CN113444179B

CN113444179B - 一种抗gpc3抗体和包含该抗体的药物组合物

Info

Publication number: CN113444179B
Application number: CN202010239509.7A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 马琳; 郭树华
Original assignee: Suzhou Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN113444179A

Abstract

本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及一种抗GPC3抗体和包括该抗体的药物组合物。所述抗GPC3抗体的轻链可变区和重链可变区分别含有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；或者分别含有与SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列至少有90％的一致性的序列。本发明提供的新型抗人GPC3抗体，通过增强抗体与FcγRIIIa(CD16A)的亲和力，增强了抗GPC3抗体的ADCC效应，进而大大提高该抗体对肿瘤尤其是肝细胞肿瘤的杀伤效果。

Description

一种抗GPC3抗体和包含该抗体的药物组合物

技术领域

本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及一种抗GPC3抗体和包括该抗体的药物组合物。

背景技术

合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)(SEQ ID NO 1)核心蛋白由相对分子质量为40KD的N-末端蛋白和30KD的膜结合的C-末端蛋白组成。C-末端通过糖基磷脂酰肌醇锚蛋白(glycosyl-phosphatidylinositol anchor，GPI)锚定在细胞表面，可结合肝素结合型蛋白，如生长因子，为细胞外基质成分，调控着细胞生长、增殖、分化、黏附和迁移等行为，还可能涉及到抑制或调节大部分中胚层组织和器官的生长。GPC3基因在不同的组织中表达差异很大，其在肝细胞癌组织中高表达，而在非肿瘤肝组织、肝细胞腺瘤、胆管癌、肝内胆管细胞癌、胆囊癌和肝脏转移性肿瘤中低表达甚至不表达。识别GPC3蛋白羧基端的单克隆抗体会产生抗体依赖性的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。US9790267B2、US20100248359A1、WO2004022739、US9409994B2、CN104140974B和CN109988240A等专利中明确了抗GPC3抗体或者结合GPC3的蛋白片段，这些抗体或者结合片段通过重组表达人源化的抗体或者嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-Cell,CAR-T)等形式用于癌症尤其是肝癌的治疗。以GPC3为靶点构建的CAR-T细胞是一种有效的细胞治疗手段，但是CAR-T细胞治疗技术有临床治疗的毒性问题。目前临床试验过程中，将CAR-T回输至患者体内后，常常发生一系列反应如发热、寒战、白细胞减少、肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴、移植物抗宿主反应等，重则可能直接导致患者的死亡。另外，CAR-T技术的价格也十分的昂贵。开发抗GPC3治疗性抗体是一种更安全有效的形式。经过检索，针对GPC3抗体的研究主要集中在国外，如已在中国公开的专利文献中，美国的米德列斯公司的专利CN200880103166.9公开了一种针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体。美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表)则分别从特异性和亲和力等不同角度开发出不同序列的单克隆抗体专利(CN201280029201.3对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途)、(CN201380039993.7磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的高亲和力单克隆抗体及其用途)。

但是截止申请日前，国内外均没有以抗GPC3治疗性抗体上市的药物。GC33为第一个进入临床研究的人源化抗体(Ishiguro T，etal.Anti-glypican 3antibody as apotential antitumor agent for human liver cancer.Cancer Res.2008；68(23)：9832-9838.)。GC33为对鼠源性母本抗体进行人源化改造后得到的抗体，GC33识别GPC3的羧基端(542-563)的多肽表位，主要通过抗体依赖的ADCC作用以及募集肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocyte,TIL)发挥抗肿瘤作用。但是，GC33抗体在二期临床研究中没有达到预设重点，临床研究失败。

GC33抗体采用了人IgG1的野生型Fc片段，该片段具有一定的ADCC和CDC效应，抗体在与肿瘤细胞表面的GPC3蛋白结合后，通过发挥抗体的ADCC和CDC效应对肿瘤进行杀伤。抗体Fc段主要与人Fc受体中的FcγRIIIa(CD16A)相互作用后发挥ADCC效应，但是野生型的IgG1抗体发挥ADCC作用强度是不够的，尤其是对于低亲和力受体(含有F158亚型)的患者，抗体的ADCC发挥抗肿瘤的效应会进一步的减弱。大约有80％-90％的患者携带Fc低亲和力受体突变。抗体的ADCC效应没有充分的发挥是导致GC33临床失败的一个很重要的原因。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种新型的抗GPC3抗体，该抗体通过进一步增强的ADCC效应杀伤细胞肿瘤。

本发明的另一个目的在于，提供含有所述抗GPC3抗体的药物组合物，该联合用药组合物将肿瘤细胞的特异性结合与阻断肿瘤的血管新生结合，实现更好的抗肿瘤活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种抗GPC3抗体，所述抗GPC3抗体为抗人GPC3抗体，其轻链可变区和重链可变区分别含有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；或者分别含有与SEQ ID NO 3、SEQID NO 4所示的氨基酸序列至少有90％的一致性的序列。

优选地，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％；以及更优选为100％一致性的序列。

优选地，所述抗人GPC3抗体的重链恒定区含有SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列有至少90％的一致性的序列。

所述抗人GPC3抗体，通过对野生型Fc的突变改造，进一步增强了抗体与FcγRIIIa(CD16A)的亲和力，增强了抗GPC3抗体的ADCC效应，进而大大提高该抗体对肿瘤尤其是肝细胞肿瘤的杀伤效果。

本发明还提供含有抗GPC3抗体的药物组合物，该组合物包括有效量的抗人GPC3抗体和至少一种VEGF/VEGFR抑制剂。

优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂是抗体或者融合蛋白；进一步优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂选自Bevacizumab、Ranibizumab、Brolucizumab、Olinvacimab、Gentuximab、Alacizumab pegol、Aflibercept或Conbercept。

优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂是小分子化合物；进一步优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂选自Apatinib、Axitinib、Linifanib、Sorafenib、Vandetanib、Cabozantinib、Regorafenib、Pazopanib、Sunitinib、Lenvatinib、Tivozanib、Brivanib、Nintedanib、Motesanib、Cediranib或Fruquintinib。

优选地，组合物中抗人GPC3抗体与VEGF/VEGFR抑制剂的药物含量比为：当组合物中VEGF/VEGFR抑制剂是抗体或者融合蛋白时，该组合物包含60-1200mg的抗人GPC3抗体和60-1200mg的VEGF/VEGFR抑制剂；当组合物中VEGF/VEGFR抑制剂是小分子时，该组合物中包含60-1200mg的抗人GPC3抗体和100-1000mg的VEGF/VEGFR抑制剂。

优选地，所述药物组合物为单一的复方制剂。

优选地，所述药物组合物为两种单独的制剂的组合。

优选地，所述两种单独的制剂依次施用。

优选地，所述两种单独的制剂同时施用。

所述药物组合物可以为单一的复方制剂形式，也可以为两种单独的制剂的组合；当为两种单独的制剂的组合时，其用药方式可以为同时施用，也可以为依次施用，

例如受试者在使用所述抗人GPC3抗体之前接受了至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个剂量的所述VEGF/VEGFR抑制剂。

也可以受试者在使用VEGF/VEGFR抑制剂之前接受了至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个剂量的所述人GPC3抗体。

优选地，所述抗人GPC3抗体是以0.1-15mg/kg的剂量施用；例如，所述抗人GPC3抗体是以0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mg/kg的剂量施用的。

优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂是抗体或者融合蛋白，其施用剂量为0.1-15mg/kg。例如，所述VEGF/VEGFR抑制剂是以0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mg/kg的剂量施用的。

优选地，所述VEGF/VEGFR抑制剂小分子化合物，其施用剂量为0.1-100mg/kg。

例如，所述VEGF/VEGFR小分子抑制剂是以0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100mg/kg的剂量施用的。

优选地，施用抗人GPC3抗体和VEGF/VEGFR抗体或者融合蛋白每一、二、三、四或五周一次，例如每周一次，或每两周一次，或每三周一次。

优选地，施用VEGF/VEGFR小分子抑制剂每天一次。

优选地，所述的癌是指肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、***癌、胰腺癌、淋巴瘤及其转移癌。

进一步优选为肝癌，所述肝癌是指经过肝切除手术、肝癌射频消融术、肝动脉介入治疗、肝移植、化疗、放疗-质子治疗或者免疫治疗后是复发或进展性的。

本发明所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

所述治疗可以是联合治疗或化学治疗。

与现有技术相比，本发明所取得的有益效果是：

(1)本发明提供的新型抗人GPC3抗体，通过增强抗体与FcγRIIIa(CD16A)的亲和力，增强了抗GPC3抗体的ADCC效应，进而大大提高该抗体对肿瘤尤其是肝细胞肿瘤的杀伤效果。

(2)本发明所涉及的抗癌的联合用药物组合物将肿瘤细胞的特异性结合与阻断肿瘤的血管新生结合起来，具有比单一药物更好的抗肿瘤活性，为癌症的治疗提供了新的策略和思路。

附图说明

图1为Bevacizumab的SEC-HPLC检测结果；

图2为Anti-GPC3抗体的SEC-HPLC检测结果；

图3为供试品在HepG2细胞系建立的CDX模型中的药效关系图；

图4为pTT5质粒载体图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

术语解释

本发明中，除非另行规定，结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。

与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应和纯化技术结合使用的示例性技术是本领域已知的。许多这样的技术和程序描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，以及其他许多地方。另外，用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗的示例性技术也是本领域已知的。

在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。在多个从属权利要求的情况下，仅仅在替代方案中使用“或”引用一个以上的前述独立或从属权利要求。同样，诸如“要素”或“组分”之类的术语涵盖了包括一个单元的要素和组分以及包括一个以上的亚单元的要素和组分，除非另外特别说明。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指明。

单位、前缀和符号均以它们的国际单位制(SI)公认的形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。在本文中提供的小标题不是本公开的不同方面的限制，可以通过整体上参考本说明书来获得这些方面。

除非另外指明，正如根据本公开所使用的，以下术语应理解为具有以下含义：

“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送***中的任何一种将包含治疗剂的组合物以物理方式引入到受试者中。抗GPC3和/或抗VEGF/VEGFR抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文中使用的短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、***内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下。非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径。还可以例如一次、多次、和/或经一个或多个延长的周期进行施用。

“抗体”是指至少包含重链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3并且至少包含轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中该分子能够与抗原结合。抗体这一术语包括但不限于能够结合抗原的片段，例如Fv，单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、和(Fab’)2。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种如小鼠、人、食蟹猴等的抗体。

在一些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含至少一条包含重链可变区和至少一部分重链恒定区的重链、以及至少一条包含轻链可变区和至少一部分轻链恒定区的轻链。在一些实施方案中，抗体包含两条重链和两条轻链，其中每条重链包含重链可变区和至少一部分重链恒定区，并且，其中每条轻链包含轻链可变区和至少一部分轻链恒定区。如本文中使用的，单链Fv(scFv)，或包括例如包含所有六个CDR(三个重链CDR和三个轻链CDR)的单个多肽链的任何其他抗体被认为具有一条重链和一条轻链。在一些这样的实施方案中，重链是包含三个重链CDR的抗体区域，并且轻链是包含三个轻链CDR的抗体区域。

“重链可变区”是指包含重链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3、和CDR3的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。在一些实施方案中，重链CDR1对应于Kabat残基26至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；而重链CDR3对应于Kabat残基95至102(Johnson,G.,Kabat,E.A.,&Wu,T.T.(1996).Kabat database ofsequences of proteins of immunological interest.In L.A.Herzenberg,W.M.Weir,&C.Blackwell(Eds.),Weir's Handbook of Experimental ImmunologyI.Immunochemistry and Molecular Immunology(pp.6.1-6.21).Cambridge,MA:Blackwell Science Inc..)。

“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CH1、CH2、和CH3的区域。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ、和α。非限制性示例性重链恒定区还包括ε和μ。每个重链恒定区对应于一种抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体为IgG抗体，包含δ恒定区的抗体为IgD抗体，包含α恒定区的抗体为IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体为IgM抗体，包含ε恒定区的抗体为IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为亚类。例如，IgG抗体包括但不限于，IgG1(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)、和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于，IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；IgM包括但不限于，IgM1和IgM2。在一些实施方案中，重链恒定区包含对抗体赋予期望特征的一个或多个突变(或取代)、添加或缺失。

“重链”(缩写为HC)是指具有或不具有前导序列的至少包含重链可变区的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文中使用的术语“全长重链”是指具有或不具有前导序列的包含重链可变区和重链恒定区的多肽。

“轻链可变区”是指包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3、和CDR3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。在一些实施方案中，轻链CDR1对应于Kabat残基24至34；轻链CDR2对应于Kabat残基50至56；而轻链CDR3对应于Kabat残基89至97(Johnson,G.,Kabat,E.A.,&Wu,T.T.(1996).Kabat database of sequences of proteins ofimmunological interest.In L.A.Herzenberg,W.M.Weir,&C.Blackwell(Eds.),Weir'sHandbook of Experimental Immunology I.Immunochemistry and MolecularImmunology(pp.6.1-6.21).Cambridge,MA:Blackwell Science Inc..)。

“轻链”(缩写为LC)是指具有或不具有前导序列的至少包含轻链可变区的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文中使用的术语“全长轻链”是指具有或不具有前导序列的包含轻链可变区和轻链恒定区的多肽。

“宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，比如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞分别包括但不限于，NSO细胞、以及293和CHO细胞及其衍生物，例如293-6E和DG44细胞。

“Fc结构域”或“Fc片段”是指免疫球蛋白重链的“可结晶片段”区。一般而言，Fc结构域能与另一Fc结构域相互作用而形成二聚体复合物。Fc结构域可结合细胞表面受体(Fc受体)和/或补体***的蛋白质，或者可被修饰而削弱或增强这种结合活性。Fc结构域可来源于IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体并产生免疫功能，例如调理作用、细胞裂解、肥大细胞脱颗粒等其他Fc受体依赖性进程。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选为人源性的免疫球蛋白，优选为IgG1和IgG2。在本发明中，Fc结构域优选由人IgG1的CH2和CH3构成。

在某些实施方式中，“Fc变体”是指由天然Fc修饰而仍可结合Fc受体的分子或序列。“Fc变体”包括由非人类天然Fc经人源化的分子或序列“Fc结构域”包括如上所述的天然Fc及Fc变体的分子或序列，其包含单体形式或多聚体形式的分子，可由完整抗体分解得到，或通过基因重组表达得到或通过其他手段得到。

“Fc受体(Fc Receptor，FcR)”是表达在特定免疫细胞表面，用于识别抗体Fc区域介导免疫应答的免疫球蛋白。抗体Fab区域识别侵染源抗原后，其抗体Fc区域与免疫细胞上的Fc受体结合，启动免疫细胞的应答功能，如吞噬及细胞毒杀伤等，对侵染源进行破坏清除。根据Fc受体识别抗体类型及表达细胞的不同，Fc受体主要分为FcγR、FcαR和FcεR三种类型，FcγR又可分为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcRn(NeonatalFcreceptor)四种亚型。FcγRIII(CD16)在不同细胞类型中具有高度同源的FcγRIIIa和FcγRIIIb两种亚型，其中FcγRIIIa对lgG抗体Fc区域具有中/低亲和力，参与细胞吞噬、炎症介导、抗体介导细胞杀伤和肥大细胞脱粒及清除等免疫应答过程。在FcγRIIIa人群中存在一个单核苷多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点引起的高亲和力(176Val/V158)和低亲和力(176Phe/F158)两个亚型。通过改造Fc区域的氨基酸序列或糖基化，可提高或降低抗体对Fc受体的亲和力，从而改善抗体功效及半衰期。

“ADCC”是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。NK细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞都能在特异性IgG的介导下通过ADCC方式杀伤肿瘤细胞。其中NK细胞具有广谱抗肿痛作用，它们除了通过ADCC方式杀伤溶解特异性IgG包被的肿瘤细胞外，还可以通过与肿瘤细胞密切接触，直接杀伤肿瘤细胞。ADCC效应可以通过对天然Fc区域的改造进行增强或者减弱(Wang X,Mathieu M,Brezski R J,et al.IgG Fcengineering to modulate antibody effector functions[J].Protein&Cell,2018,9(1):63-73.)。

CDC是指补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。

“血管生成抑制剂”是指通过阻断对肿瘤内新血管形成起到关键作用的促血管生成因子及其受体，进而达到抑制肿瘤生长、转移的作用。在发挥血管新生作用中，VEGF(SEQID NO 2)和VEGFR信号通路占据着主导地位。VEGF的靶向药物可以与特定的内皮细胞受体结合，对肿瘤细胞的生长产生抑制作用，从而达到治疗目的。抗血管生成剂包括结合并阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些物质。例如，抗血管生成剂是血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如VEGF-A抗体(例如Bevacizumab)或VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂如(甲磺酸伊马替尼)、阻断VEGF受体信号转导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、/SU11248(苹果酸舒尼替尼)、AMG706，或描述于例如国际专利申请WO 2004/113304中的那些小分子)。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管抑素、内皮抑素等。

“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。癌症的实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌症的更具体的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤、和各种类型的头颈部癌(包括头颈部鳞状细胞癌)。

“化学治疗/化疗”是用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括但不限于，烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔类抗生素例如，卡奇霉素；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐类，如氯屈膦酸盐；阿克拉霉素类、放线菌素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、6-氮杂尿苷、阿糖胞苷、依诺他滨、氟尿苷；雄性激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；阿莫司汀；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋鞍；埃坡霉素；依托格鲁；香菇多糖；氯尼达明；美登素生物碱类如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；长春新碱；长春瑞滨；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；卡培他滨；降低细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼)和VEGF-A的抑制剂，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

“治疗”是指治疗性治疗和预防用药性或预防性措施，其目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理状况或病症。在某些实施方案中，术语“治疗”涵盖在哺乳动物(包括人)中疾病治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制或减缓疾病或疾病进展；部分或完全应答疾病，例如通过引起消退、或恢复或修复丧失的、失去的或有缺陷的功能；刺激无效过程；或使疾病平稳到降低的严重程度。术语“治疗”还包括降低任何表型特征的严重性和/或降低该特征的发生率、程度或可能性。需要治疗者包括已经患有失调者以及具有患该失调的倾向者、或其中有待预防该失调者。

“联合治疗”是指可以单独地或与其他治疗方式一起施用的药物治疗用途。可以在其他治疗方式之前、基本上同时或之后提供这些抗体，所述其他治疗方式例如手术、化学治疗、放射治疗或生物制剂(例如另一种治疗性抗体)的施用。在一些实施方案中，在选自手术、化学治疗、放射治疗或其组合的治疗之后，癌症已经复发或进展。为了治疗癌症，如本文中讨论的，抗体可以与一种或多种另外的抗癌剂例如化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂和/或抗肿瘤组合物一起施用。可以与本发明的抗体联合使用的化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、抗癌剂和抗肿瘤组合物的非限制性实例提供在本文中的“定义”下。

实施例1抗GPC3抗体和抗VEGF抗体的分子构建

将表1中抗体的轻重链氨基酸序列按照人宿主细胞进行密码子优化并常规合成基因，添加5'(EcoRI)和5'UTR([SEQ ID NO 11])以及3'UTR([TGATGA])和3'(HindIII)，将基因通过5'EcoRI和3'HindIII克隆至载体pTT5(载体图谱如图4所示)，pTT5载体序列如SEQID NO 12。挑选克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行保种并进行菌体的扩大培养，扩大的菌体用于质粒的提取。

表1抗GPC3抗体和抗VEGF抗体的序列组合

抗体	轻链序列	重链序列
			Anti-GPC3	SEQ ID NO 6	SEQ ID NO 7
Bevacizumab	SEQ ID NO 8	SEQ ID NO 9
			Anti-GPC3(WT)	SEQ ID NO 6	SEQ ID NO 10

实施例二抗GPC3抗体和抗VEGF抗体的表达及纯化

按照如下的方式对提取后的质粒进行HEK293细胞转染和蛋白的分离纯化

1、测定细胞密度，活力应当大于95％，用(已经预热的)HEK293细胞培养基将细胞密度调节成3×106细胞/mL，轻轻摇匀并分装细胞(转染体系90％)，摇瓶中细胞体积不超过摇瓶规格的1/3，放入摇床待用。

2、根据转染细胞体积计算转染缓冲液opti-MEM的体积，为转染体系的1/10；计算转染试剂Polyethylenimine的量，其比例为3μL/mL转染细胞；计算转染DNA的总量，其比例为1μg/mL转染细胞。

具体转染的操作过程如下：

取1支50ml离心管，加入转染体系10％的MEM，加入质粒，混匀后过滤，静置5min，向DNA混悬液中加入Polyethylenimine，轻柔混匀(轻轻颠倒混匀2-3次)后静置15-20min。随后将复合物轻柔加入分装好的细胞中，边加入边轻轻晃动摇瓶；转染完成的细胞放入37℃摇床进行培养。

第1天补料

20h后，按1:1000转染细胞体积加入对应量的enhancer，并按2％转染细胞体积加Feed。

第4天测定转染细胞的表达量

取待测样品200uL，使用无标记分析仪检测蛋白表达量，293培养基作为阴性对照，已知蛋白浓度的溶液作为仪器分析时的阳性对照。

第5-6天收样

检测细胞活率(65-75％或更高为佳)，将样品以3000-5000×g离心20-30分钟，上清0.22um滤器过滤，获得的上清样品进行分离纯化和SEC-HPLC检测。将以上克隆构建后表达的蛋白纯化后进行的SEC-HPLC检测结果如图1、2所示，其中图中出峰特征如下表2、3所示：

表2 Bevacizumab SEC-HPLC检测结果出峰特征

表3 Anti-GPC3抗体的SEC-HPLC检测结果出峰特征

实施例三Anti-GPC3和Anti-GPC3(WT)与人CD16A的亲和力检测

采用Gator^TM非标记生物分析仪对上述表达的Anti-GPC3和Anti-GPC3(WT)分别进行与人CD16A蛋白(购自Novoprotein，货号CS11)的亲和力检测，选用Protein A生物传感器对抗体样品进行捕获，之后将捕获的抗体样品与人CD16A蛋白进行结合、解离的动力学检测。动力学使用1：1结合模型进行拟合分析。其简要步骤如下表4所示：

表4

步骤	时间
		蛋白加载	200s
结合	180s
		解离	300s
再生	30s

使用Gator^TM仪器测定的亲和力数据如下表5所示：

表5

改造后的抗体Anti-GPC3与改造前的抗体Anti-GPC3(WT)对人CD16A蛋白的亲和力相比提升了约10.8倍。

实施例四HepG2细胞株小鼠皮下CDX模型的建立和药效测试

4.1细胞培养

HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的MEM+0.01mM NEAA培养液中。收集指数生长期的HepG2细胞，PBS重悬至适合浓度用于裸鼠皮下肿瘤接种。

4.2动物造模

实验小鼠于右侧背部皮下接种1×10⁷HepG2细胞，细胞重悬在1:1的PBS与基质胶中(0.1ml/只)定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积80-120mm³(约100mm³)时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药。肿瘤细胞接种当天定义为第0天。

详细的给药方法、给药剂量和给药途径按照下表6进行操作。

表6人源肝癌HepG2细胞株皮下异种移植模型中的给药途径、剂量及方案

注：1.给药体积为10μl/g；2.第四组两个测试药的给药顺序和时间间隔为：先给Bevacizumab 30分钟后再给药Anti-GPC3。

4.3随机分组

在给药开始前，称量所有动物的体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积。鉴于肿瘤体积会影响治疗的有效性，所以用随机分组设计的方法，根据鼠的肿瘤体积对其分组，以保证不同组别间的肿瘤体积相似。使用StudyDirectorTM(版本号3.1.399.19，供应商StudylogSystem,Inc.,S.San Francisco,CA,USA)进行分组。

4.4实验观察和数据收集

肿瘤细胞接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。试验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。在分组后的当天(即肿瘤接种的第20天)开始给药后，之后的第7天(即肿瘤接种的第27天)进行第二次给药。每周测量2-3次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b²)(其中a表示长径，b表示短径)。实验中使用StudyDirectorTM(版本号3.1.399.19，供应商StudylogSystem,Inc.)软件收集数据，包括肿瘤的长短径的测量和动物体重的称量。根据每周的测量，得到如下的动物体内药效试验结果。如图3所示，统计结果显示，Bevacizumab和anti-GPC3联合用药组对肿瘤生长的抑制均好于Bevacizumab或者anti-GPC3的单一用药。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 苏州普乐康医药科技有限公司

<120> 一种抗GPC3抗体和包括该抗体的药物组合物

<130> 2020.03.02

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 556

<212> PRT

<213> GPC3

<400> 1

Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser

1 5 10 15

Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro

20 25 30

Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys

35 40 45

Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn

50 55 60

Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile

65 70 75 80

Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg

85 90 95

His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser

100 105 110

Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val

115 120 125

Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn

130 135 140

Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn

145 150 155 160

Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly

165 170 175

Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met

180 185 190

Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala

195 200 205

Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe

210 215 220

Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val

245 250 255

Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp

260 265 270

Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg

275 280 285

Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His

290 295 300

Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr

305 310 315 320

Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala

325 330 335

Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala

340 345 350

His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile

355 360 365

Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr

370 375 380

Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn

385 390 395 400

Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly

405 410 415

Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu

420 425 430

Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu

435 440 445

Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu

450 455 460

Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu

465 470 475 480

Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu

485 490 495

Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro

500 505 510

Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe

515 520 525

His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met

530 535 540

Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His

545 550 555

<210> 2

<211> 206

<212> PRT

<213> VEGF

<400> 2

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys

115 120 125

Arg Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg

130 135 140

Cys Cys Leu Met Pro Trp Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro

145 150 155 160

Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys

165 170 175

Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu

180 185 190

Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

195 200 205

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 7

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 9

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 10

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gccaccatgg agacagatac cctgctgctg tgggtgctgc tgctgtgggt ccctggcagc 60

accgga 66

<210> 12

<211> 4401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300

tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360

gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420

ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480

tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540

ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600

gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660

catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720

tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780

acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840

cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900

ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960

tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020

gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080

acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140

acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acggatctct agcgaattcc ctctagaggg 1200

cccgtttctg ctagcaagct tgctagcggc cgctcgaggc cggcaaggcc ggatcccccg 1260

acctcgacct ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 1320

ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttggtcga gatccctcgg 1380

agatctctag ctagaggatc gatccccgcc ccggacgaac taaacctgac tacgacatct 1440

ctgccccttc ttcgcggggc agtgcatgta atcccttcag ttggttggta caacttgcca 1500

actgaaccct aaacgggtag catatgcttc ccgggtagta gtatatacta tccagactaa 1560

ccctaattca atagcatatg ttacccaacg ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt 1620

aaaagggtcc taaggaacag cgatgtaggt gggcgggcca agataggggc gcgattgctg 1680

cgatctggag gacaaattac acacacttgc gcctgagcgc caagcacagg gttgttggtc 1740

ctcatattca cgaggtcgct gagagcacgg tgggctaatg ttgccatggg tagcatatac 1800

tacccaaata tctggatagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagc ataggctatc 1860

ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc 1920

ctaatttata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 1980

ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc 2040

ctaatagaga ttagggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc atatactacc 2100

caaatatctg gatagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2160

tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2220

tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa 2280

tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa 2340

tctgtatccg ggtagcatat gctatcctca tgataagctg tcaaacatga gaattaattc 2400

ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2460

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2520

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2580

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2640

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2700

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2760

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2820

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2880

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 2940

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3000

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3060

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3120

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3180

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3240

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3300

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3360

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3420

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3480

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3540

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3600

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3660

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3720

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3780

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3840

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3900

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 3960

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4020

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4080

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4140

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4200

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4260

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 4320

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 4380

cgagtcagtg agcgaggaag c 4401

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，包含有效量的抗GPC3抗体和VEGF/VEGFR抑制剂；

所述抗GPC3抗体的轻链可变区和重链可变区分别为SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；

所述抗GPC3抗体的重链恒定区为SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列，

所述VEGF/VEGFR抑制剂为Bevacizumab。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗GPC3抗体

的含量为60-1200mg，所述VEGF/VEGFR抑制剂的含量为60-1200mg。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗GPC3抗体是以0.1-15mg/kg的剂量施用。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述VEGF/VEGFR抑制剂的施用剂量为0.1-15mg/kg。

5.如权利要求1所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，所述癌症是肝癌。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肝癌是经过肝切除手术、肝癌射频消融术、肝动脉介入治疗、肝移植、化疗、放疗-质子治疗或者免疫治疗后是复发或进展性的。