CN108913758A - 一种用于荧光pcr扩增试剂的冻干方法及其应用 - Google Patents
一种用于荧光pcr扩增试剂的冻干方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法及其应用，荧光PCR扩增试剂包含荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP及冻干保护剂。将荧光PCR扩增试剂各组分混合均匀，‑35℃预冻3小时后，将冻干机气压降到10Pa以下‑35℃真空处理2小时、10℃真空处理2小时、30℃真空处理2小时，即可得到荧光PCR扩增试剂冻干粉末。本发明将荧光PCR需要用到的所有组分制备在同一冻干粉末中，能够实现常温运输及保存；使用时只需用冻干粉溶解液溶解该冻干粉，然后加入样本即可。具有使用方便、稳定可靠的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法及其应用。
背景技术
荧光定量PCR技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因检测方法，其反应的必要条件包括：荧光PCR反应缓冲***、引物、探针、Taq酶、dNTP。
其中，荧光PCR反应缓冲***组成成分通常为化学试剂、水，这一类试剂在储存过程中较为稳定；引物、探针、dNTP为通过化学方法合成的试剂，需要低温保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果；Taq酶为通过基因表达方法得到的一种活性蛋白，需要低温保存以保持其活性；若将酶、dNTP、引物探针混合在一起保存，在液体状态下引物探针会结合形成二聚体结构，从而影响扩增效果。
现阶段，荧光定量PCR类产品的组成方式通常为：1管反应缓冲液+1管酶的形式。其中，反应缓冲液包含荧光PCR反应缓冲***、引物、探针、dNTP；酶包含Taq酶、UNG酶。这种形式的产品使用方法复杂，必须先将反应缓冲液和酶按照比例混合均匀后，分装至PCR扩增管中，然后再加入样本。由于酶的用量通常较少（≤0.5μL）、酶液较粘稠，且配制过程繁琐，配制误差较大、反应重复性不好。而且试剂需要低温（-20℃以下）保存，产品储存及运输的成本较高。
所以，为了满足临床需求，亟需发明一种使用方便、且不需要低温保存及运输的荧光PCR扩增试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法及其应用，该方法能够实现荧光定量PCR所有组分混合在同一管中，产品无需低温保存及运输。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
(1)将荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、冻干保护剂按照配方进行混合；
所述的冻干保护剂，包含：5wt.%的甘油、100mg/mL的海藻糖、5mmol/L的DTT、1wt.%牛血清白蛋白、0.3wt.%Proclin 300、1wt.%甲酰胺。
配方如下：
（2）将上述混合液按照50μL/管分装到0.2mLPCR扩增管或者八联管中。
（3）将分装好的试剂放入冻干机中-35℃预冻3小时。
（4）将冻干机气压降到10Pa以下-35℃真空处理2小时。
（5）真空状态下将冻干机内部温度升至10℃真空处理2小时。
（6）真空状态下将冻干机内部温度升至30℃真空处理2小时。
分段式升温真空处理，相较于传统的固定温度冻干方法，能够显著加快冻干过程、提高样品的干燥度；在最后一段采用30℃干燥，使得样品高于环境温度，能够保证无法在冻干机内部压盖的样品，在冻干完成后取出来盖盖子的过程中不受环境湿度影响，延长冻干粉保存期，保证冻干的稳定性。
（7）冻干完毕后，盖上扩增管或者八联管盖。
（8）制备好的荧光PCR冻干粉试剂常温避光保存。
（9）使用时，用50μL/管的冻干粉溶解液进行溶解。
冻干粉溶解液中，TritonX-100为表面活性剂、蔗糖能够使干粉均匀溶解，二者配合使用能解决干粉溶解不完全以及溶解过程中酶活性降低的问题。
其配方如下：
冻干保护剂中Proclin 300是适用于体外诊断试剂的抑菌剂，且不影响Taq酶的活性，其与DTT共同作用，能够保证酶的稳定性；由于扩增缓冲液中含有盐离子，在冻干之后盐离子的浓度急剧升高，甘油、牛血清白蛋白二者结合能够保证酶在冻干后高盐条件下的活性；海藻糖作为赋形剂能保证干粉状态的形状，同时保持酶的活性结构；而在海藻糖中加入甲酰胺，在保持酶活性的同时能够避免引物二聚体的产生。
发明的优点：本发明的优势为1、减少使用操作步骤；2、提高试剂稳定性；3、实现常温保存及运输。
发明的有益效果：1、本发明适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理；2、减少操作步骤、提高试剂稳定性，保证临床荧光PCR检测结果的可靠性；3、实现常温保存及运输，减少企业生产成本及客户使用成本。
附图说明
图1，冻干后的试剂状态。
图2，干粉试剂结果图。
图3，液体试剂结果图。
图4，50℃加速第一天扩增曲线。
图5，50℃加速第二天扩增曲线。
图6，50℃加速第三天扩增曲线。
图7，50℃加速第四天扩增曲线。
图8，50℃加速第五天扩增曲线。
图9，50℃加速第六天扩增曲线。
图10，50℃加速第七天扩增曲线。
图11，50℃加速第八天扩增曲线。
图12，50℃加速第九天扩增曲线。
图13，50℃加速第十天扩增曲线。
具体实施方式
实施例1：肺炎支原体核酸检测试剂（荧光PCR法）的制备及冻干
肺炎支原体（M.Pneumonia）是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬时节。
现阶段肺炎支原体的荧光PCR检测产品还是采用常规的1管液体反应缓冲液+1管液体酶的形式，使用操作步骤较为繁琐，而保存及运输都要在低温下进行，保存及运输成本较高。本发明包含的荧光PCR试剂冻干方法，能够很好的解决以上问题，
为了验证冻干工艺的有效性，采用以下方法进行肺炎支原体核酸检测试剂（荧光PCR法）的配制和冻干：
（1）引物探针设计
按照引物探针设计原则，设计肺炎支原体核酸检测用引物探针，序列如下：
（2）按照如下配方配制肺炎支原体荧光PCR试剂
（3）将上述试剂混匀后，按照50μL/孔分装至八联管中。
（4）将分装好的八联管放入冻干机中，-35℃预冻3小时。
（5）将冻干机气压降到10Pa以下-35℃真空处理2小时。
（6）真空状态下将冻干机内部温度升至10℃真空处理2小时。
（7）真空状态下将冻干机内部温度升至30℃真空处理2小时。
（8）冻干完毕后，盖上扩增管或者八联管盖。
（9）制备好的荧光PCR冻干粉试剂常温避光保存。
（10）采用3例临床样本以及1例阳性对照对冻干试剂进行验证，同时做一组液体试剂作为对照试剂。
反应条件为 ：95℃预变性10min； 95℃15s，58℃40s（采集荧光），40个循环。
结果分析：
检测结果如下表，对扩增Ct值进行分析：
冻干试剂结果与液体试剂扩增Ct值无明显差异，冻干过程不会影响试剂性能。
实施例二：冻干试剂稳定性验证
冻干试剂相较于液体试剂，最大的特点是能够实现常温储存及运输。为了验证本发明中涉及到的冻干工艺的稳定性，设计以下实验：
（1）引物探针设计
按照引物探针设计原则，设计肺炎支原体核酸检测用引物探针，序列如下：
（2）按照如下配方配制肺炎支原体荧光PCR试剂
（3）将上述试剂混匀后，按照50μL/孔分装至八联管中。
（4）将分装好的八联管放入冻干机中，-35℃预冻3小时。
（5）将冻干机气压降到10Pa以下-35℃真空处理2小时。
（6）真空状态下将冻干机内部温度升至10℃真空处理2小时。
（7）真空状态下将冻干机内部温度升至30℃真空处理2小时。
（8）冻干完毕后，盖上扩增管或者八联管盖。
（9）制备好的荧光PCR冻干粉试剂常温避光保存。
（10）采用3例临床样本以及1例阳性对照对冻干试剂进行验证。
反应条件为 ：95℃预变性10min； 95℃15s，58℃40s（采集荧光），40个循环。
（11）采用加速破坏性实验方法来对冻干后的试剂稳定性进行验证，加速温度为50℃，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天对试剂性能进行测试。
结果分析：检测结果如下表，对扩增Ct值进行分析：
实验结果表明，在50℃加速破坏性实验中，第1天至第10天样本扩增Ct值无明显差异，且扩增曲线无变化。说明按照本发明方法对荧光PCR扩增试剂进行冻干处理，稳定性较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 贝南生物科技（厦门）有限公司
<120> 一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaaacaggg atttgggttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accattagga agcgcatgtc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caatcaccgg tgctatcctt 20
Claims (5)
1.一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于：将荧光PCR扩增液体试剂经过预冻，在真空状态下进行升华，从而制备成冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于：所述荧光PCR扩增试剂包含荧光PCR扩增缓冲液、引物、探针、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、冻干保护剂。
3.根据权利要求2所述的一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法，其特征在于：所述的冻干保护剂，包含：5wt.%的甘油、100mg/mL的海藻糖、5mmol/L的DTT、1wt.%牛血清白蛋白、0.3wt.%Proclin 300、1wt.%甲酰胺。
4.如权利要求1所述的一种用于荧光PCR扩增试剂的冻干方法在实时荧光PCR反应中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：使用时只需用冻干粉溶解液溶解该冻干粉，然后加入样本；所述冻干粉溶解液，包含：0.5%TritonX-100、10mmol/L的Tris-HCl、20mmol/L NaCl、3%蔗糖。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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