CN113480634A - 一种兰瑞肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种兰瑞肽的制备方法。本发明首先采用适宜的保护氨基酸固相逐一合成兰瑞肽树脂，然裂解获得线性肽，利用特定的氧化剂对线性肽进行环化。该方法操作简单，不需要制备全保护肽，收率和收率高，杂质少，几乎不含氧化杂质及二聚体杂质，有效地解决了现有工艺氧化杂质风险大的问题，具有广泛的实用价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种兰瑞肽的制备方法。
背景技术
Lanreotide是一种已经上市的药物，主要用于治疗肢端肥大症以及对于手术和(或)放射疗法不应答的患者，或者不适合进行手术和(或)放射疗法治疗的患者。
Lanreotide肽序如下Nal-CY(d-W)KVCT-NH2，2-7Cys成环，分子量：1096.32，结构式如下：
Lanreotide含有一对二硫键，对于二硫键的合成，一般采用链上固相合成，即采用氧化剂碘直接在树脂上形成二硫键。或者将线性肽从树脂上裂解下来后，在液相中采用碘或双氧水形成二硫键。CN110330560A介绍了一种兰瑞肽的合成方法，其先采用固相方法合成兰瑞肽全保护肽，然后将全保护肽溶解于溶液中，采用碘氧化的方式形成二硫键，然后再脱除保护基团，获得兰瑞肽，产品存在0.4％以上的二聚体。
lanreotide的序列中有易被碘代的Tyr残基，所以采用碘在树脂上氧化和液相氧化存在Tyr氧化杂质的风险，同时，强氧化剂碘的使用使二聚体的可能性大大增加。采用双氧水氧化时，需将氧化液体系调至pH值为碱性，但此肽在碱性条件下溶解度差，在pH为7.2以上时，肽在溶液情况下析出，无法氧化。以上常规氧化方法不适于兰瑞肽的二硫键形成，二聚体杂质较多，纯度较低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种兰瑞肽的制备方法，使得该方法获得的兰瑞肽收率和纯度较高、杂质少。
本发明提供了N-氯代琥珀酰亚胺在制备兰瑞肽中的应用。
研究表明，本发明以N-氯代琥珀酰亚胺为氧化剂对线性兰瑞肽进行环化，能够明显提高兰瑞肽的纯度和收率，杂质少，几乎不含氧化杂质及二聚体杂质。
本发明提供一种兰瑞肽的制备方法。包括：
按照兰瑞肽的氨基酸序列，在固相载体上从C端到N端逐一偶联保护氨基酸，获得肽树脂；
取所述肽树脂裂解，获得线性肽；
将所述线性肽环化，获得兰瑞肽；
所述环化采用的氧化剂为N-氯代琥珀酰亚胺。
本发明中，所述树脂为氨基树脂。一些实施方案中氨基树脂包括Rink AmideResin、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin，包括但不限于此。
本发明中，所述氨基树脂的氨基酸的替代度为0.3～0.6mmol/g，具体可为0.3mmol/g、0.5mmol/g或0.6mmol/g。
本发明中，逐一偶联的保护氨基酸包括Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Nal-OH。偶联过程通过茚三酮检测来确定是否偶联完全。
本发明中，所述裂解的裂解剂包括TFA、EDT和苯甲硫醚和苯甲醚。一些实施方案中，所述TFA、EDT和苯甲硫醚和苯甲醚的体积比为(80-90)：(2-4)：(4-6)：(1-3)，在一些具体实施例中具体为90:3:5:2。
本发明中，所述线性肽在环化前还包括将所述线性肽加水溶解获得线性肽溶液的步骤，所述线性肽溶液的浓度为3-5mg/ml。一些实施方案中，线性肽溶液的浓度具体可为3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml。
本发明中，所述氧化剂的浓度
所述氧化剂和线性肽的质量比为3～5:1。一些实施方案中，所述质量比具体可为3:1、4:1或5:1。
本发明中，所述纯化为HPLC纯化。
其中，所述HPLC纯化包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
本发明首先采用适宜的保护氨基酸固相逐一合成兰瑞肽树脂，然裂解获得线性肽，利用特定的氧化剂对线性肽进行环化，获得的兰瑞肽的纯度和收率均较高。本发明制备方法操作简单，不需要制备全保护肽，收率和收率高，杂质少，几乎不含氧化杂质及二聚体杂质，有效地解决了现有工艺氧化杂质风险大的问题，具有广泛的实用价值和应用前景。
附图说明
图1示实施例9兰瑞肽精肽的色谱图；
图2示对比例1兰瑞肽精肽的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种兰瑞肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，英文缩写及含义如下：
表1
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1替代度为0.60mmol Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide Resin树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 39.8克(100mmol)、HOBt16.2克(120mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mL(120mmol)DIC,活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide Resin树脂，检测替代度为0.62mmol/g。
实施例2替代度为0.50mmol Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 31.7克(70mmol)、HOBt 11.3克(84mmol)，用DMF溶解，0℃下加入14.2mL(84mmol)DIC,活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin树脂，检测替代度为0.50mmol/g。
实施例3替代度为0.30mmol Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide-AM Resin树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Rink Amide-AM Resin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 20.4克(45mmol)、HOBt 7.3克(54mmol)，用DMF溶解，0℃下加入9.1mL(54mmol)DIC，活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide-AM Resin树脂，检测替代度为0.31mmol/g。
实施例4 Nal-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Val-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin的制备
称取实施例2制备的替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Thr(tBu)-Rink Amide-MBHAResin树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取87.8g(150mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和24.3g(180mmol)HOBT用DMF溶解，冰水浴下加入28.1mL(180mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Nal-OH，得到肽树脂178.9g
实施例5 Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2线性粗肽的制备
将实施例4得到的肽树脂178.9克加入到3L三口瓶中，加入预先配置好预冷至0摄氏度以下的TFA:EDT:苯甲硫醚：苯甲醚＝90：5：3：2(V:V)1.79L，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入17.9L冰***中沉淀，离心，冰***洗涤5次，减压干燥得粗肽55.5克，重量收率101.6％。
实施例6 Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的制备
称取实施例5中Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2线性粗肽55.5g(50mmol)，用18.5L纯化水溶解，配置成3mg/ml的水溶液。量取12.1ml(150mmol)NCS加入反应液中，搅拌反应60min，HPLC检测无线性肽原料存在，得到Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2溶液。
实施例7 Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的制备
称取50mmol Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2线性粗肽，用纯化水溶解，配置成5mg/ml的水溶液。量取20.2ml(250mmol)NCS加入反应液中，搅拌反应60min，HPLC检测无线性肽原料存在，得到Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2溶液。
实施例8 Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2的制备
称取50mmol Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2线性粗肽，用纯化水溶解，配置成4mg/ml的水溶液。量取16.2ml(200mmol)NCS加入反应液中，搅拌反应60min，HPLC检测无线性肽原料存在，得到Nal-cyclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2溶液。
实施例9兰瑞肽精肽的制备
将实施例6得到反应液直接用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，纯化(纯化体系为：A相：0.1％TFA，B相：乙腈，梯度：B％＝21％-41％(60min))，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.9g，纯度大于99.5％，总收率61.9％，二聚体未检出，色谱图见图1。
实施例10兰瑞肽精肽的制备
将实施例7得到反应液直接用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，纯化(纯化体系为：A相：0.1％TFA，B相：乙腈，梯度：B％＝21％-41％(60min))，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.9g，纯度为99.6％，总收率为59.7％，二聚体未检出。
实施例11兰瑞肽精肽的制备
将实施例8得到反应液直接用高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，纯化(纯化体系为：A相：0.1％TFA，B相：乙腈，梯度：B％＝21％-41％(60min))，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.9g，纯度为99.8％，总收率为58.9％，二聚体未检出。
对比例1
按照实施例1～5的步骤制备Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2线性粗肽(50mmol)，将粗肽用水溶解，配置成0.1g/ml的水溶液。称取(50mmol)碘，溶解于甲醇中，配置成氧化液，然后将氧化液滴加入粗肽水溶液中，氧化反应2h，HPLC监控反应直至结束。反应结束后，加入抗坏血酸淬灭反应。将反应液按照实施例9的方法进行精制，获得兰瑞肽精肽，色谱图见图2，纯度98.98％，检出二聚体0.45％(保留时间为17.333的峰)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.N-氯代琥珀酰亚胺在制备兰瑞肽中的应用。
2.一种兰瑞肽的制备方法，其特征在于，包括：
按照兰瑞肽的氨基酸序列，在固相载体上从C端到N端逐一偶联保护氨基酸，获得肽树脂；
取所述肽树脂裂解，获得线性肽；
将所述线性肽环化，获得兰瑞肽；
所述环化采用的氧化剂为N-氯代琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂为氨基树脂，包括RinkAmide Resin、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氨基树脂的氨基酸的替代度为0.3～0.6mmol/g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述保护氨基酸包括Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Nal-OH。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解剂包括TFA、EDT和苯甲硫醚和苯甲醚。
7.根据取权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述裂解剂中，TFA，EDT和苯甲硫醚和苯甲醚的体积比为(80-90)：(2-4)：(4-6)：(1-3)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述线性肽在环化前还包括将所述线性肽加水溶解获得线性肽溶液的步骤，所述线性肽溶液的浓度为3-5mg/ml。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂和线性肽的质量比为3～5:1。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为HPLC纯化；所述HPLC纯化包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％TFA水溶液和乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
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