CN113439809A - 一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有抗氧化抗疲劳功能的液体制剂及其制备方法。本发明提供的液态制剂，原料包括：蓝莓果汁40‑80份、菠萝果汁10‑30份、芒果果汁10‑30份以及牛磺酸30‑70份、左旋肉碱80‑100份、烟酰胺2‑6份。本发明制备的液态制剂稳定性好，粒径小，可有效提高机体抗氧化***的防御能力，进而起到抗疲劳作用。

Description

一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及特殊用途食品的技术领域，尤其涉及一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂及其制备方法。
背景技术
蓝莓(Blueberry)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium spp.)的多年生常绿或落叶灌木，果实是圆形、蓝色或紫色的小浆果，又称为越橘、蓝浆果等。花青素在自然界中广泛存在，人们对它的研究已有30多年历史，美国农业部人类营养中心的研究人员比较了40多种新鲜水果和蔬菜的抗氧化活性，得出蓝莓是所有样品中抗氧化能力最高的，源于蓝莓中含量很高的花青素。蓝莓富含花青素、黄酮类和单宁多酚，可抗氧化、抗炎、抗增殖、抗肥胖、有效降低胆固醇、防止动脉粥样硬化，具有清除自由基、延缓衰老和提升记忆力等功能。芒果中含有丰富的类胡萝卜素,具有良好的抗氧化功能,能够有效地清除人体内产生的自由基,从而起到一定的抗衰老的作用。菠萝原名凤梨，菠萝属于凤梨科凤梨属多年生草本果树植物，有70多个品种，岭南四大名果之一。菠萝具有很多抗氧化剂，有助于避免自由基引起的身体氧化应激，这些自由基会反弹并且损害健康的细胞。这个过程与慢性炎症，弱免疫***和几种危险疾病有关。抗氧化剂能够与自由基结合并中和它们。牛磺酸是一种特殊的氨基酸，是人体必不可少的一种营养元素，使血液循环正常化，从而消除疲劳生成物，调节血压，使肌体有效的产生能量。(L-肉碱)是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，可以缓解运动时氧化应激。烟酰胺又称为VB3或VPP，水溶性维生素，在制剂中能够帮助提高人体的免疫力与活力。
众所周知，抗氧化剂能祛除自由基对人体的损害，对健康有保护性作用。从食品中补充抗氧化成分抵抗氧化应激至关重要，因此，功能性食品的生产和消费变得越来越重要，功能性食品和液态制剂是由天然成分配制而成，具有针对性的生理功能，是食品工业研发的核心。功能性制剂包含了所有的食物，从矿泉水到水果和蔬菜汁/花蜜/糖浆、高能量/高热量制剂、功能性液态制剂(如牛奶/草药制剂)、刺激性制剂(如茶/咖啡/运动制剂)以及含谷类草和谷类的液态制剂。它是目前最活跃的功能性食品类别，因为液态制剂方便且能够满足消费者对容器内容物、尺寸、形状和外观的需求，以及其货架稳定有利于产品的配送和储存。它们是维生素、矿物质、抗氧化剂、ω-3脂肪酸、植物提取物、纤维、益生元和益生菌等营养物质和生物活性化合物的极好补充方式。
发明内容
本发明的目的在于为解决当今抗氧化抗疲劳的液态制剂的抗氧化抗疲劳效果不理想，研发困难等问题，提供一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂及其制备方法，以提高机体抗氧化***的防御能力，从而起到抗疲劳的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，由包含如下体积份的原料及质量份的原料制备得到：蓝莓果汁40-80份、菠萝果汁10-30份、芒果果汁10-30份以及牛磺酸30-70份、左旋肉碱80-100份、烟酰胺2-6份。
优选的，由包含如下重量份的原料制备得到：蓝莓果汁60mL、菠萝果汁20mL、芒果果汁30mL以及牛磺酸50mg、左旋肉碱90mg、烟酰胺4mg。
优选的，所述蓝莓果汁的粒径≤200目，芒果果汁的粒径≤200目。菠萝果汁的粒径≤200目。
本发明还提供了一种具有抗氧化因子的固态制剂的制备方法，包含如下步骤：将蓝莓果汁、菠萝果汁、芒果果汁、牛磺酸、左旋肉碱、烟酰胺均匀混合，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。
优选的，所述蓝莓果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对蓝莓进行全果破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的蓝莓加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶；
(3)对步骤(2)处理后的蓝莓浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
优选的，所述菠萝果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对菠萝去皮后进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的菠萝加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶
(3)对步骤(2)处理后的菠萝浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
优选的，所述芒果果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对芒果去皮去壳进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的芒果加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶；
(3)对步骤(2)处理后的芒果浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
优选的，所述步骤(3)中离心的转速为4000r/min，脱气所述超声的功率为400W，40kHz；
本发明提供的液态制剂具有提高机体抗氧化酶系活性，提高抗氧化***防御能力。蓝莓果汁、菠萝果汁、芒果果汁以及牛磺酸、左旋肉碱和烟酰胺的组合，具有协同抗氧化、抗疲劳的作用。并从调控蛋白和基因表达上佐证了组合物的协同抗氧化、抗疲劳的机理。
按照本发明的制备方法制备的液态制剂颗粒均匀，粒径小、稳定性好，能够获得一种多用途、效果好、副作用小的纯天然抗氧化抗疲劳的花青素基料液态制剂。
附图说明
图1为剪切速率对液体粘度的影响分析图；
图2为制剂储能模量和耗能模量的变化情况；
图3为制剂的粒径分析图；
图4为制剂对ABTS自由基清除率的分析图；
图5为制剂对超氧自由基清除率的分析图；
图6为制剂对羟基自由基清除率的分析图；
图7为制剂对小鼠血清SOD活力的影响分析图；
图8为制剂对小鼠血清GSH-Px活力的影响分析图；
图9为制剂对小鼠血清CAT活力的影响分析图；
图10为制剂对小鼠血清MDA活力的影响分析图；
图11为制剂对小鼠血清乳酸含量的影响分析图；
图12为制剂对小鼠血清肝糖原含量的影响分析图；
图13为制剂对小鼠血清BUN含量的影响分析图；
图14为制剂对小鼠血清肌糖原含量的影响分析图；
图15为制剂对疲劳小鼠肌肉组织形态学的影响；
图16为制剂对疲劳小鼠肝脏组织形态学的影响；
图17为制剂对亲代小鼠生育率的影响分析图；
图18为制剂对子代小鼠性别比的影响分析图；
图19为制剂对子代小鼠体重的影响分析图；
图20为制剂对子代小鼠GSH含量的影响分析图；
图21为制剂对子代小鼠铜蓝蛋白含量的影响分析图；
图22为制剂对子代小鼠维生素E含量的影响分析图；
图23为制剂对子代小鼠乳酸含量的影响分析图；
图24为制剂对子代小鼠肝糖原含量的影响分析图；
图25为制剂对亲代小鼠肌肉AMPKα、PGC-1α、TFAM基因和蛋白相对表达量的影响；
图26为制剂对亲代小鼠肌肉Nrf2、GSK3β基因和蛋白相对表达量的影响；
图27为制剂对亲代小鼠肌肉HO-l、NQO1、GSR基因和蛋白相对表达量的影响；
图28为制剂对疲劳诱导氧化应激的防护机制
具体实施方式
本发明提供了一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，由包含如下体积份的原料及质量份的原料制备得到：蓝莓果汁40-80份、菠萝果汁10-30份、芒果果汁10-30份以及牛磺酸30-70份、左旋肉碱80-100份、烟酰胺2-6份。
在本发明中，所述具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，优选由包括如下体积份的原料制备得到：蓝莓果汁优选为40-80份，进一步优选为50-70份，更进一步优选为60份；菠萝果汁优选为10-30份，进一步优选为15-25份，更进一步优选为20份；芒果果汁优选为10-30份，进一步优选为15-25份，更进一步优选为20份；牛磺酸优选为30-70份，进一步优选为40-60份，更进一步优选为50份；左旋肉碱优选为80-100份，进一步优选为85-95份；更进一步优选为90份；烟酰胺优选为2-6份，进一步优选为3-5份，更进一步优选为4份。
在本发明中，所述蓝莓果汁的粒径优选≤200目，进一步优选为≤300目；芒果果汁的粒径优选≤200目，进一步优选为≤300目。菠萝果汁的粒径优选≤200目，进一步优选为≤300目。
在本发明中，所述芒果及菠萝优选为去核后经过打浆得到；所述果实与水的比例优选(2:1)(m:V)，进一步优选为(1.5:1)；时间优选为3min，进一步优选为5min。
本发明还提供了一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，包含如下步骤：将蓝莓果汁、菠萝果汁、芒果果汁、牛磺酸、左旋肉碱、烟酰胺均匀混合，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。作为优选的，所述蓝莓花青素的制备方法包含如下步骤：
作为优选的，所述蓝莓果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对蓝莓进行全果破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的蓝莓加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶
(3)对步骤(2)处理后的蓝莓浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
作为优选的，所述菠萝果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对菠萝去皮后进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的菠萝加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶
(3)对步骤(2)处理后的菠萝浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
作为优选的，所述芒果果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对芒果去皮去壳进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的芒果加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶
(3)对步骤(2)处理后的芒果浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
在所述蓝莓果汁的制备方法、所述的菠萝果汁的制备方法和所述芒果果汁的制备方法中，所述步骤(2)中采用果胶酶浓度优选为0.01～0.2％，进一步优选为0.1％；所述酶解温度优选为30～60℃，进一步优选为40-50℃，更进一步优选为45℃；酶解的时间优选为30-50min，进一步优选为40min；所述灭酶的温度优选为70～100℃，进一步优选为85℃。所述酶解的时间优选为3-7min，进一步优选为5min
在所述蓝莓果汁的制备方法、所述的菠萝果汁的制备方法和所述芒果果汁的制备方法中，所述步骤(3)中所述的离心转速为4000r/min,所述离心时间优选为5～15min，进一步优选为10min；所述脱气的超声的功率为400W，40kHz；脱气时间优选为20～40min，进一步优选为30min，
本发明优选在所述脱气后进行在25MPa均质5min，将封盖后的果汁放入85℃的水浴中进行加热10min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
对蓝莓进行全果破碎，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到蓝莓果汁。
将菠萝去皮，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到菠萝果汁。
将芒果去核去皮后，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到芒果果汁。
将上述处理得到的蓝莓果汁60mL、菠萝果汁20mL、芒果果汁30mL以及牛磺酸50mg、左旋肉碱90mg、烟酰胺4mg混合均匀得原料A。取90ml原料A与10mL水混合，紫外灭菌30min、包装，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。
实施例2
对蓝莓进行全果破碎，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到蓝莓果汁。
将菠萝去皮，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到菠萝果汁。
将芒果去核去皮后，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到芒果果汁。
将上述处理得到的蓝莓果汁60mL、菠萝果汁20mL、芒果果汁30mL以及牛磺酸50mg、左旋肉碱90mg、烟酰胺4mg混合均匀得原料A。取85ml原料A与15mL水混合，紫外灭菌30min、包装，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。
实施例3
对蓝莓进行全果破碎，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到蓝莓果汁。
将菠萝去皮，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到菠萝果汁。
将芒果去核去皮后，果实与水按(2:1)(m:V)比例破碎打浆，再将破碎的打浆后加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min。，得到果浆。将果浆加热到85℃持续5min进行灭酶处理，使果胶酶失活，然后冷却至室温。用200目双层滤布进行过滤，再以4000r/min转速离心10min。采用超声波进行脱气，超声条件为400W，40kHz，脱气时间30min。在25MPa下均质5min后灭菌，得到芒果果汁。
将上述处理得到的蓝莓果汁60mL、菠萝果汁20mL、芒果果汁30mL以及牛磺酸50mg、左旋肉碱90mg、烟酰胺4mg混合均匀得原料A。取80ml原料A与20mL水混合，紫外灭菌30min、包装，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。
实验例1
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行粘度测定，结果见图1。
剪切粘度是稳流时剪切应力/剪切速率的值，粘度值反映了水溶液抵抗搅拌的稳定性，也能反映液态制剂的货架期长短。日常检测时通常采用的剪切速率低限值为0.01s-1，而此时的粘度值与溶液体系的稳定性密切相关，如持水性、抵抗沉降及扰动能力的结构稳定性等。剪切速率在0.01至100s-1之间变化，由图1可知，随着剪切速率的提高而逐渐降低，后趋于平缓，体现出剪切变稀特性。起始下降幅度较大，是由于剪切速率的增大使得制剂粒子间的结构被打散，分子间的结合能力下降导致粘度迅速下降。当剪切速率大于10s-1后，粘度趋于平稳，颗粒间的絮凝作用被剪切力破坏使粘度减小。随着剪切速率的继续增大，分子结构几乎被完全破坏，因而趋于平缓，呈现出假塑性流体特点。此特点利于生产时管道输送，减少能耗。
实验例2
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行储能模量和耗能模量测定，结果见图2。
储能模量是指在交变应力作用下一个周期内储存能量的能力，通常指弹性。耗能模量用来表征耗散变形能量的能力，体现了粘性本质。它表示当发生形变时，能量转化成热能。由图2可知，随着频率的升高，储能模量和耗能模量都随之增大，说明此体系属于粘弹性体系，弹性大于粘性，样品表现出液体的行为；在交点后表现出弱凝胶行为。
实验例3
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行粒径测定，结果见图3。
粒径分析是检测抗疲劳液态制剂体系稳定性的有效手段之一。粒子粒径越大越容易产生聚集分层现象，影响液态制剂体系的稳定性。粒径越小，产品稳定性较好。如图3所示，本发明的液态制剂粒径为1192±75nm，说明强度较高。PDI为0.399，说明分散性较好，液态制剂分布比较均匀，粒径较小。颗粒越小，液态制剂越稳定不易聚集成团，表明体系稳定性越好。
实验例4
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行ABTS自由基清除率的测定，结果见图4。
测定清除ABTS自由基能力是检测食品抗氧化能力的重要方法，ABTS自由基呈现蓝绿色，在自由基清除剂存在时，ABTS的量会降低，在最大吸收处波长处的吸光值也会随之降低。如图4所示，在0-1.2mg/mL范围内，对ABTS的清除率随着浓度升高而升高。花青素基料液态制剂清除ABTS自由基的IC50值为0.91mg/mL，高于其他各种复配物。
为研究花青素基料液态制剂中各组分效果是协同还是叠加、拮抗作用，本实验以及以下实验例中采用Chou-Talalay模型计算联合作用指数。根据联合作用指数(CI)确定联用效果，其中CI<1表示协同，CI＝1表示相加，CI>1表示拮抗作用。CI值按公式(2-6)计算。
Figure BDA0003079766810000081
式中：(DX)1—只存在于D1时，清除率X％的剂量
(DX)2—只存在于D2时，清除率X％的剂量
(D)1，(D)2—D1、D2两个组合的清除率为x％时各自的剂量。
表1 ABTS自由基清除率的测定中CI值
Figure BDA0003079766810000082
通过各组合对清除ABTS自由基的IC50，计算出的联合作用指数(CI)，由表1可知，蓝莓+芒果组，蓝莓+菠萝组各组合的CI平均值均＜1，但蓝莓+芒果组、蓝莓+菠萝组p>0.05，协同效果得不到统计意义上的支持，即效果相当于各组分的叠加。而花青素基料液态制剂组，CI不仅是最低的，且有显著性差异p<0.01，表明花青素基料液态制剂各组分之间具有协同作用，且协同抗氧化效果较好。
实验例5
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行超氧自由基的测定，结果见图5。
在大多数生物中，O2-自由基通过超氧化物歧化酶转化为过氧化氢。在没有金属离子的情况下，过氧化氢是稳定的。但是，在金属离子的存在下，O2-与过氧化氢的反应会形成羟基自由基。如图6所示，单一组分中牛磺酸对超氧自由基的清除率高于蓝莓等果汁，花青素基料制剂的IC50值为8.78，低于其他各种复配物。
表2超氧自由基的测定中CI值
Figure BDA0003079766810000091
由表2可知，蓝莓+芒果组，蓝莓+菠萝组各组合的CI平均值均＜1，但蓝莓+芒果组、蓝莓+菠萝组p>0.05，协同效果得不到统计意义上的支持，即效果相当于各组分的叠加。而花青素基料液态制剂组，CI不仅是最低的，且有显著性差异p<0.01，表明其协同抗氧化效果最好。
实验例6
以实施例1设计制备的液态制剂为例，进行羟基自由基的测定，结果见图6。
羟基自由基的清除率是采用水杨酸法进行测定的，Fenton反应基于在低pH值下由亚铁离子(Fe2+)催化的过氧化氢的离解。当亚铁离子被氧化成三价铁离子(Fe3+)时，过氧化氢分解成氢氧根离子(OH-)和羟基自由基(·OH)。图6所示，反应了各组分的羟基自由基清除率，当浓度为12mg/mL时，芒果的羟基自由基清除率为55.24％，蓝莓为67.72％，菠萝为45.14％，牛磺酸为58.47％而二元复合后均高于单一组分，花青素基料液态制剂的羟基清除率高于蓝莓+菠萝+芒果，表明其抗氧化能力更强。
表3羟基自由基的测定中CI值
Figure BDA0003079766810000092
由表3可知，蓝莓+芒果组，蓝莓+菠萝组各组合的CI平均值均＜1，但蓝莓+芒果组p>0.05，协同效果得不到统计意义上的支持，即效果相当于各组分的叠加。而花青素基料液态制剂组，CI不仅是最低的，且有显著性差异p<0.01，表明其协同抗氧化效果最好。
实验例7
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清中SOD指标的影响，结果见图7。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
超氧化物歧化酶(SOD)为蛋白损伤的重要标志物，可清除细胞内自由基，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用。因而超氧化物歧化酶对机体的氧化与抗氧化的平衡起着至关重要的作用。它能够消除机体在正常能量交换时候产生的有害物质，清除体内多余自由基，降低O2-的破坏作用，达到预防或改善疲劳诱导的氧化损伤。因此，从SOD的活性可以判断机体的抗氧化、抗应激能力。由图7可知，与空白组相比，模型组小鼠经过疲劳损伤以后，其血清中的SOD活力显著降低(P<0.01)，表明疲劳破坏了小鼠体内的氧化还原平衡，诱导小鼠机体产生氧化损伤。与模型组相比，花青素基料制剂的中、高剂量组高于模型组，差异极其显著(P<0.01)。低剂量组显著高于模型组(P<0.05)，而阳性对照组差异不显著(P>0.05)。因而花青素基料液态制剂起到很强的抗氧作用。
实验例8
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清中GSH-Px指标的影响，结果见图8。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
谷胱甘肽过氧化酶GSH-Px是一种可清除自由基和抑制自由基反应的过氧化物分解酶，其中三分之二存在于细胞质中，三分之一存在于线粒体中。它能够催化H2O2与还原型谷胱甘肽反应生成H2O2的还原产物。在GSH-Px功能与结构中的巯基三肽密切相关，其在血清和细胞中的活性水平目前被作为氧化还原状态的评价标志，氧化应激可导致GSH-Px活力下降，是一种潜在的凋亡早期激活信号，随后产生的ROS促使细胞发生凋亡。由图8可知，与空白对照组相比，模型组GSH-Px值极显著高于空白组(P<0.01)，与模型组相比，主要是大量的GSH-px用于清除自由基而被消耗，使其含量降低，测定结果减小。花青素基料制剂的低、中、高剂量组及阳性对照组的GSH-Px高于模型组，差异极其显著(P<0.01)。表明液态制剂均可提高小鼠体内的GSH-Px，可知其具有很好的抗氧化效果。
实验例9
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清中CAT指标的影响，结果见图9。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
过氧化氢酶(CAT)为过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40％，其可清除肝细胞内过氧化物，保护机体免受自由基损伤。H2O2浓度越高，CAT对其的分解速度越快，因此是生物防御体系的关键酶之一。正常情况下，细胞内部和线粒体基质中有完善抗氧化防御***，保持活性氧在一个比较低的生理浓度。本实验测定了小鼠血清中的CAT活力，用来研究制剂对疲劳诱导小鼠抗氧化酶系的缓解作用。由图9可知，与空白组相比较，模型组CAT值极显著低于空白组(P<0.01)，与模型组相比，高剂量组及阳性对照组的CAT高于模型组，差异极其显著(P<0.01)。中剂量组显著高于模型组(P<0.05)，而低剂量组差异不显著(P>0.05)。表明制剂对CAT有保护作用，起到一定抗氧化作用。
实验例10
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清中MDA指标的影响，结果见图10。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
丙二醛(MDA)是脂质过氧化的重要指标。MDA含量越高代表机体组织脂质过氧化越严重。过量的脂质过氧化会导致新陈代谢异常。
如图10所示，与空白组相比较，模型组MDA值极显著高于空白组(P<0.01)，说明疲劳对小鼠产生了氧化损伤。与模型组相比，花青素基料制剂的低、中、高剂量组及阳性对照组的MDA高于模型组，差异极其显著(P<0.01)。结果表明制剂对氧化损伤存在防护作用。
实验例11
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清乳酸指标的影响，结果见图11。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
血清乳酸是评价机体疲劳的重要指标，长时间高强度的运动会导致肌肉缺氧，促进糖酵解的产生继而导致乳酸的大量产生，乳酸的多少与运动能力呈现负相关，乳酸过多，会导致运动能力下降。如图11所示，与空白组相比较，模型组血清乳酸极显著高于空白组(P<0.01)。与模型组相比，花青素基料制剂的低、中、高剂量组及阳性对照组的血清乳酸的含量均低于模型组，差异极其显著(P<0.01)。结果表明液态制剂能够降低体内乳酸含量，减少乳酸在体内的积累，因而具有一定的抗疲劳作用。
实验例12
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠肝糖原指标的影响，结果见图12。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
肝糖原是由于葡萄糖分子聚合物以糖原的形式贮存在肝脏而形成的。它的含量影响着机体的运动耐力，其作用是当机体剧烈运动时，补充所消耗掉的血糖，将其维持在平衡状态。当肝糖原被大量消耗时，机体就会产生疲劳。如图12所示，与空白组相比较，模型组的肝糖原含量极显著低于空白组(P<0.01)。与模型组相比，花青素基料制剂中、高剂量组肝糖原的含量均高于模型组，差异极其显著(P<0.01)，低剂量组及阳性对照组显著高于模型组(P<0.05)。结果表明液态制剂可以提高小鼠体内肝糖原的储备能力，延缓疲劳的产生。
实验例13
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠血清尿素氮指标的影响，结果见图13。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
血清尿素氮(BUN)是衡量疲劳的一个重要指标，剧烈运动后，机体为满足能量需求，蛋白质加速分解所产生的代谢产物，因而血清尿素氮含量与尿素密切相关，间接影响运动耐力。如图13所示，与空白组相比较，模型组血清BUN极显著高于空白组(P<0.01)，并且具有最高的血清尿素氮含量。与模型组相比，花青素基料制剂的低、中、高剂量组及阳性对照组的血清尿素氮的含量均低于模型组，差异极其显著(P<0.01)，并且呈现剂量效应关系。由此看出，液态制剂在小鼠体内参与了能量代谢，从而减缓小鼠体内蛋白质的代谢，表明液态制剂可以降低体内血清尿素氮的含量。由此可见，液态制剂具有一定的抗疲劳作用。
实验例14
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠肌糖原指标的影响，结果见图14。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
小鼠的运动耐力与肌糖原的储存及消耗有关，它由若干葡萄糖分子聚合构成，以糖原的形式贮存在肌肉组织中，当剧烈运动时，可以将其分解成葡萄糖补充体内的血糖消耗，使其维持在正常水平，而肌糖原被大量消耗时会产生疲劳。如图14所示，与空白组相比，模型组的肌糖原极显著低于空白组(P<0.01)。与模型组相比，花青素基料制剂的低、中、高剂量及阳性对照组肌糖原的含量均高于模型组，差异极其显著(P<0.01)。结果表明液态制剂可以提高小鼠体内肌糖原的储备能力，延缓疲劳的产生。
实验例15
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠肌肉组织形态学的影响，结果见图15。
如图15所示，空白组的肌肉组织排列较为紧密，胞质胞核染色较均匀，未见水肿。模型组的肌肉组织排列紊乱，胞质染色不均匀，可见明显水肿，胞核固缩。各制剂高剂量组改善优于同一药物的低、中剂量组。
实验例16
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠肝脏组织形态学的影响，结果见图16。
如图16所示，空白组的肝细胞板排列较规整，沿中央静脉呈放射状分布，胞质胞核界限较清晰。模型组的肝细胞板排列不规整，胞质染色不均匀，可见胞质融合肿胀，胞核固缩，可见有炎细胞聚积成堆。研究发现力竭运动会引起肝小叶以及肝静脉内皮细胞的损伤和坏死。肝细胞结构的损伤将造成肝功能降低，限制机体的运动能力。各给药组的肝组织病理改变均有不同程度的改善。
实验例17
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠亲代生育率的影响，结果见图17。
亲代小鼠过度疲劳后出现精神倦怠，对外界反应迟钝甚至死亡的现象。如图17所示，与正常组相比，液态制剂各组(LP-LP、N-F、N-M)子代均无显著差异，即制剂雄-制剂雌、制剂雄-正常雌、制剂雌-正常雄的生育率基本无差异，模型组的生育显著下降。除模型组外，N-F、M-F组相对于M-M、N-M组的生育率降低，表明液态制剂对亲代的疲劳具有一定的防护作用，此外，暗示了雌鼠疲劳后造成的氧化损伤对生育率的影响更大。
实验例18
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对疲劳诱导子代性别比的影响，结果见图18。
如图18所示，亲代经疲劳诱导后影响子代小鼠性别，正常组子代小鼠中雌性比例为38.46％，模型组子代中雌性比例为47.6％，差异极显著(P＜0.01)。液态制剂各组子代雌性比例均大于正常组而小于模型组，表明液态制剂对疲劳诱导的氧化损伤起到了一定的防护作用。
实验例19
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对疲劳诱导子代性别比的影响，结果见图19。
如图19所示，各组小鼠子代雄鼠的体重普遍大于雌鼠，与正常组(18.62±1.23g，16.86±0.91)相比，其他各组体重均有所下降，其中模型组(16.42±1.30g，15.34±1.59)小鼠的体重降低最多，但差异不显著(P＞0.05)，其他组体重减轻较少，表明液态制剂对子代体重的防护作用较好。
实验例20
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠子代谷胱甘肽合成能力的影响，结果见图20。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
GSH是一种细胞抗氧化剂，具有重要作用。包括基因表达调控、酶活性和代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节等如图20所示，与正常组相比，模型组的GSH合成能力显著下降(P＜0.01)，与模型组相比，花青素基料制剂的LP-LP、N-F组GSH含量极显著升高(P＜0.01)，M-M、N-M组的GSH含量显著升高(P＜0.05)。
实验例21
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠子代铜蓝蛋白合成能力的影响，结果见图21。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
铜蓝蛋白属于多铜氧化酶家族，具有抗氧化酶活力，可防止机体脂质过氧化物的产生，避免组织损伤及其他的功能障碍，因而具有很强的抗氧化能力。如图21所示，与正常组相比，模型组的铜蓝蛋白合成能力显著下降(P＜0.01)，与模型组相比，花青素基料的LP-LP、N-F、M-M、N-M组的铜蓝蛋白含量极显著升高(P＜0.01)，表明花青素基料制剂对疲劳诱导子代的氧化损伤具有防护作用。
实验例22
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠子代维生素E合成能力的影响，结果见图22。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
VE是非酶抗氧化***中重要的抗氧化剂之一，可抑制过氧化脂质的产生，也可通过上调抗氧化酶(HO-1、NQO-1)基因的表达来减轻机体的氧化损伤。如图22所示，与正常组相比，模型组的VE活力显著下降(P＜0.01)，与模型组相比，花青素基料制剂的LP-LP、N-F组的VE含量极显著升高(P＜0.01)，M-M组VE含量显著升高(P＜0.05)，表明花青素基料制剂对疲劳诱导子代的氧化损伤具有防护作用。
实验例23
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠子代血清乳酸含量的影响，结果见图23。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
乳酸是评价疲劳的重要指标，可通过减少乳酸的产生或加快乳酸的清除来延缓疲劳产生。如图23所示，与正常组相比，模型组的乳酸含量显著升高(P＜0.01)，与模型组相比，花青素基料制剂的N-F组的乳酸含量显著降低(P＜0.05)，其他组无显著差异(P＞0.05)，表明各给药组均能增加乳酸的有氧代谢活动，缓解疲劳的产生。相比M-F组，M-M组子代乳酸含量与正常组差异较小，与N-M组相比，N-F组子代乳酸含量与正常组差异较小。
实验例24
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对小鼠子代肝糖原含量的影响，结果见图24。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
肝糖原可维持血糖处于正常水平，保证机体日常的生命活动及运动能力。如图24所示，与正常组相比，模型组的肝糖原含量显著降低(P＜0.01)，与模型组相比，LP-LP、N-F、M-M、N-M组的肝糖原含量极显著升高(P＜0.01)，表明液态制剂可减少体内乳酸堆积，M-F肝糖原含量与模型组差异不显著(P＞0.05)。运动所导致的体力耗尽与肌糖原的消耗同步进行，而为了维持运动状态所需的血糖水平会逐渐消耗肝糖原，使肝糖原含量降低。
实验例25
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对亲代疲劳小鼠肌肉AMPKα、PGC-1α、TFAM mRNA和蛋白表达的影响，结果见图25。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
如图25所示，与正常组相比，模型组小鼠肌肉中AMPKα、PGC-1α、TFAM mRNA和蛋白表达水平显著下调(P＜0.01)，表明当机体出现运动性疲劳时，AMPK表达受到抑制，能量代谢通路受阻，机体能量供应不足。小鼠给药后，与模型组相比，液态制剂的中、高剂量组小鼠肌肉组织中AMPKα、PGC-1α、TFAM mRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)。结果表明在AMPK信号通路的帮助下产生更多ATP，以延迟运动疲劳，PGC-1α可通过激活线粒体转录因子表达，提高能量代谢酶活性，进而提高抗疲劳能力。
综上，PGC-1α作为一个重要的调控蛋白，可刺激下游通路TFAM的表达，以此维持线粒体的正常复制与转录，为细胞代谢提供能量。因此，液态制剂可能通过激活AMPK/PGC-1α途径来增加肌肉功能并增强肌肉能量代谢，其机制可能与改善线粒体氧化应激状态、降低线粒体膜的通透性、强化呼吸功能、上调PGC-1α和TFAM的表达相关。这也是液态制剂具有协同抗疲劳和协同抗氧化等效果的机理和佐证。
实验例26
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对亲代疲劳小鼠肌肉Nrf2、GSK3βmRNA和蛋白表达的影响，结果见图26。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
如图26所示，与正常组相比，模型组小鼠肌肉中Nrf2 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P＜0.01)，机体氧化还原平衡被破环。小鼠给药后，与模型组相比，液态制剂的中、高剂量组小鼠肌肉组织中Nrf2 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)。结果表明，液态制剂可显著增加细胞核中Nrf2的表达水平，进而提高抗疲劳能力。与正常组相比，模型组小鼠肌肉中GSK3βmRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)，与模型组相比，液态制剂的中、高剂量组小鼠肌肉组织中GSK3βmRNA和蛋白表达水平显著下调(P＜0.01)。结果表明，AMPK可直接磷酸化Nrf2，并抑制GSK3β的活性间接促进Nrf2的核内蓄积，促进抗氧化酶基因的表达，进而调控细胞氧化还原平衡。这也是液态制剂具有协同抗疲劳和协同抗氧化等效果的机理和佐证。
实验例27
以实施例1设计制备的液态制剂为例，研究液态制剂对亲代疲劳小鼠肌肉NQO1、HO-1、GSR mRNA和蛋白表达的影响，结果见图27。注：实验数据以平均值±标准差表示(n＝6)。##表示与空白组之间存在极显著差异(P<0.01)；*表示与模型组之间存在显著差异(P<0.05)，**表示与模型组之间存在极显著差异(P<0.01)。
如图27所示，与正常组相比，模型组小鼠肌肉中NQO1、HO-1、GSR mRNA和蛋白表达水平显著下调(P＜0.01)，机体氧化还原平衡被破环。小鼠给药后，与模型组相比，液态制剂的中、高剂量组小鼠肌肉组织中NQO1、HO-1、GSR mRNA和蛋白表达水平显著上调(P＜0.01)。在有效启动内源性非酶类抗氧化物质GSH合成与代谢的同时，Nrf2也能够启动内源性酶类抗氧化防御***，促进HO-1、NQO1等内源性抗氧化酶表达。因此，液态制剂可能通过调节Nrf2信号通路中的HO-1、GSR、NQO1的表达来减少氧化应激和疲劳。
综上，从基因及蛋白的表达可知，液态制剂上调了AMPK、Nrf2、HO-1、NQO1、GSR、PGC-1α和TFAM的表达，下调了GSK3β的表达，AMPK信号通路不仅可调节PGC-1α的表达，还调节了Nrf2的表达，液态制剂对疲劳诱导氧化应激的防护机制如图28所示，表明液态制剂激活了AMPK/PGC-1α和Nrf2两个信号通路，通过能量代谢及氧化应激两个途径共同抵抗疲劳，这也是液态制剂具有协同抗疲劳和协同抗氧化等效果的机理和佐证。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，其特征在于，原料包括：蓝莓果汁40-80份、菠萝果汁10-30份、芒果果汁10-30份以及牛磺酸30-70份、左旋肉碱80-100份、烟酰胺2-6份。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，其特征在于，原料包括：蓝莓果汁60mL、菠萝果汁20mL、芒果果汁30mL以及牛磺酸50mg、左旋肉碱90mg、烟酰胺4mg。
3.根据权利要求1或2所述的一种具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂，其特征在于，所述蓝莓果汁的粒径≤200目，菠萝果汁的粒径≤200目，芒果果汁的粒径≤200目。
4.权利要求1-3任意一项所述的具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
将蓝莓果汁、菠萝果汁、芒果果汁、牛磺酸、左旋肉碱、烟酰胺均匀混合，得到具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂。
5.根据权利要求4所述的具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，其特征在于，所述蓝莓果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对蓝莓进行全果破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的蓝莓加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶；
(3)对步骤(2)处理后的蓝莓浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
6.根据权利要求4所述的具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，其特征在于，所述菠萝果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对菠萝去皮后进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的菠萝加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶；
(3)对步骤(2)处理后的菠萝浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
7.根据权利要求4所述的具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，其特征在于，所述芒果果汁的制备方法包含如下步骤：
(1)对芒果去皮去壳进行破碎；
(2)对经过步骤(1)处理后的芒果加入0.1％的果胶酶在45℃酶解40min，反应结束后将原料加热到85℃持续5min进行灭酶；
(3)对步骤(2)处理后的芒果浆用200目双层滤布进行过滤，再离心10min后脱气30min。
8.根据权利要求5或6或7所述的具有抗氧化抗疲劳功能的液态制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心的转速为4000r/min，脱气所述超声的功率为400W，40kHz。
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