CN110607252B - 一株甲基杆菌、分离培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株甲基杆菌、分离培养方法及其应用，甲基杆菌(Methylobacterium sp.)WGM 16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019336。本技术方案的菌株通过分离烟草污水，使用甾醇母液进行富集，并且分别通过使用含有甾醇为碳源的烟草培养基和以甾醇为唯一碳源的种子培养基进行培养，并对特定颜色的菌落的分离所获得。利用该菌株能够有效降低烟草制品中甾醇含量，从而减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质的含量，实现烟草产品降焦减害的目的。

Description

一株甲基杆菌、分离培养方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌株技术领域，特别是涉及一种利用烟草污水培养分离的新微生物菌株及其应用。

背景技术

烟草中含有约0.3％的植物甾醇。研究表明约有20～25％的烟草植物甾醇完整的转移到烟气中，并通过热裂解产生危害。烟草中甾醇通过高温裂解后可产生致癌物质稠环芳烃，以苯并芘最为典型，这些有害物质可以进入到主流烟气中。进而被人体吸收的，从而对人体健康产生危害。因此，采用合适的生物方法将烟草中甾醇类化合物降解为小分子有机酸或最终降解为CO₂和水，可望改善烟草感官品质，也可减少烟草危害，具有重要的应用价值和研究意义。然而，从已有研究报道来看，关于烟草甾醇的分离、热裂解分析、危害性评价有一些的研究，但未见烟草中甾醇生物降解的研究。

基于烟草植物甾醇不但影响感官品质，还造成健康威胁，去除植物中的甾醇是很有必要的。微生物降解甾醇的路径为烟草植物甾醇的去除方案提供了思路。微生物具有专一性，与传统化学方法相比降解产物不会产生二次污染，同时不会对烟草中其他物质产生影响，因此具有更高的降解效率和专一性。但目前很少有关于微生物降解烟草中甾醇的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株甲基杆菌、分离培养方法及其应用，以解决烟草中的甾醇在高温裂解后产生致癌物质的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株甲基杆菌，所述甲基杆菌(Methylobacterium sp.)WGM 16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019336，保藏日期为2019 年5月8日。保藏地址为中国武汉。

所述甲基杆菌用于甾醇降解。

所述甾醇为胆甾醇、豆甾醇或谷甾醇中的一种或一种以上组合。

所述甲基杆菌用于含烟碱的甾醇培养基中的甾醇降解或烟草环境中甾醇的降解。

含烟碱的甾醇发酵培养基，其重量组成为烟碱2-4g，甘油10g，甾醇 4g/L，柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.05g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁0.5 g，硝酸铵32g，去离子水1L，琼脂30g。

所述烟草环境是指烟叶加工过程中、再造烟叶制备过程中或烟草污水处理过程中。

一种甲基杆菌的分离培养方法，包括以下步骤：

1)将烟草污水装入摇瓶中，加入灭菌后的甾醇母液，在37℃，200rpm 下进行富集5-7天，得到富集液；

2)将富集液涂布到含有甾醇为碳源的烟草培养基固体平板上，并于37℃的培养箱中培养3-5天后；

3)将步骤2)上的微生物菌落挑到甾醇为唯一碳源的种子培养基固定平板上，并于37℃的培养箱中培养3-5天后；

4)选取步骤3)中浅红色菌落分离获得甲基杆菌。

进一步的，所述烟草污水来源于薄片厂制备薄片后产生的，尚未经过任何生物或化学处理的第一级污水，其中，耐受烟碱浓度2-4g/L，还原糖浓度15-30 g/L。

进一步的，所述甾醇母液为胆甾醇、豆甾醇或谷甾醇之一溶于水中，加入 DMSO，超声助溶后灭菌，置于冰箱保藏。

本发明的有益效果是：

本技术方案的菌株通过分离烟草污水，使用甾醇母液进行富集，并且分别通过使用含有甾醇为碳源的烟草培养基和以甾醇为唯一碳源的种子培养基进行培养，并对特定颜色的菌落的分离所获得。利用该菌株能够有效降低烟草制品中甾醇含量，从而减少甾醇物质在燃烧过程中形成的有害物质的含量，实现烟草产品降焦减害的目的。

附图说明

图1：烟草平板培养基上的甲基杆菌生长情况；

图2：甲基杆菌的形态特征显微镜观察；

图3：甲基杆菌的分子进化树构建图；

图4A：空白组烟碱培养基中豆甾醇的气相图；

图4B：甲基杆菌在烟碱培养基中降解豆甾醇的气相图；

图5A：空白组烟草环境中豆甾醇的气相图；

图5B：甲基杆菌在烟草环境中的豆甾醇降解气相图。

具体实施方式

以下通过实施例来对本发明的技术方案进行详细的说明，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

在本申请的以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂均可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。

本申请要求保护的甲基杆菌(Methylobacterium sp.)WGM16，已于2019 年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019336。保藏地址为中国武汉。

甲基杆菌用于甾醇降解。

在本申请中，甾醇为胆甾醇、豆甾醇或谷甾醇中的一种或一种以上组合。

甲基杆菌用于含烟碱的甾醇培养基中的甾醇降解或烟草环境中甾醇的降解。

含烟碱的甾醇发酵培养基，其重量组成为烟碱2-4g，甘油10g，甾醇 4g/L，柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.05g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁0.5 g，硝酸铵32g，去离子水1L，琼脂30g。

烟草环境是指烟叶加工过程中、再造烟叶制备过程中或烟草污水处理过程中。在烟叶加工过程中，将含有上述甲基杆菌的溶液喷洒于烟叶中，在15℃ -30℃保持24小时至48小时，或再造烟叶制备过程中，对薄片使用烟草浸洗液进行处理过程中，加入上述的甲基杆菌，在15℃-30℃保持24小时至48小时，或在烟草污水处理中，加入甲基杆菌，均能对烟叶、再造烟叶薄片或烟草污水中的甾醇有较好的分解效果，以豆甾醇为例，甲基杆菌能够在烟碱浓度为 2-4g/L条件下将豆甾醇为二氧化碳和水，且豆甾醇的降解率达到60.27％。

在本申请的其它实施例中，如实施例2和实施例3，区别之处仅为将豆甾醇更换为胆甾醇或谷甾醇，其它方面没有变化，因此，不对实施例2和3进行详细的说明。

实施例1

1、培养基制备：

豆甾醇母液：豆甾醇25g加入1L水中，加入2ml的DMSO(二甲亚砜)，超声助溶后灭菌，置于4℃冰箱保藏。

烟草培养基固体平板：取20g的烟梗或烟叶，加入400ml的水在65℃下浸提1h，过滤去除固体后得到液体培养基，加入4g的琼脂，高压蒸汽121 ℃灭菌20min，冷却制备获得固体培养基平板。

以甾醇为唯一碳源的种子培养基固体平板：25g/L豆甾醇母液:160ml，柠檬酸:2g，柠檬酸铁铵:0.05g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁:0.5g，硝酸铵:32g，去离子水加至1L，琼脂30g。pH 7.5,高压蒸汽121℃灭菌 20min，冷却制得种子培养基。

种子培养基：葡萄糖:5.0g，甘油:20g，柠檬酸:2g，柠檬酸铁铵:0.05 g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁:0.5g，硝酸铵:32g，去离子水::1L，琼脂30g，pH 7.5,高压蒸汽121℃灭菌20min，冷却制得种子培养基。

2、甲基杆菌的分离和培养

首先，收集烟草污水250ml，将烟草污水分装到不同摇瓶中，加入灭菌后的甾醇母液10ml，在37℃，200rpm下进行富集5-7天，得到富集液。

其次，将富集液按照100ul的涂布量涂布到含有甾醇为碳源的烟草培养基固体平板上，并于37℃的培养箱中培养3-5天。

最后，将固体平板上的微生物菌落挑到含有甾醇为唯一碳源的种子培养基固体平板上，在37℃的培养箱中培养3-5天后，挑取浅红色菌落分离获得甲基杆菌后，将甲基杆菌菌落接种到液体种子培养基中，得到甲基杆菌的液体种子培养基。

3、甲基杆菌的鉴定

(1)显微观察

用无菌的接种针从甾醇为唯一碳源的种子培养基固体平板上挑取一环菌体，置于载玻片上的水体中，用显微镜观察，如图1所示，菌落为浅红色菌落。

(2)分子鉴定

提供菌株平板，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。

4、结果与分析

本发明筛选到的菌株为甲基杆菌，通过16S测序，序列长度为1480bp。其与甲基杆菌(Methylobacterium sp.)的同源性达99％，其培养特征及显微形态特征与甲基杆菌(Methylobacterium sp.)最相似，由上述结果分析得到如图3所示的甲基杆菌的分子进化树构建图。

该菌株已于2019年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019336，分类命名为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)。保藏地址为中国武汉。

甲基杆菌对甾醇的降解能力

在本申请的实验

1、相关溶液的配置

种子培养基：葡萄糖:5.0g，甘油:20g，柠檬酸:2g，柠檬酸铁铵:0.05 g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁:0.5g，硝酸铵:32g，去离子水::1L，琼脂30g，pH 7.5,高压蒸汽121℃灭菌20min，冷却制得种子培养基。

烟碱培养基：烟碱：2-4g，甘油:10g，豆甾醇母液160ml；柠檬酸:2g，柠檬酸铁铵:0.05g，磷酸氢二钾:0.5g，无水硫酸镁:0.5g，硝酸铵:32g，去离子水加至1L，琼脂30g。

6-酮胆甾烷醇的内标：取25ml的容量瓶，加入0.25g的6-酮胆甾烷醇，再用乙酸乙酯定容至25ml，制的10g/L的6-酮胆甾烷醇的内标。

烟草浸提液(模拟烟草废水)：取烟草原料(烟梗、烟末、烟草废弃物) 放入粉碎机中将其打碎，粉碎完毕后用筛网进行筛选，筛出40目以下的烟草原料放入容器中，并在其中加入温度为55℃的去离子水(烟草原料：水重量比＝1:12)，让烟草原料充分浸泡于水中并搅拌，使得浸提能够更加的充分。盖上保鲜薄膜放置在恒温干燥箱中以60℃恒温浸提1h，浸提后用200目的筛网过滤，去除固态烟草原料，得到所需浸提液。再向浸提液中添加豆甾醇母液，制的含有4g/L豆甾醇的烟草浸提液。

2、实验过程

(1)甲基杆菌在烟碱培养基中甾醇的降解能力

取1ml甲基杆菌的液体种子培养基，加到新的液体种子培养基，在37℃， 200rpm下进行活化培养3-5天。取活化后的种子培养基2ml接种到含有4g/L 豆甾醇的烟碱培养基中，瓶口用无菌透气封口膜封口，放置恒温振荡培养箱中 200r/min，37℃培养，每培养3d进行取样，在每个样品中加入等体积乙酸乙酯萃取2次，超声振荡20min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液，合并乙酸乙酯萃取液。取900ul合并萃取液，再加100ul6-酮胆甾烷醇的内标，过 0.22微米的有机相滤膜，打入液相小瓶中以备后期气相色谱分析使用。

(2)甲基杆菌在烟草环境中甾醇的降解能力

取1ml甲基杆菌的液体种子培养基，加到新的液体种子培养基，在37℃， 200rpm下进行活化培养3-5天。取活化后的种子培养基2ml接种到含有4g/L 豆甾醇的烟草浸提液中，瓶口用无菌透气封口膜封口，放置恒温振荡培养箱中 200r/min，37℃培养，每培养3d进行取样，在每个样品中加入等体积乙酸乙酯萃取2次，超声振荡20min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液，合并乙酸乙酯萃取液。取900ul合并萃取液，再加100ul 6-酮胆甾烷醇的内标，过0.22微米的有机相滤膜，打入液相小瓶中以备后期气相色谱分析使用。

3、结果分析

(1)前期准备

气相色谱条件：色谱柱：DB-5MS(30m*0.25mm*0.25μm)；进样方式：不分流；载气为：氦气；进气量：1μl。进样口温度为:280℃；检测器温度： 280℃。程序升温:初始温度50℃。以20℃/min升温至260℃，维持5min，再以2℃/min升至270℃，维持10min；再以2℃/min升至280℃，维持10min；再以2℃/min升至300℃，维持5min；运行时间：60.5min。

(2)甲基杆菌在烟碱培养基中甾醇的降解能力分析，如图4A和图4B所示。

表1菌株Methylobacterium sp.WGM16在烟碱培养基中甾醇测定结果。

注：空白组代表未添加菌株，实验组代表添加菌株

(3)甲基杆菌在烟草环境中甾醇的降解能力分析，如图5A和图5B所示。

表1菌株Methylobacterium sp.WGM16在烟草环境中甾醇测定结果。

注：空白组代表未添加菌株，实验组代表添加菌株

综上，甲基杆菌在在烟碱培养基中甾醇的降解率为60.27％，在在烟草环境中甾醇的降解率为64.33％，说明甲基杆菌可以在高烟碱环境中，和烟草环境中降低烟草中甾醇含量。

因此该菌株通过降解烟草制品中甾醇类化合物，可减少甾醇在燃烧过程中形成的有害物质，实现烟草产品减焦降害的目的。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。

Claims (5)

1.一株甲基杆菌，其特征在于，所述甲基杆菌(Methylobacterium sp.) WGM 16，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019336，保藏日期为2019年5月8日。

2.根据权利要求1所述的甲基杆菌，其特征在于，所述甲基杆菌用于含烟碱的甾醇培养基中的甾醇降解或烟草环境中甾醇的降解。

3.根据权利要求2所述的甲基杆菌，其特征在于，所述甾醇为胆甾醇、豆甾醇或谷甾醇中的一种或一种以上组合。

4.根据权利要求2所述的甲基杆菌，其特征在于，含烟碱的甾醇发酵培养基，其重量组成为烟碱2-4 g，甘油10 g，甾醇4g/L，柠檬酸2 g，柠檬酸铁铵0.05 g，磷酸氢二钾 0.5 g，无水硫酸镁 0.5 g，硝酸铵32 g，去离子水1L，琼脂30 g。

5.根据权利要求2所述的甲基杆菌，其特征在于，所述烟草环境是指烟叶加工过程中、再造烟叶制备过程中或烟草污水处理过程中。

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