CN111518221B - 一种重组il-15融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种重组IL‑15融合蛋白及其应用。本发明提供的重组IL‑15融合蛋白包括白细胞介素‑15、白细胞介素‑15受体α的Sushi结构域和抗人血清白蛋白纳米抗体；所述的白细胞介素‑15、白细胞介素‑15受体α的Sushi结构域和抗人血清白蛋白纳米抗体直接连接或通过连接肽间接连接。所述的重组IL‑15融合蛋白可以与人血清白蛋白结合，同时可以在低剂量的浓度下有效激活T细胞，使免疫***发挥作用，达到预防和***的目的。

Description

一种重组IL-15融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种重组IL-15融合蛋白及其应用。
背景技术
细胞因子，例如淋巴因子、趋化因子和生长因子，是由包括淋巴细胞、单核细胞在内的多种类型的细胞产生，在人类生理和疾病控制中有广泛的作用。这几类细胞因子在临床上证明能够有效的治疗多种疾病。例如白细胞介素（interleukin，IL）是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，其在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
其中，白细胞介素-15（IL-15）属于四个小α螺旋束细胞因子家族中的成员。IL-15需通过与其受体结合发挥生物学活性。IL-15受体由三个受体亚基组成：IL-15受体α（IL-15Rα）、IL-2受体β（IL-2Rβ，也称IL-15Rβ或CD122）和γc（也称CD132）。IL-15Rα内含一个Sushi结构域，能与IL-15结合，并且是使结合后的IL-15发挥生物学功能所必需的。IL-15具有广泛的免疫调节活性，能够参与调节多种免疫细胞的存活、增殖与功能，其中包括NK细胞、记忆性CD8+T细胞、NKT细胞等。
天然IL-15在治疗过程中必须经常以高剂量施用，由于毒性而限制其效用。IL-15半衰期大略为给药后1小时，且必须每天给药进行治疗。通过基因工程的方式开发含有人抗体Fc片段的融合蛋白是一种常用的增加蛋白半衰期的方式。专利CN108341884A中公开了一种免疫因子，包括白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽、IL-15Rα的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肽、直接地或间接地共价连接至所述缀合物的抗体或所述抗体的片段，能延长IL-15的半衰期，增强免疫效果。在专利CN108463239A中，利用IL-15的突变体IL-15N72D与IL-15受体的片段融合形成的IL-15Rα Sushi-Fc在共表达的情况下形成含有人Fc片段的四聚体融合蛋白，用于延长IL-15的半衰期，IL-15的超激动剂突变体（IL-15N72D）增加IL-2Rβ结合能力（比原生IL-15高4至5倍），并已经被认定用于治疗性用途。在专利CN106459219B中，通过突变改造额外引入二硫键的方式获得含有人Fc片段的IL-15及其受体IL-15Rα Sushi融合蛋白。专利CN102145178A、CN108472324A和NektarTherapeutics公司利用PEG化技术对IL-15蛋白进行修饰，降低修饰后的蛋白在体内的清除速率，达到长效使用的目的。但是，PEG化对工艺的要求很高，同时PEG化存在不能定点对目的蛋白进行PEG化、PEG化后的蛋白活性下降等问题。因此，仍然需要采用新的融合方式开发新型的IL-15融合蛋白。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是以抗人血清白蛋白纳米抗体为基础，构建了一种新型重组IL-15融合蛋白，该重组IL-15融合蛋白可以与人血清白蛋白进行高亲和力结合并显示出优异的T细胞激活效应，可用于肿瘤预防和治疗。
术语：
1、白细胞介素-15（interleukin-15，IL-15）：是指具有类似于IL-2的结构的细胞因子（GRABSTEIN等，Science，vol.264（5161），p：965-968，1994）。这种细胞因子也被称为IL-15、IL15或MGC9721。这种细胞因子和IL-2共享许多生物活性，且发现它们结合相同的***受体亚基。因此，IL-15和IL-2可以竞争相同的受体，从而负调节彼此的活性。已经证实，IL-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖，且证明CD8+记忆细胞的数量由IL-15这种细胞因子和IL-2之间的平衡来控制。在本申请中用英文符号“IL-15”表示。
2、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域：是指起始于白细胞介素-15受体α（IL-15Rα）的信号肽之后的第一个半胱氨基酸残基（C1），并终止于所述信号肽之后的第四个半胱氨基酸残基（C4）的结构域。对应于IL-15Rα的胞外区域的一部分的所述Sushi结构域是其结合至IL-15所必需的（WEI等，J.Immunol.，vol.167（1），p：277-282，2001）。在本申请中用英文符号“IL-15Rα Sushi”表示。
3、抗人血清白蛋白纳米抗体：纳米抗体是一种源自骆驼属体内或者护士鲨体内的重链抗体。1993年科学家首先发现在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区。经过基因克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性。抗人血清白蛋白纳米抗体是指能够与人血清白蛋白结合的纳米抗体，该纳米抗体与其他蛋白如IL-15融合后可以延长蛋白的血清半衰期。抗人血清白蛋白纳米抗体在本申请中用英文符号“anti-HSA VHH”表示。
4、氨基酸序列：指构成蛋白质或多肽的氨基酸残基的种类以及排列方式，通常用本领域常规使用的三字母方式表示氨基酸残基，也可使用本领域常规使用的单字母方式表示氨基酸残基，本领域技术人员应当能够将三字母构成氨基酸序列与单字母构成的氨基酸序列进行转换。应当明确的是，无论本申请中采用哪种方式表示，本领域技术人员均能够理解以及转换。例如：丙氨酸，单字母为A，三字母为Ala；精氨酸，单字母为R，三字母为Arg；天冬氨酸，单字母为D，三字母为Asp；半胱氨酸，单字母为C，三字母为Cys；谷氨酰胺，单字母为Q，三字母为Gln；谷氨酸，单字母为E，三字母为Glu；组氨酸，单字母为H，三字母为His；异亮氨酸，单字母为I，三字母为Ile；甘氨酸，单字母为G，三字母为Gly；天冬酰胺，单字母为N，三字母为Asn；亮氨酸，单字母为L，三字母为Leu；赖氨酸，单字母为K，三字母为Lys；甲硫氨酸，单字母为M，三字母为Met；苯丙氨酸，单字母为F，三字母为Phe；脯氨酸，单字母为P，三字母为Pro；丝氨酸，单字母为S，三字母为Ser；苏氨酸，单字母为T，三字母为Thr；色氨酸，单字母为W，三字母为Trp；酪氨酸，单字母为Y，三字母为Tyr；缬氨酸，单字母为V，三字母为Val。
5、英文符号“IL-15/IL-15Rα Sushi/anti-HSA VHH”：根据以上1-3条的解释，本申请文本中的此符号表示依次包含白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、抗人血清白蛋白纳米抗体的重组IL-15融合蛋白；其中符号“/”表示连接；应当说明的是，这种“连接”可以是直接连接，也可以是通过连接肽的间接连接。
6、英文符号“IL-15Rα Sushi/IL-15/anti-HSA VHH”：根据以上1-3条的解释，本申请文本中的此符号表示依次包含白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、白细胞介素-15、抗人血清白蛋白纳米抗体的重组IL-15融合蛋白；其中符号“/”表示连接；应当说明的是，这种“连接”可以是直接连接，也可以是通过连接肽的间接连接。
7、英文符号“anti-HSA VHH/IL-15/IL-15Rα Sushi”：根据以上1-3条的解释，本申请文本中的此符号表示依次包含抗人血清白蛋白纳米抗体、白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域的重组IL-15融合蛋白；其中符号“/”表示连接；应当说明的是，这种“连接”可以是直接连接，也可以是通过连接肽的间接连接。
8、英文符号“anti-HSA VHH/IL-15Rα Sushi/IL-15”：根据以上1-3条的解释，本申请文本中的此符号表示依次包含抗人血清白蛋白纳米抗体、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、白细胞介素-15的重组IL-15融合蛋白；其中符号“/”表示连接；应当说明的是，这种“连接”可以是直接连接，也可以是通过连接肽的间接连接。
9、人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）：是人血浆中的蛋白质，在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等：同时维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。在本申请中，人血清白蛋白用英文符号“HSA”表示，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示的序列。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种重组IL-15融合蛋白。
具体地，所述的重组IL-15融合蛋白包括白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和抗人血清白蛋白纳米抗体；
所述的白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和抗人血清白蛋白纳米抗体直接连接或通过连接肽间接连接；
所述的抗人血清白蛋白纳米抗体的氨基酸序列的通式为：
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSX1X2X3X4WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSX5X6X7X8ADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCX9X10X11X12X13X14X15X16WGQGTLVTVSS，其中：X1为氨基酸H、S、F、Y、N中的任意一种，X2为氨基酸G、A、W、Y中的任意一种，X3为氨基酸W、I、M中的任意一种，X4为氨基酸H、S、G中的任意一种，X5为氨基酸S、G、N、D中的任意一种，X6为氨基酸K、T、I中的任意一种，X7为氨基酸D、L、Y、N中的任意一种，X8为氨基酸Y、F中的任意一种，X9为氨基酸A、T、V中的任意一种，X10为氨基酸A、R、T、I中的任意一种，X11为氨基酸E、G、D中的任意一种，X12为氨基酸Y、D、G、R中的任意一种，X13为氨基酸S、G、Y、L中的任意一种，X14为氨基酸Y、S、G中的任意一种，X15为氨基酸G、S、D、N、A中的任意一种，X16为氨基酸K、S、Y、R、I中的任意一种。
具体地，所述的重组IL-15融合蛋白从N端到C端依次为：
白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和抗人血清白蛋白纳米抗体；
或，白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、白细胞介素-15和抗人血清白蛋白纳米抗体；
或，抗人血清白蛋白纳米抗体、白细胞介素-15和白细胞介素-15受体α的Sushi结构域；
或，抗人血清白蛋白纳米抗体、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域和白细胞介素-15。
具体地，所述的白细胞介素-15的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
具体地，所述的白细胞介素-15受体α的Sushi结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。
具体地，所述的白细胞介素-15和白细胞介素-15受体α的Sushi结构域之间通过连接肽进行连接；所述连接肽为（GxSy）n，其中：G为甘氨酸，S为丝氨酸，x为1、2、3或4，y为1、2、3或4，n为1、2、3、4、5或6。
优选地，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列。
优选地，所述抗人血清白蛋白纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列。
优选地，所述的重组IL-15融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
另一方面，本发明提供了一种生物学分子、载体或宿主细胞，所述的生物学分子、载体或宿主细胞包括编码上述重组IL-15融合蛋白的核酸分子。
又一方面，本发明提供了上述重组IL-15融合蛋白和/或生物学分子、载体或宿主细胞在制备肿瘤相关药物中的应用。
具体地，所述的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、头颈部的鳞状细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、子***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、胃癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤或病毒相关肿瘤中的任一种或多种。
又一方面，本发明还提供了一种药物组合物。
具体地，所述的药物组合物包含上述重组IL-15融合蛋白和/或生物学分子、载体或宿主细胞。
具体地，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。
更具体地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、赋形剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、矫味剂和粘合剂。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的重组IL-15融合蛋白可以与人血清白蛋白结合，同时可以在低剂量的浓度下有效激活T细胞，使免疫***发挥作用，达到预防和***的目的。
附图说明
图1为重组IL-15融合蛋白SDS-PAGE检测结果。其中，不同泳道代表的上样信息为：泳道 A为表达上清，泳道 B为纯化流穿液，泳道 C为洗脱液（还原），泳道 D为洗脱液（非还原），泳道 E为蛋白标准品。
图2为重组IL-15融合蛋白诱导CTLL2细胞增殖结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 重组IL-15融合蛋白的基因合成与载体构建
按照白细胞介素-15、白细胞介素-15受体α的Sushi结构域、抗人血清白蛋白纳米抗体的顺序将IL-15（SEQ ID NO：1）、IL-15RαSushi（SEQ ID NO：2）、anti-HSA VHH（SEQ IDNO：4）的氨基酸序列进行组装，IL-15与IL-15RαSushi之间通过柔性连接肽（SEQ ID NO：3）间接连接，形成重组IL-15融合蛋白序列（SEQ ID NO：5），按照人宿主细胞进行密码子优化并常规合成基因，之后在5'端依次添加EcoRI酶切位点和5'UTR（[SEQ ID NO：6]）；在3'端依次添加3'UTR（[TGATGA]）和HindIII酶切位点，将基因通过5' EcoRI and 3' HindIII克隆至载体pTT5（SEQ ID NO：7）。挑选克隆进行测序，选择测序正确的菌体进行保种并进行菌体的扩大培养，扩大的菌体用于质粒的提取。
实施例2 重组IL-15融合蛋白的表达和纯化
按照如下的方式对提取后的质粒进行细胞转染和蛋白的分离纯化：
1、测定细胞密度，活力应当大于95%，用已经预热的293培养基将293细胞密度调节成3×106细胞/mL，轻轻摇匀并分装细胞（转染体系90%），摇瓶中细胞体积不超过摇瓶规格的1/3，放入摇床待用。
2、根据转染细胞体积计算转染缓冲液opti-MEM的体积，为转染体系的1/10；计算转染试剂PEI的量，其比例为3μL/mL转染细胞；计算转染DNA的总量，其比例为1μg/mL转染细胞。
具体转染的操作过程如下：
取1支50mL离心管，加入转染体系10%的转染缓冲液opti-MEM，加入质粒，混匀后过滤，静置5min，向DNA混悬液中加入PEI，轻柔混匀（轻轻颠倒混匀2-3次）后静置15-20min。随后将复合物轻柔加入分装好的细胞中，边加入边轻轻晃动摇瓶；转染完成的细胞放入37℃摇床进行培养。
第1天补料：20h后，按1:1000转染细胞体积加入对应量的增强剂，并按2%转染细胞体积加补料培养基。
第4天测定转染细胞的表达量：取待测样品200μL，使用无标记分析仪检测蛋白表达量，293培养基作为阴性对照，已知蛋白浓度的溶液作为仪器分析时的阳性对照。
第5-6天收样：检测细胞活率（65-75%或更高为佳），将样品以3000-5000×g离心20-30分钟，上清0.22μm滤器过滤，获得的上清样品进行分离纯化和检测。
所得分子表达纯化的蛋白SDS-PAGE检测结果如图1所示。
实施例3 重组IL-15融合蛋白与HSA的结合检测
采用GatorTM非标记生物分析仪对上述表达的重组IL-15融合蛋白与HSA蛋白（购自ACROBiosystems，货号HSA-H5220）进行亲和力检测，选用Protein A生物传感器对抗体样品进行捕获，之后将捕获的重组IL-15融合蛋白与HSA蛋白进行结合、解离的动力学检测。动力学使用1：1结合模型进行拟合分析。其简要步骤如下：蛋白加载200s；结合180s；解离300s；再生30s。
使用GatorTM仪器测定的亲和力数据如下表1所示。
表1 重组IL-15融合蛋白与HSA蛋白亲和力检测结果
抗原 浓度 融合蛋白 响应值 亲和力(M) 解离常数(1/s) 结合常数(1/Ms)
HSA 10 μg/ml 83 nM 0.473 2.58E-08 6.83E-03 2.65E+05
检测结果显示，表达的重组IL-15融合蛋白可以以较高的亲和力与HSA蛋白进行结合，这保证了表达的重组IL-15融合蛋白在体内可以以较长的时间存在，进而有效的延长药物的半衰期。
实施例4 重组IL-15融合蛋白的活性测试
CTLL2细胞是小鼠T淋巴细胞，CTLL2细胞表达待测蛋白的受体，待测蛋白与CTLL2结合后会促进该细胞的增殖。本实施例用CellTiter-Glo®试剂检测了表达的重组IL-15融合蛋白对CTLL2细胞的增殖作用。CellTiter-Glo®试剂通过检测活细胞中ATP的含量来定量细胞数，细胞越多，检测的发光信号越强。
具体的步骤如下：
1、用RPMI 1640 medium（ATCC Modification, Gibco#A1049101）+10%FBS+2mM L-Glutamine+1mM sodium pyruvate+10ng/mL hIL-2培养CTLL2细胞，收集已扩大培养的细胞，吹打均匀后于1000rpm离心5分钟，用RPMI 1640 medium（ATCC Modification, Gibco#A1049101）+10%FBS+2mM L-Glutamine+1mM sodium pyruvate洗3遍，再用此培养基重悬计数并将细胞浓度调整至2E5/mL，取50μL细胞铺于96孔板中。
2、重组IL-15融合蛋白从10nM起4倍浓度梯度进行稀释，每孔50μL加入细胞中，37°C，5% CO2孵育48 小时。
3、48小时后，将板子从孵箱中拿出在室温平衡10分钟，每孔加入100μLCellTiter-Glo®，在微孔板混匀器上500rpm震荡10分钟以充***解细胞。
4、在酶标仪读取luminescence信号值，用GraphPad Prism5分析结果。
分析结果显示（如图2），表达的重组IL-15融合蛋白可以诱导CTLL2细胞增殖，并具有明显的剂量依赖性，EC50约为1.6nM，这表明表达的重组IL-15融合蛋白可以在很低的剂量水平对T细胞进行有效的激活，进而对肿瘤细胞进行杀伤。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 苏州普乐康医药科技有限公司
<120> 一种重组IL-15融合蛋白及其应用
<141> 2020-06-23
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 2
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Lys Phe Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Tyr Gly Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
145 150 155 160
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
165 170 175
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
180 185 190
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
195 200 205
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
210 215 220
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val
245 250 255
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Ser Ser Thr Lys Phe Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
275 280 285
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
290 295 300
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Gly Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
325 330
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gccaccatgg agacagatac cctgctgctg tgggtgctgc tgctgtgggt ccctggcagc 60
accgga 66
<210> 7
<211> 4401
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60
ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120
tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180
gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240
ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300
tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360
gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420
ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480
tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540
ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600
gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660
catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780
acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840
cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900
ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960
tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020
gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080
acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140
acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acggatctct agcgaattcc ctctagaggg 1200
cccgtttctg ctagcaagct tgctagcggc cgctcgaggc cggcaaggcc ggatcccccg 1260
acctcgacct ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 1320
ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttggtcga gatccctcgg 1380
agatctctag ctagaggatc gatccccgcc ccggacgaac taaacctgac tacgacatct 1440
ctgccccttc ttcgcggggc agtgcatgta atcccttcag ttggttggta caacttgcca 1500
actgaaccct aaacgggtag catatgcttc ccgggtagta gtatatacta tccagactaa 1560
ccctaattca atagcatatg ttacccaacg ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt 1620
aaaagggtcc taaggaacag cgatgtaggt gggcgggcca agataggggc gcgattgctg 1680
cgatctggag gacaaattac acacacttgc gcctgagcgc caagcacagg gttgttggtc 1740
ctcatattca cgaggtcgct gagagcacgg tgggctaatg ttgccatggg tagcatatac 1800
tacccaaata tctggatagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagc ataggctatc 1860
ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc 1920
ctaatttata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 1980
ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc 2040
ctaatagaga ttagggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc atatactacc 2100
caaatatctg gatagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2160
tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 2220
tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa 2280
tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa 2340
tctgtatccg ggtagcatat gctatcctca tgataagctg tcaaacatga gaattaattc 2400
ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 2460
ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 2520
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 2580
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 2640
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 2700
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 2760
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 2820
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 2880
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 2940
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 3000
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 3060
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 3120
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 3180
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 3240
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 3300
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 3360
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 3420
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 3480
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 3540
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 3600
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 3660
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 3720
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 3780
tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 3840
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 3900
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 3960
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 4020
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 4080
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 4140
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 4200
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 4260
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 4320
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 4380
cgagtcagtg agcgaggaag c 4401
<210> 8
<211> 585
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585

Claims (9)

1.一种重组IL-15融合蛋白，其特征在于，所述的重组IL-15融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的序列。
2.一种载体，其特征在于，所述的载体包括编码权利要求1所述的重组IL-15融合蛋白的核酸分子。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括编码权利要求1所述的重组IL-15融合蛋白的核酸分子。
4.权利要求1所述的重组IL-15融合蛋白、权利要求2所述的载体和/或权利要求3所述的宿主细胞在制备肿瘤相关药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为黑色素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、子***、卵巢癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、肾癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤中的任一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为非小细胞肺癌、头颈部的鳞状细胞癌、结肠直肠癌、胃癌中的任一种或多种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的结肠直肠癌为结肠癌。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为病毒相关肿瘤。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含权利要求1所述的重组IL-15融合蛋白、权利要求2所述的载体和/或权利要求3所述的宿主细胞。
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