
(K)の成分の一例として、Bsu DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ(Large Fragment)、96-7DNAポリメラーゼがあげられる。
本発明の増幅試薬を用いて、標的核酸をデジタル核酸増幅させる場合は、本発明の増幅試薬を微小区画化する必要がある。微小区画化する方法として、微細孔をもった特殊なプレートを用いて、その微細孔に反応液を分配する方法(微細孔分配方式)や、反応液を特別な乳化剤やマイクロ流路チップを用いて多数の微小の液滴(ドロップレット)に分割する方法(ドロップレット方式)があげられる。微小区画のサイズは、5nL以下であることが好ましく、より好ましくは2nL以下であり、さらに好ましくは1nL以下である。微細孔分配方式で微小区画化する装置として、Thermo Fisher Scientific社製QuantStudio 3DデジタルPCRシステム、JN Medsys社製Clarity digital PCRシステムが市販されている。また、ドロップレット方式で微小区画化する装置として、Bio-Rad社製QX200TM Droplet Digital PCRシステム、RainDance Technologies社製RainDrop Plus Digital PCRシステムが市販されている。
<2>で微小区画化した試薬を用いてデジタル核酸増幅を行なう際に、2液を混合して増幅反応を開始してもよい。例えば、マイクロ流路チップを用いて、Y字路により分散相の2液並行流を形成した直後に、連続相のシースフローによる流体抵抗力で液滴を生成(微小区画化)させる方法がある、またSlipChipを用いて、互いに対向する2つの表面(複数の第一の微小区画領域を有する第一の表面および複数の第二の微小区画領域を有する第二の表面)をスリップさせて、前記複数の第一の微小区画領域と、前記複数の第二の微小区画領域とを、1:1で連結することで、各微小領域内の液を混合することができる。
る工程
(b-2)試料を添加した前記反応液に前記(J)の成分を含む開始剤を添加する工程
(b-3)前記開始剤を添加した溶液を微細孔空間に分配する工程
(b-4)前記微細孔空間に前記(I)の成分を添加し、一定温度で核酸増幅反応させる工程
(c-1)標的核酸を含む試料を、前記(A)から(H)の成分を含む反応液に添加する工程
(c-2)試料を添加した前記反応液に前記(I)の成分を含む開始剤を添加する工程
(c-3)前記開始剤を添加した溶液を微細孔空間に分配する工程
(c-4)前記微細孔空間に前記(J)の成分を添加し、一定温度で核酸増幅反応させる工程
なお(b-4)の工程における前記(I)の成分の追加は、例えば、前記(I)の成分を含む溶液をあらかじめ微細孔空間に添加した後、(b-3)の工程で分配された溶液と接触させることで行なえばよい。また前記(I)の成分をあらかじめ微細孔空間の壁面に塗布または固定化させた後、(b-3)の工程で分配された溶液と接触させることで行なってもよい。また(c-4)の工程における前記(J)の成分の追加は、例えば、前記(J)の成分を含む溶液をあらかじめ微細孔空間に添加した後、(c-3)の工程で分配された溶液と接触させることで行なえばよい。また前記(J)の成分をあらかじめ微細孔空間の壁面に塗布または固定化させた後、(c-3)の工程で分配された溶液と接触させることで行なってもよい。前記固定化の方法は、前記(I)の成分または前記(J)の成分が活性を有する限り、その方法に限定はなく、物理的な固定化でもよく、化学的な固定化でもよく、抗原抗体反応やビオチン-アビジン(ストレプトアビジン)を利用した固定化といった生物学的な固定化でもよい。
本発明の増幅試薬で増幅した標的核酸は、あらかじめまたは増幅反応後に検出用成分を添加し、当該成分由来の蛍光や化学発光強度を測定することで、標的核酸を検出すればよい。検出用成分の好ましい態様として、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブがあげられる。
一定温度で一本鎖RNAを増幅可能な系(NASBA法、TMA法、TRC法など)にピロリン酸(PPi)分解酵素をさらに添加することによる、RNA検出への影響を評価した。
66mM Tris-HCl緩衝液(pH8.36)
各0.33mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP
各2.0mM ATP、CTP、GTP、TTP
3.3mM ITP
96.3mM トレハロース
50nM INAFプローブ(標準RNAの相同鎖の一部[配列番号1の107番目から123番目まで]:配列番号2)
3.0μM 第一のプライマー(配列番号3)
3.0μM 第二のプライマー(標準RNAの相同鎖の一部[配列番号1の1番目から16番目まで]:配列番号4)
12.8U AMV逆転写酵素(ライフサイエンス社製)
166U T7 RNAポリメラーゼ
PPi分解酵素(0.2U 酵母(Yeast)由来PPi分解酵素[M2403]、0.2U 大腸菌(E.coli)由来PPi分解酵素[M0361]、4U耐熱性PPi分解酵素[M0296]のいずれか)(New England BioLabs社製)
(3)上記の反応液を46℃で3分間保温後、あらかじめ以下の組成からなる開始剤8μLを分注した、0.5mL容量PCRチューブ(Individual Dome Cap PCR Tube、SSI社製)に12μL添加した。
18.4mM 塩化マグネシウム
90.0mM 塩化カリウム
0.1%(w/v) Tween 20
9.0%(v/v) DMSO
注射用水または5mM PPi
(4)引き続きPCRチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、46℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度(励起波長470nm、蛍光波長520nm)を経時的に30分間測定した。
実施例1(2)に記載の反応液組成中、PPi分解酵素を除いた他は、実施例1と同様に標準RNAの増幅を試みた。
PPi分解酵素の添加の有無による効果をより明確にするため、PPi分解酵素として、実施例1で用いた分解酵素の中から、低温で反応が進みづらく、かつ46℃での耐性が高い耐熱性PPi分解酵素[M0296](New England BioLabs社製)を選択し、PPi分解酵素の添加によるRNA検出への影響を評価した。
18.4mM 塩化マグネシウム
90.0mM 塩化カリウム
0.1%(w/v) Tween 20
9.0%(v/v) DMSO
2mM、5mM、7mM、10mMもしくは15mM PPiまたは注射用水
(3)引き続きPCRチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、46℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度(励起波長470nm、蛍光波長520nm)を経時的に30分間測定した。
実施例1(2)に記載の反応液組成中、PPi分解酵素を除いた他は、実施例2と同様に標準RNAの増幅を試みた。
Claims (8)
- RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、DNA依存性DNAポリメラーゼ
活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼH(RNase H)活性を有する酵素と、RN
Aポリメラーゼ活性を有する酵素と、標的核酸の一部と相補的な配列を有する第一のプラ
イマーと、標的核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、ピロリン酸マグネシウム
と、を含む前記標的核酸の増幅試薬であって、
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その5’末端側に前記RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加しており、
ピロリン酸分解酵素をさらに含む、前記増幅試薬。 - RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、DNA依存性DNAポリメラーゼ活
性を有する酵素およびRNase H活性を有する酵素が、AMV逆転写酵素である、請
求項1に記載の増幅試薬。 - 5’末端側にRNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したプライマ
ーに対して5’末端側の位置にある、標的核酸の一部と相補的(前記プライマーが第一の
プライマーの場合)もしくは相同的(前記プライマーが第二のプライマーの場合)な配列
を有する第三のプライマー、および/または鎖置換活性を有する酵素をさらに含む、請求
項1または2に記載の増幅試薬。 - 請求項1から3のいずれかに記載の増幅試薬と、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖
を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブと、を含む
前記標的核酸の検出試薬。 - 以下の(1)及び(2)の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
(1)標的核酸を含む試料を、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、D
NA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼH(RNase
H)活性を有する酵素と、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、前記標的核酸の一部
と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記標的核酸の一部と相同的な配列を有す
る第二のプライマーと、ピロリン酸分解酵素とを含む反応液であって、前記第一のプライ
マーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方には、その5’末端側に前記RNAポリ
メラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加している反応液に添加する工程
(2)試料を添加した前記反応液を、ピロリン酸マグネシウムを含む開始剤に添加し、一
定温度で核酸増幅反応させる工程 - 以下の(1)から(5)の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
(1)標的核酸を含む試料を、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、D
NA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼH(RNase
H)活性を有する酵素と、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素と、前記標的核酸の一部
と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記標的核酸の一部と相同的な配列を有す
る第二のプライマーとを含む反応液であって、前記第一のプライマーおよび前記第二のプ
ライマーのいずれか一方には、その5’末端側に前記RNAポリメラーゼ活性を有する酵
素のプロモータ配列を付加している反応液に添加する工程
(2)試料を添加した前記反応液を、ピロリン酸マグネシウムまたはピロリン酸分解酵素
を含む開始剤に添加し、混合する工程
(3)前記で得られた混合溶液を微細孔空間に分配する工程
(4)前記(2)でピロリン酸マグネシウムを添加する場合は、前記微細孔空間にピロリ
ン酸分解酵素を添加し、
前記(2)でピロリン酸分解酵素を添加する場合は、前記微細孔空間にピロリン酸マグネ
シウムを添加する工程
(5)一定温度で核酸増幅反応させる工程 - 反応液に、5’末端側にRNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加し
たプライマーに対して5’末端側の位置にある、標的核酸の一部と相補的(前記プライマ
ーが第一のプライマーの場合)もしくは相同的(前記プライマーが第二のプライマーの場
合)な配列を有する第三のプライマー、および/または鎖置換活性を有する酵素をさらに
含む、請求項5または6に記載の増幅方法。 - 反応液に増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が
変化するオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、当該プローブを用いて、請求項5か
ら7のいずれかに記載の増幅方法で得られた標的核酸増幅産物を検出する、標的核酸の検
出方法。
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JP2019129818A JP2019129818A (ja) | 2019-08-08 |
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---|---|---|---|---|
JP2004524853A (ja) | 2001-04-30 | 2004-08-19 | イギリス国 | 増幅方法 |
JP2015513405A (ja) | 2012-03-09 | 2015-05-14 | バイオニア コーポレーション | ホットスタート逆転写反応又はホットスタート逆転写重合酵素連鎖反応用組成物 |
JP2015116136A (ja) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | 東ソー株式会社 | 核酸増幅方法および当該方法を利用した核酸増幅試薬 |
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2018
- 2018-11-21 JP JP2018217964A patent/JP7234598B2/ja active Active
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