CN113429421B - 一种有机小分子荧光探针的制备方法 - Google Patents

一种有机小分子荧光探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种有机小分子荧光探针的制备方法，利用有机全合成的方法构建制备了一种新型结构荧光探针小分子，属于化学传感技术及荧光成像领域。这种有机小分子荧光探针相对于目前研究较多的苯并双噻二唑结构的荧光探针合成方法简单、易于修饰、结构稳定和荧光量子产率高等优点。

Description

一种有机小分子荧光探针的制备方法
技术领域
本发明提供一种新型近红外二区荧光小分子的制备方法，涉及荧光探针检测技术及荧光成像技术等领域。
背景技术
荧光显微成像技术是当前光学成像技术中最为广泛使用的技术之一，同为荧光成像的近红外荧光活体成像技术在生物医学领域也越来越受关注。传统的荧光成像主要集中在近红外一区(NIR-I)，荧光发射波长范围650—950nm，波长较短(<1000nm)，光子穿透深度较差，成为活体生物医学荧光成像应用的主要障碍。与可见光和NIR-I光相比，波长处在1000— 1700nm，即近红外二区(NIR-II)荧光成像，光可以穿透更深的生物组织，在这个波长窗口的散射光更少。由于NIR-II光具有生物组织穿透更深(约5—20mm)、背景自发荧光减弱和信噪比提高等优势，NIR-II区域新出现的荧光成像越来越受到关注。NIR-II荧光成像中的探针主要有以下几类：稀土元素、纳米材料、碳纳米管、量子点、有机分子聚合物以及有机小分子化合物。
通常，有机近红外二区荧光小分子主要分为三类，第一类是以苯并双噻二唑结构为主体的近红外二区荧光小分子，该探针荧光量子产率高，但探针合成步骤繁琐，合成需要用到毒性较大的锡试剂。第二类是以聚甲基为主体的近红外二区荧光小分子，主要是对近红外一区菁染料探针的延伸，将供电子基团进行替换，但其稳定性差，极易在光照下分解，且量子产率较低。第三类是研究菁染料，在1000-1200nm处有荧光拖尾，荧光量子产率极低，对测试仪器的要求很高。
由此可见，制备高荧光量子产率、合成工艺简单、化学结构稳定、对人体安全且易于修饰的近红外二区荧光小分子，从而进一步扩充近红外二区荧光小分子库，弥补其他类近红外二区荧光小分子在实际使用中的不足，具有很高的科研及临床应用价值。
发明内容
本发明提供了一种近红外二区荧光小分子的制备方法，该方法制备的荧光小分子具有高荧光量子产率、合成工艺简单、化学结构稳定、对人体安全且易于修饰。
为了实现本发明的目的，其具体的技术方案如下：
一种近红外二区荧光小分子F1，其结构为：
Figure GDA0003486227530000021
本发明以
Figure GDA0003486227530000022
为电子受体，以
Figure GDA0003486227530000023
为π桥，以
Figure GDA0003486227530000024
为电子供体，最终构建构建近红外二区探针：
Figure GDA0003486227530000025
其中，电子供体用溴基团，易于进一步对探针进行修饰，二氧噻吩杂环易于稳定小分子的结构。
一种有机小分子荧光探针的制备方法，该方法主要是以萘酰亚胺盐作为强电子受体，以二氧噻吩作为π桥以增加荧光小分子化学结构的稳定性，以N,N-二甲基苯乙烯结构作为电子供体，构建具备D-π-A体系结构的近红外二区荧光小分子。这种有机小分子荧光探针具备合成简单、化学结构稳定且易于修饰和荧光量子产率高等优点，在肿瘤手术导航成像及医学细胞标记领域具有巨大的发展潜力。包括以下工艺步骤：
A、中间体一1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺、催化剂一加入带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至105～125℃，氮气保护下滴加称量的1,3-二溴丙烷，保温反应3～6小时，随后，用乙酸乙酯分次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂及其它低沸点有机成分得到粗产品一，对粗产品一进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合液，得到中间体一M1产品。
B、中间体二M2的合成
将中间体一M1溶解于超干四氢呋喃中，氮气氛中加热45～55℃，随后滴加甲基氯化镁溶液，滴加完毕，升温至60～66℃回流搅拌反应1～3h，将混合料冷却至室温，缓慢滴加稀释后的氟硼酸溶液，控制反应速度，反应完毕，过滤干燥，得中间体二M2产品。
C、中间体三M3的合成
将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量 50～200ppm，得到噻吩醛的二甲苯溶液，将(甲酰基亚甲基)三苯基膦加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～200ppm，所得溶液滴加到所述的噻吩醛的二甲苯溶液，回流反应6～10小时。减压蒸发溶剂得到粗产品二，并将粗产品二在硅胶柱上纯化，用石油醚/二氯甲烷混合物作为洗脱剂，得到白色粉末状二氧噻吩中间体三M3产品。
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入催化剂二，搅拌下依次加入计量的4-乙烯基-N，N-二甲基苯胺和中间体三M3，然后将混合溶液加热至105～135℃，并在氮气保护条件下搅拌反应20～30 小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4 产品。
E、有机小分子荧光探针F1的合成
将称量的中间体二M2和中间体四M4混合于乙醇中，加入催化剂三，在氮气保护下搅拌4～12小时，反应结束后将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，得到的终产物为有机小分子荧光探针F1。
优选的，步骤A中氮气保护下滴加1,3-二溴丙烷后的反应温度为115～125℃。
优选的，在步骤A中，所述的催化剂一为甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、碳酸锂、碳酸钾等中的一种或两种以上的混合物。
优选的，在步骤A中，所述催化剂一为碳酸钾和三乙胺的混合物。
优选的，步骤C中，将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～80ppm。将(甲酰基亚甲基)三苯基膦加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～80ppm。
优选的，步骤D中混合溶液加热至115～135℃。
优选的，步骤D中，所述催化剂二为三苯基膦、三乙胺、3，5-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸锂中的一种或两种以上的混合物。
优选的，在步骤D中，所述催化剂二为三苯基膦和碳酸钾的混合物。
优选的，步骤E中，所述催化剂三为无水氢氧化锂、碳酸锂、碳酸钾等中的一种或两种以上的混合物。
优选的，在步骤E中，所述催化剂三为无水氢氧化锂。
本发明带来的有益技术效果：
1、本发明荧光小分子可用作于NIR-II区域荧光成像的探针。
2、本发明有机小分子荧光探针结构中，接入溴丙基作为电子供体，更有效地降低了分子空间位阻效应且易于进一步对探针进行修饰。
3、本发明的制备方法大大简化了有机小分子荧光探针的工艺合成过程，缩短了产品制备时间，提高了产品产率。
4、本发明的荧光探针对人体安全，荧光探针的荧光量子产率高。
5、本发明中，关键步骤筛选使用有效的催化剂，大大降低反应温度、缩短反应时间的同时，提高了产品产率，同时大大节约能耗及原材料消耗。
6、利用有机全合成的方法制备，这种近红外二区荧光小分子具有了合成步骤简单，易于修饰，化学结构稳定且荧光量子产率高等优点，在肿瘤手术导航成像及医学细胞标记领域具有巨大的发展潜力。
附图说明：
图1是本发明有机小分子荧光探针波长吸收率性能图。
图2是本发明有机小分子荧光探针波长光强性能图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种有机小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
A、中间体一1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺(100.0g,0.59mol)、碳酸钾(10g)加入带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至115℃，氮气保护下滴加称量的1,3-二溴丙烷(240g，1.18mol)，保温反应3.5小时，随后，用乙酸乙酯(1000ml)分两次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂及其它低沸点有机成分得到粗产品一，对粗产品一进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(1：10)的混合液，得到中间体一M1产品157.0g(98.4％)，收率90.1％。
Figure GDA0003486227530000051
B、中间体二M2的合成
将上述中间体一M1(120.0g,0.41mol)溶解于超干四氢呋喃中，氮气氛中加热48℃，随后滴加甲基氯化镁溶液，滴加完毕，升温至66℃回流搅拌反应2h，将混合料冷却至室温，缓慢滴加稀释后质量百分含量为10％的氟硼酸溶液，控制反应速度，反应完毕，过滤干燥，得中间体二M2产品140g(98.2％)，收率为91.5％。
Figure GDA0003486227530000052
C、中间体三M3的合成
将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛(100.0g，0.40mol)加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量80ppm，得到噻吩醛的二甲苯溶液，将(甲酰基亚甲基)三苯基膦(100 g，0.52mol)加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量80ppm，所得溶液滴加到所述的噻吩醛的二甲苯溶液，回流反应6～10小时。减压蒸发溶剂得到粗产品二，并将粗产品二在硅胶柱上纯化，用石油醚/二氯甲烷(2:1，v/v)混合物作为洗脱剂，得到白色粉末状二氧噻吩中间体三M3产品99.0g(95.2％)，收率为85％。
Figure GDA0003486227530000061
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入三苯基膦(10.5g)，K2CO3(12.0g)，搅拌下依次加入计量的4-乙烯基-N，N-二甲基苯胺(120g，0.82mol)和中间体三M3(80g，0.28mol)，然后将混合溶液加热至118℃，并在氮气保护条件下搅拌反应25小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4产品54.0g(96.1％)，产率为53.9％。
Figure GDA0003486227530000062
E、有机小分子荧光探针F1的合成
将称量的中间体二M2(100g,0.27mol)和中间体四M4(50g,0.14mol)混合于乙醇中，加入无水氢氧化锂(120mg)，在氮气保护下搅拌4～12小时，反应结束后将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，得到终产物有机小分子荧光探针F1产品81.3g(96.3％)，产率为81.2％。
Figure GDA0003486227530000063
本实施例得到的有机小分子荧光探针F1的荧光性能，如图1所示，当波长900nm的时候，吸收率为0.45，吸收率达到最大值。如图2所示，当波长1100nm的时候，光强为4000，光强达到最大值。
实施例2
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
A、中间体一M1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺(100.0g,0.59mol)、碳酸钾(10g)加入带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至118℃，氮气保护下滴加称量的1,3-二溴丙烷(240g，1.18mol)，保温反应3.5小时，随后，用乙酸乙酯(1000ml)分两次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂及其它低沸点有机成分，粗产品进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(1：10)的混合液，得到中间体一M1产品158.5g(98.2％)，收率90.9％。
实施例3
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
A、中间体一M1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺(100.0g,0.59mol)、碳酸钾(10g)加入带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至120℃，氮气保护下滴加称量的1,3-二溴丙烷(240g，1.18mol)，保温反应3.5小时，随后，用乙酸乙酯(1000ml)分两次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂及其它低沸点有机成分，粗产品进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(1：10)的混合液，得到中间体一M1产品157.2g(98.7％)，收率90.6％。
实施例4
基于实施例2，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
A、中间体一M1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺(100.0g,0.59mol)、碳酸钾(10g)、三乙胺加入(2g) 带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至118℃，氮气保护下滴加称量的1,3-二溴丙烷(240g， 1.18mol)，保温反应3.5小时，随后，用乙酸乙酯(1000ml)分两次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂及其它低沸点有机成分，粗产品进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(1：10)的混合液，得到中间体一M1产品160.8g(98.1％)，收率92.1％。
实施例5
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
C、中间体三M3的合成
将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛(100.0g，0.40mol)加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50ppm，得到噻吩醛的二甲苯溶液，将(甲酰基亚甲基)三苯基膦(100 g，0.52mol)加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50ppm，所得溶液滴加到所述的噻吩醛的二甲苯溶液，回流反应6～10小时。减压蒸发溶剂，并将粗产物在硅胶柱上纯化，用石油醚/二氯甲烷(2:1，v/v)混合物作为洗脱剂，得到白色粉末状二氧噻吩中间体三M3 产品98.8g(95.7％)，收率为85.5％。
实施例6
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入三苯基膦(10.5g)，K2CO3(12.0g)，搅拌下依次加入计量的4-乙烯基-N，N-二甲基苯胺(120g，0.82mol)和中间体三M3(80g，0.28mol)，然后将混合溶液加热至120℃，并在氮气保护条件下搅拌反应25小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4产品54.7g(96.5％)，产率为54.8％。
实施例7
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入三苯基膦(10.5g)，K2CO3(12.0g)，搅拌下依次加入计量的4-乙烯基-N，N-二甲基苯胺(120g，0.82mol)和中间体三M3(80g，0.28mol)，然后将混合溶液加热至130℃，并在氮气保护条件下搅拌反应25小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4产品54.2g(96.0％)，产率为54.0％。
实施例7
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入三苯基膦(20.5g)，搅拌下依次加入计量的4-乙烯基-N， N-二甲基苯胺(120g，0.82mol)和中间体三M3(80g，0.28mol)，然后将混合溶液加热至130℃，并在氮气保护条件下搅拌反应25小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4产品54.0g(96.3％)，产率为54.0％。
实施例8
基于实施例1，一种有机小分子荧光探针的制备方法，其中步骤：
E、有机小分子荧光探针F1的合成
将称量的中间体二M2(100g,0.27mol)和中间体四M4(50g,0.14mol)混合于乙醇中，加入无水氢氧化锂(100mg)，碳酸锂(100mg)，在氮气保护下搅拌4～12小时，反应结束后将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，得到终产物为有机小分子荧光探针F1产品80.0g(96.1％)，产率为79.7％。
本发明这种有机小分子荧光探针相对于目前研究较多的苯并双噻二唑结构的近红外二区荧光探针合成方法简单、易于修饰、结构稳定和荧光量子产率高等优点，有望将其进一步改性，开发水溶性和光学性质更加优异的新型近红外二区探针，为近红外二区探针在肿瘤手术导航成像及医学细胞标记领域的研究提供一种新的探针家族。
以上所述仅是本发明 的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明 的保护范围。

Claims (10)

1.一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、中间体一M1的合成
将N,N-二甲基甲酰胺、1,8-萘内酰亚胺、催化剂一加入带搅拌的反应釜中，搅拌下加热升温至105～125℃，氮气保护下滴加1,3-二溴丙烷，保温反应3～6小时，随后，用乙酸乙酯分次萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤并加入Na2SO4干燥水分，减压蒸馏出溶剂得到粗产品一，对粗产品一进行硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合液，得到中间体一M1；
B、中间体二M2的合成
将中间体一M1溶解于超干四氢呋喃中，氮气氛中加热45～55℃，随后滴加甲基氯化镁溶液，滴加完毕，升温至60～66℃回流搅拌反应1～3h，将混合料冷却至室温，滴加稀释后的氟硼酸溶液，控制反应速度，反应完毕，过滤干燥，得中间体二M2；
C、中间体三M3的合成
将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～200ppm，得到噻吩醛的二甲苯溶液，将(甲酰基亚甲基)三苯基膦加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～200ppm，所得溶液滴加到所述的噻吩醛的二甲苯溶液，回流反应6～10小时；减压蒸发溶剂得到粗产品二，并将粗产品二在硅胶柱上纯化，用石油醚/二氯甲烷混合物作为洗脱剂，得到白色粉末状二氧噻吩中间体三M3；
D、中间体四M4的合成
向N，N-二甲基甲酰胺中加入催化剂二，搅拌下依次加入4-乙烯基-N，N-二甲基苯胺和中间体三M3，然后将混合溶液加热至105～135℃，并在氮气保护条件下搅拌反应20～30小时，反应结束后将反应溶液用水和二氯甲烷萃取，分离各相，并将合并的有机相用Na2SO4干燥，并将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷为洗脱剂，得到中间体四M4；
E、有机小分子荧光探针F1的合成
将中间体二M2和中间体四M4混合于乙醇中，加入催化剂三，在氮气保护下搅拌4～12小时，反应结束后将溶剂减压蒸发，残余物通过柱色谱法纯化，二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，得到有机小分子荧光探针F1：
Figure FDA0003486227520000011
Figure FDA0003486227520000021
2.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤A中氮气保护下滴加1,3-二溴丙烷后的反应温度为115～125℃。
3.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：在步骤A中，所述催化剂一为甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、碳酸锂、碳酸钾中的一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：在步骤A中，所述催化剂一为碳酸钾和三乙胺的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤C中，将5-溴-2-(3,4-乙烯基双氧噻吩)甲醛加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～80ppm；将(甲酰基亚甲基)三苯基膦加入二甲苯溶液中，回流带水至溶液中水分含量50～80ppm。
6.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤D中混合溶液加热至115～135℃。
7.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤D中，所述催化剂二为三苯基膦、三乙胺、3，5-二甲基吡啶、碳酸钾、碳酸锂中的一种或两种以上的混合物。
8.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：在步骤D中，所述催化剂二为三苯基膦和碳酸钾的混合物。
9.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤E中，所述催化剂三为无水氢氧化锂、碳酸锂、碳酸钾中的一种或两种以上的混合物。
10.根据权利要求1所述的一种有机小分子荧光探针的制备方法，其特征在于：在步骤E中，所述催化剂三为无水氢氧化锂。
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