CN113413463B - 一种纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤疫苗的个性化应用及免疫原性和抗原递送问题，其解决的技术方案是，首先将12‑胺基十二烷酸接枝在透明质酸上，然后在脂肪链另一端修饰L‑半胱氨酸和聚乙烯亚胺制备成纳米载体，之后，利用网膜过滤将肿瘤细胞制备成纳米级的肿瘤细胞膜包裹的全抗原囊泡，在与载体通过静电压缩时于脂肪链形成的疏水层中负载黏膜免疫佐剂全反式维甲酸制备成具有“核‑壳”结构的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗，本发明制备方法简单，原料广泛，能够激发特异性免疫和非特异性免疫，大大提高了肿瘤疫苗的效果，是个性化肿瘤疫苗上的创新。

Description

一种纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤作为世界性的公共健康问题始终威胁着人类的生命安全。肿瘤疫苗通过激活患者免疫***自发对肿瘤产生杀伤和长久监控，是一种非常具有前景的治疗方案。然而，由于肿瘤在发生发展过程中具备的强特异性，普适的治疗方法受限于人白细胞抗原限制性以及肿瘤特异性和非特异性抗原的表达差异，往往难以达成令人满意的治疗效果（Seminarsin Immunology，2010，22：132）。因此，理想的肿瘤疫苗应该针对不同患者提出个性化的治疗策略，为了制备有效的个性化疫苗，如何选取合适的抗原和佐剂以同时达成广泛的特异和非特异性免疫，并且实现高效的抗原递送是最大的难题。
通过网膜过滤技术能够将自体肿瘤细胞制备成纳米级的由肿瘤细胞膜包被的全抗原囊泡（拟肿瘤细胞ITCs），涵盖广泛的T细胞表位且具备个性化特征，能够激活充分的特异性抗肿瘤免疫。趋化性细胞因子受体9（CCR9）是肠道特异性的归巢受体，能够特异性地识别靶向小肠上皮细胞中的趋化因子配体25，这一环节支撑了机体的胃肠道免疫，通常这一归巢受体表达于胃肠道树突状细胞（DC）上并限制在胃肠道的肠系膜***或派氏结中，而最近的研究发现，胃肠道DCs的分泌物全反式维甲酸（RA）能够通过受体信号介导在体外对免疫细胞进行CCR9标记，因此在肠道外应用外源性RA有可能增加胃肠道的免疫细胞分布从而促进全身免疫（Advanced Materials，2018，30：1801067），透明质酸（HA）是一种天然的线性高分子多糖，在人体内广泛分布，根据先前的研究，HA受体CD44在DC表面高表达，且作为T细胞激活的共刺激因子发挥着重要作用（Journal of Immunotherapy，2004，27：1），基于HA构建纳米疫苗有望促进抗原在DC中的内化并协同促进DC成熟，激活CD8+ T细胞免疫应答，基于上述制备的疫苗能够将个性化全肿瘤抗原协同黏膜免疫佐剂协同靶向递送至树突状细胞，并促进其成熟和胃肠道分布，激活机体特异性、非特异性免疫，从而达成长久的抗肿瘤免疫，但至今未见有类似的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤疫苗的个性化应用及免疫原性和抗原递送问题。
本发明解决的技术方案是，该纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法为，首先将12-胺基十二烷酸接枝在透明质酸上，然后在脂肪链另一端修饰L-半胱氨酸和聚乙烯亚胺制备成纳米载体，之后，利用网膜过滤将肿瘤细胞制备成纳米级的肿瘤细胞膜包裹的全抗原囊泡，在与载体通过静电压缩时于脂肪链形成的疏水层中负载黏膜免疫佐剂全反式维甲酸制备成具有“核-壳”结构的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗，透明质酸外壳靶向定位于树突状细胞，高效递送个性化肿瘤抗原和黏膜佐剂形成抗肿瘤免疫。
该制备方法具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA（一元弱酸）0.1500-0.5000g溶于15-40mL的甲酰胺中，加入0.0690-0.2890g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.0420-0.1690g的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温（23℃±2℃ ）、氮气保护避光搅拌反应4-6h，加入0.1800-0.5970g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2-3d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸（HA-C12）；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.1510-0.5000g的L-Cys（左旋半胱氨酸）溶于10-30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.1510-0.5892g EDC和0.1400-0.3017gNHS，活化1-2h，加入0.2500-0.8000g HA-C12，N2保护反应5-6h，去离子水透析2-3d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸（HA-C-Cys）；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1500-0.5000g溶于10-30mL去离子水和5-10mLpH 9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.5000-1.7640g的PEI溶于400-600μL的3.7%-4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应36-48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥得纳米载体（HTCP）；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3-15mL密度为1.0×107/mL的肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1-2h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2-3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3-4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.1-1.0mg HTCP溶于0.5-1.0mL PBS中，加入2.5-12.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5-52.5μg的RA溶液，于10000-12000rpm下离心15-20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗（HTCP/ITCs/RA）。
本发明方法制备的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗有效用于制备各种个性化的实体肿瘤疫苗，实现纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗在对抗癌症中的应用。
本发明通过网膜过滤技术将肿瘤细胞制备成纳米级拟肿瘤细胞，制备方法简单，原料广泛，能够激发特异性免疫和非特异性免疫，大大提高了肿瘤疫苗的效果，是个性化肿瘤疫苗上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.1500g溶于15mL的甲酰胺中，加入0.0690g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.0420g的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温、氮气保护避光搅拌反应4h，加入0.1800g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸（HA-C12）；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.1510g的L-Cys溶于10mL的超纯水中，调节pH5，加入0.1510g EDC和0.1400g NHS，活化1h，加入0.2500g HA-C12，N2保护反应5h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸（HA-C-Cys）；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1500g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.5000g的PEI溶于400μL的3.7%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2d，冷冻干燥得纳米载体（HTCP）；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3mL密度为1.0×107/mL的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.2mg HTCP溶于500μL PBS中，加入2.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5μg的RA溶液，于12000rpm下离心15min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗（HTCP/ITCs/RA）。
实施例2
本发明在具体实施中，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.3000g溶于30mL的甲酰胺中，加入0.1440g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.0910g的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温、氮气保护避光搅拌反应5h，加入0.3600g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸（HA-C12）；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.3011g的L-Cys溶于30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.3020g EDC和0.2807g NHS，活化1h，加入0.5000 g HA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸（HA-C-Cys）；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.3000g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取1.1028g的PEI溶于400μL的4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析3d，冷冻干燥得纳米载体（HTCP）；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3mL密度为1.0×107/mL的MCF-7人源乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1.5h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.2mg HTCP溶于500μL PBS中，加入2.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5μg的RA溶液，于10000rpm下离心20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗（HTCP/ITCs/RA）。
实施例3
本发明在具体实施中，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.2000g溶于30mL的甲酰胺中，加入0.0997g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.0670g的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温、氮气保护避光搅拌反应4h，加入0.1800g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸（HA-C12）；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.2000g的L-Cys溶于10mL的超纯水中，调节pH5，加入0.2000g EDC和0.1900g NHS，活化1h，加入0.2500g HA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸（HA-C-Cys）；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1510g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.4000g的PEI溶于400μL的3.7%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应36h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2d，冷冻干燥得纳米载体（HTCP）；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将2mL密度为1.0×107/mL的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2次，然后经200nm聚醚砜膜过膜4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.1mg HTCP溶于500μL PBS中，加入1.25mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入5.3μg的RA溶液，于12000rpm下离心15min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗（HTCP/ITCs/RA）。
实施例4
本发明在具体实施中，具体包括以下步骤：
1）透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.5000g溶于40mL的甲酰胺中，加入0.2890g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和0.1690g的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温、氮气保护避光搅拌反应6h，加入0.5970g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析3d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸（HA-C12）；
2）透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.5000g的L-Cys溶于30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.5892g EDC和0.3017g NHS，活化2h，加入0.8000g HA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析3d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸（HA-C-Cys）。
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.5000g溶于30mL去离子水和10mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取1.7640g的PEI溶于600μL的4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析3d，冷冻干燥得纳米载体（HTCP）；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将15mL密度为1.0×107/mL的MCF-7人源乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射2h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2次，然后经200nm聚醚砜膜过膜4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取1.0mg HTCP溶于1mL PBS中，加入12.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入52.5μg的RA溶液，于12000rpm下离心20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗（HTCP/ITCs/RA）。
本发明采用能够与树突状细胞表面高表达的CD44受体结合的透明质酸作为靶向树突状细胞的材料，在透明质酸上接枝碳十二长链、L-半胱氨酸和聚乙烯亚胺制备成纳米载体；通过网膜过滤方法将肿瘤细胞制备成纳米级拟肿瘤细胞作为激活特异性免疫的个性化抗原，利用静电作用将抗原压缩成内核，透明质酸在脂肪链带动下包裹形成外壳，脂肪链形成的疏水层用于负载黏膜免疫佐剂全反式维甲酸得到纳米拟细胞疫苗；制备的纳米疫苗粒径在200-300nm之间；该疫苗具有以下特点：1）该疫苗的透明质酸外壳具有树突状细胞靶向作用，提高抗原递送效率；2）该疫苗同时高效负载个性化抗原和黏膜免疫佐剂，激发机体特异和非特异性免疫；3）所制备的疫苗具有生物相容性，用途广泛。
本发明所使用的透明质酸是一种人体内源性的多糖，具有良好的生物安全性，同时具有树突状细胞靶向和激活作用，是一种很好的疫苗制备材料，所制备的拟肿瘤细胞抗原能很好被载体压缩负载，制备简便，包含全部的个性化肿瘤抗原表位，全反式维甲酸能够促进树突状细胞的胃肠道迁移，增强疫苗的抗肿瘤免疫能力，所制备的纳米拟细胞疫苗在靶向到达树突状细胞后，递送个性化抗原及佐剂，并刺激树突状细胞成熟，达成有效的抗肿瘤免疫活性，相关实验资料如下（以实施例1为例）：
实验1：体外抗原递送实验
从小鼠骨髓中提取分化出了骨髓源树突状细胞（BMDCs），考察HTCP/ITCs/RA被BMDCs摄取的能力，处理24h之后，单独的ITCs仅有26.8%被BMDCs摄取，而经HTCP包载后，摄取效率达到了59.3%，这表明疫苗***表面的CD44能够与DCs上的受体结合，起到靶向与增加摄取的作用。
实验2：体外树突状细胞成熟实验
通过抗体荧光标记流式考察了HTCP/ITCs/RA对BMDCs熟化的作用，经由疫苗***处理过的BMDCs，其表面CD86表达量明显上升，达到54.7%，甚至高于脂多糖处理的阳性对照组，而单独的ITCs以及载体对照HTCP/Lipo也有一定的效果但显著低于疫苗***组，结果显示疫苗递送***HTCP/ITCs/RA能够促进BMDCs的熟化。
实验3：小鼠肿瘤模型
将30只4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组，分别为生理盐水组NC、载体组HTCP/Lipo、拟肿瘤细胞组ITCs、载体佐剂组HTCP/Lipo/RA、拟肿瘤细胞递送组HTCP/ITCs以及最终疫苗组HTCP/ITCs/RA，在小鼠右侧腹股沟处进行皮下疫苗接种（WpITCs=100μg/只，WHTCP:WpITCs=1:5，WRA=0.42μg/只），每7天接种一次，共接种3次。最后一次接种3天后，将对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞以1×106个/只皮下移植至小鼠左侧腹股沟处。肿瘤监测期间每2天测量小鼠皮下肿瘤的长（L，mm）)和宽（W，mm），计算肿瘤体积（V=1/2×L×W2）。肿瘤监测14天后，脱颈处理小鼠，剥离肿瘤组织，称量并计算抑瘤率。肿瘤组织经脱蜡、染色、脱水、透明、封固后进行组织病理学分析。剖离小鼠肺脏，通过Bouin’s染液进行染色，统计肺转移灶数目。
结果显示纳米疫苗HTCP/ITCs/RA组的小鼠瘤体积始终低于对照组，且最后一天时瘤体积差距明显，而HTCP/ITCs组同样显示出显著的瘤体积减小，但显著高于疫苗***组，说明RA引起的胃肠道免疫激活在肿瘤抑制中起到了作用，而HTCP/Lipo/RA组可能由于缺少有效抗原没有显示出明显的肿瘤抑制，HTCP/ITCs和HTCP/ITCs/RA组肿瘤抑制率分别达到66.81%和80.11%，显示出强大的肿瘤抑制作用；HTCP/ITCs/RA组的肺转移灶数目显著低于其余各组，说明疫苗***引起的全身抗肿瘤免疫大大抑制了肿瘤的转移能力，而HTCP/Lipo/RA组同样效果显著，进一步说明了RA引起的胃肠道免疫在抗转移上的意义。
实验4：小鼠体内免疫激活作用
选取实验3中各组小鼠，肿瘤监测14天后，处理小鼠并剖离右侧腹股沟***并称重，经研磨和细胞筛网过滤制成单细胞悬液，经CD11c-PE和CD86-APC抗体染色后进行流式细胞术分析，剖离小鼠肠道派氏结制成单细胞悬液，经CD11c-PE和CCR9-FITC抗体染色后进行流式细胞术分析，剖离脾脏和胸腺并称重，脾脏制成单细胞悬液，使用淋巴分离液分离出淋巴细胞，按照40:1的效靶比与4T1细胞共培养，6h后通过MTT法测定脾淋巴细胞对4T1细胞的抑制率。
结果显示，经皮下接种HTCP/ITCs/RA的小鼠腹股沟***内树突状细胞熟化程度、肠道派氏结内树突状细胞CCR9表达率、脾脏淋巴细胞对4T1的杀伤能力都远远高于NC组，表明该纳米疫苗能有效激活机体抗肿瘤免疫。
在对实施例1实验的同时，还对其余实施例进行了相同实验，均与该结果一致或近似，在此不一一举例。
本发明将HA与阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过碳十二长链连接，通过静电作用将个体拟肿瘤细胞压缩成内核，HA在脂肪长链带动下包裹在周围形成外壳，脂肪长链形成的疏水层用于负载黏膜佐剂RA，制备成具备“核-壳”结构的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗，实验表明，本发明相对于现有技术具有如下突出的特点和有益效果：
1、能够靶向树突状细胞，提高抗原的递送效率；
2、能够同时递送个性化抗原和黏膜免疫佐剂，激发机体特异和非特异性免疫；
3、具有良好的生物相容性及安全性，应用范围广，可有效用于制备针对各种实体肿瘤的个性化疫苗，开拓了个性化治疗在肿瘤疫苗领域的新应用，有显著的经济和社会效益。

Claims (6)

1.一种纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，首先将12-胺基十二烷酸接枝在透明质酸上，然后在脂肪链另一端修饰L-半胱氨酸和聚乙烯亚胺制备成纳米载体，之后，利用网膜过滤将肿瘤细胞制备成纳米级的肿瘤细胞膜包裹的全抗原囊泡，在与载体通过静电压缩时于脂肪链形成的疏水层中负载黏膜免疫佐剂全反式维甲酸制备成具有“核-壳”结构的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗；具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.1500-0.5000g溶于15-40mL的甲酰胺中，加入0.0690-0.2890g EDC和0.0420-0.1690g NHS，室温、氮气保护避光搅拌反应4-6h，加入0.1800-0.5970g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2-3d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸HA-C12；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.1510-0.5000g的L-Cys溶于10-30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.1510-0.5892g EDC和0.1400-0.3017g NHS，活化1-2h，加入0.2500-0.8000g HA-C12，N2保护反应5-6h，去离子水透析2-3d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸HA-C-Cys；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1500-0.5000g溶于10-30mL去离子水和5-10mLpH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.5000-1.7640g的PEI溶于400-600μL的3.7%-4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应36-48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2-3d，冷冻干燥得纳米载体HTCP；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3-15mL密度为1.0×107/mL的肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1-2h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2-3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3-4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.1-1.0mg HTCP溶于0.5-1.0mL PBS中，加入2.5-12.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5-52.5μg的全反式维甲酸溶液，于10000-12000rpm下离心15-20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗。
2.根据权利要求1所述的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.1500g溶于15mL的甲酰胺中，加入0.0690gEDC和0.0420g NHS，室温、氮气保护避光搅拌反应4h，加入0.1800g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸HA-C12；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.1510g的L-Cys溶于10mL的超纯水中，调节pH5，加入0.1510g EDC和0.1400g NHS，活化1h，加入0.2500g HA-C12，N2保护反应5h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸HA-C-Cys；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1500g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.5000g的PEI溶于400μL的3.7%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2d，冷冻干燥得纳米载体HTCP；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3mL密度为1.0×107/mL的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.2mg HTCP溶于500μL PBS中，加入2.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5μg的全反式维甲酸溶液，于12000rpm下离心15min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗。
3.根据权利要求1所述的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.3000g溶于30mL的甲酰胺中，加入0.1440g的EDC和0.0910g的NHS，室温、氮气保护避光搅拌反应5h，加入0.3600g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸HA-C12；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.3011g的L-Cys溶于30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.3020g EDC和0.2807g NHS，活化1h，加入0.5000g HA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸HA-C-Cys；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.3000g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取1.1028g的PEI溶于400μL的4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析3d，冷冻干燥得纳米载体HTCP；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将3mL密度为1.0×107/mL的MCF-7人源乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1.5h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜3次，然后经200nm聚醚砜膜过膜3次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.2mg HTCP溶于500μL PBS中，加入2.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入10.5μg的全反式维甲酸溶液，于10000rpm下离心20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗。
4.根据权利要求1所述的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）制备透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.2000g溶于30mL的甲酰胺中，加入0.0997gEDC和0.0670g NHS，室温、氮气保护避光搅拌反应4h，加入0.1800g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸HA-C12；
2）制备透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.2000g的L-Cys溶于10mL的超纯水中，调节pH5，加入0.2000g EDC和0.1900g NHS，活化1h，加入0.2500gHA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析2d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸HA-C-Cys；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.1510g溶于10mL去离子水和5mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取0.4000g的PEI溶于400μL的3.7%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应36h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析2d，冷冻干燥得纳米载体HTCP；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将2mL密度为1.0×107/mL的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射1h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2次，然后经200nm聚醚砜膜过膜4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取0.1mg HTCP溶于500μL PBS中，加入1.25mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入5.3μg的全反式维甲酸溶液，于12000rpm下离心15min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗。
5.根据权利要求1所述的纳米拟细胞个性化肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）透明质酸接枝碳十二链：称取HA 0.5000g溶于40mL的甲酰胺中，加入0.2890g EDC和0.1690g NHS，室温、氮气保护避光搅拌反应6h，加入0.5970g的12-胺基十二烷酸，室温、避光搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量为8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，透析3d，冷冻干燥得接枝碳十二链的透明质酸HA-C12；
2）透明质酸碳十二链接枝半胱氨酸：称取0.5000g的L-Cys溶于30mL的超纯水中，调节pH5，加入0.5892g EDC和0.3017g NHS，活化2h，加入0.8000g HA-C12，N2保护反应6h，去离子水透析3d，冷冻干燥得接枝碳十二链和半胱氨酸的透明质酸HA-C-Cys；
3）制备纳米载体：称取HA-C-Cys 0.5000g溶于30mL去离子水和10mL pH9.18的硼酸缓冲溶液中，称取1.7640g的PEI溶于600μL的4.0%盐酸中，随后缓慢逐滴加入所述含HA-C-Cys的溶液中，室温，氮气保护和避光条件下搅拌反应48h，将反应液转移至截留分子量8×103Da-1.4×104Da的透析袋中透析，用去离子水透析3d，冷冻干燥得纳米载体HTCP；
4）制备纳米拟肿瘤细胞抗原：将15mL密度为1.0×107/mL的MCF-7人源乳腺癌肿瘤细胞PBS悬液在紫外灯下照射2h，随后将其先经800nm聚醚砜膜过膜2次，然后经200nm聚醚砜膜过膜4次，得到拟肿瘤细胞抗原；
5）制备纳米拟细胞疫苗：称取1.0mg HTCP溶于1mL PBS中，加入12.5mL拟肿瘤细胞悬液，同时逐滴加入52.5μg的全反式维甲酸溶液，于12000rpm下离心20min，收集沉淀得到纳米拟细胞疫苗。
6.权利要求1所述的制备方法制备的纳米拟细胞疫苗在制备个性化的实体抗肿瘤疫苗中的应用。
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