CN111407897B - 基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒及其制备方法和在构建肿瘤疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将荧光染料与亲和素按照一定质量比混合，搅拌反应过夜，再加入考马斯亮蓝搅拌反应，超滤或透析除去杂质，用缓冲溶液分散获得亲和素纳米粒子。该亲和素纳米粒子尺寸均匀适中，可共同装载特定比例的肿瘤相关抗原与核酸类免疫激动剂以构建肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗不仅可特异性靶向***，生物相容性好，毒副作用小，且在相应的肿瘤抗原高表达的肿瘤治疗中具有显著疗效。

Description

基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒及其制备 方法和在构建肿瘤疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及新型有机纳米材料，尤其是应用在生物医疗领域的纳米材料，具体是一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒的制备方法及其在构建肿瘤疫苗中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的疾病之一。近年来除了通过抗原-抗体结合这一类靶向药外，另一类更为“攻防兼备”的主动免疫治疗方式-肿瘤疫苗成为了免疫治疗中炙手可热的研究领域，给广大的肿瘤患者带来希望的曙光。
肿瘤疫苗是通过利用肿瘤细胞特异性抗原或相关抗原，来唤醒人体免疫***对抗癌症，诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。这些抗原包括肿瘤相关蛋白和多肽、肿瘤细胞裂解物以及表达肿瘤抗原的基因等。与被动的免疫治疗方法不同，肿瘤疫苗是一种主动对抗肿瘤细胞的免疫治疗方法，不仅能产生针对特异性抗原的杀伤性T细胞；且还能引发患者产生长期免疫记忆，预防肿瘤的复发和转移。
目前肿瘤疫苗的开发仍然面临着许多挑战，如与肿瘤相关的抗原蛋白并非完全的“异己”，因此免疫原性低，难以产生强烈的免疫应答导致其治疗效果有限。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于荧光染料与考马斯亮蓝结合的亲和素纳米粒的制备方法，用于共同装载肿瘤相关抗原与核酸类免疫激动剂，解决了现有纳米肿瘤疫苗存在问题。
本发明提供一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将荧光染料与亲和素按照一定质量比混合，搅拌反应过夜，再加入考马斯亮蓝搅拌反应，超滤或透析除去杂质，用缓冲溶液分散获得亲和素纳米粒子。
其中，荧光染料与亲和素的质量比为1：10～100，所述考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：10～100。
优选地，荧光染料与亲和素的质量比为1：40，所述考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：25。
优选地，荧光染料为Cy3-NHS、Cy5.5-NHS、Cy7-NHS中的一种；所述亲和素选用链霉素亲和素，鸡蛋白亲和素，中性亲和素的一种；所述考马斯亮蓝为R250或G250。
另一方面，一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒在构建肿瘤疫苗中的应用，具体将肿瘤抗原与亲和素纳米粒在低温下混合搅拌以装载肿瘤抗原，后加入核酸类免疫激动剂装载制备而得肿瘤疫苗。
其中，肿瘤抗原与亲和素纳米粒的质量比为1：5～100。
其中，核酸类免疫激动剂与亲和素纳米粒的质量比为1:10～250。
优选地，每毫克亲和素纳米粒上装载有20μg肿瘤抗原以及8μg核酸类免疫激动剂。
优选地，肿瘤抗原和核酸类免疫激动剂均经过生物素修饰，CpG的序列如下：5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。
采用本发明所提供的一种基于荧光染料与考马斯亮蓝结合制备的亲和素纳米粒，尺寸均匀合适，利用亲和素纳米粒子可共同装载肿瘤相关抗原与核酸类免疫激动剂制备肿瘤疫苗，不仅可特异性靶向***，提高免疫激活效率，生物相容性好，毒副作用小；且在相应的肿瘤抗原高表达的肿瘤治疗中具有显著疗效。本亲和素纳米粒子在生物医学方面具有非常重要的科学意义和潜在应用价值。
附图说明
图1为实施例一的基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合制备的亲和素纳米粒(Cy5.5-Avidin-G250)的透射电镜TEM图及粒径分散图；
图2为实施例二的不同比例的亲和素纳米粒共载卵清蛋白(OVA)后的Cy5.5-Avidin-G250-OVA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图3为实施例二亲和素纳米粒装载卵清蛋白(OVA)后(亲和素与OVA比例为50:1)，再装载核酸类激动剂(CpG)的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图4为实施例二的基于亲和素纳米粒共载卵清蛋白(OVA)及核酸类激动剂(CpG)后的肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG的透射电镜TEM图及粒径分散图；
图5为基于亲和素纳米粒共载卵清蛋白(OVA)及核酸类激动剂(CpG)后的肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG对小鼠***的靶向作用效果图；
图6为基于亲和素纳米粒共载卵清蛋白(OVA)及核酸类激动剂(CpG)后的肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG刺激DC细胞表达CD80与CD86的效果图；
图7为纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)促进小鼠分泌特异性抗OVA免疫球蛋白G(IgG)的效果图；
图8为纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)对表达OVA的B16黑色素瘤小鼠模型治疗15天后的肿瘤体积测量图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中涉及到的荧光染料、考马斯亮蓝、亲和素、肿瘤抗原和核酸类激动剂等原料均可购买获得，其中CpG的序列为：5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。
实施例一：基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合制备的亲和素纳米粒(Cy5.5-Avidin-G250)的制备方法
先取1mg链霉素亲和素(streptavidin)用1mL磷酸缓冲盐溶液PBS溶解，加入5μL荧光染料Cy5.5-NHS溶液(5mg/mL，DMSO)在4℃搅拌过夜，再加入8μL考马斯亮蓝G250溶液(5mg/mL,DMSO)搅拌2h，产物用截留分子量50KD的超滤管超滤除去杂质，最终用1mL PBS分散获得Cy5.5-Avidin-G250纳米粒，通过透射电镜TEM和粒度分散仪测试结果如图1，平均粒径为34.75nm，分布比较窄(10-100nm)。
在另外的实施例中，荧光染料与亲和素的质量比为1：100，考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：10。
在另外的实施例中，荧光染料与亲和素的质量比为1：10，考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：100。
实施例二：亲和素纳米粒(Cy5.5-Avidin-G250)装载肿瘤抗原(Bio-OVA)及核酸类激动剂(Bio-CpG)制备肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)的方法
取60μL肿瘤抗原Biotin-OVA(1mg mL-1)，加入66μL PBS缓冲溶液以及150μLCy5.5-Avidin-G250(2mg mL-1)混匀，在4℃放置30min，即得Cy5.5-Avidin-G250-OVA，再往反应液中加入24μL核酸类激动剂Biotin-CpG(1mg mL-1)，混匀，在4℃放置30min，即得肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG，经称重计算每1mg亲和素纳米粒上装载有20μg OVA以及8μg CpG。
本实施例制备得到的基于亲和素纳米粒共载卵清蛋白(OVA)及核酸类激动剂后的肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG的透射电镜TEM和粒度分散仪测试结果如图4，平均粒径为41.78nm。
在另外实施例中，所加入亲和素纳米粒与肿瘤抗原的质量比为5：1，亲和素纳米粒与核酸类免疫激动剂的质量比为10：1。
在另外实施例中，所加入亲和素纳米粒与肿瘤抗原的质量比为100：1，亲和素纳米粒与核酸类免疫激动剂的质量比为250：1。
如图2的结果说明，当亲和素纳米粒与肿瘤抗原的质量比大于或等于2.6：1时，肿瘤抗原完全装载；在此条件下，当亲和素纳米粒与核酸激动剂的质量比大于或等于4：1时，核酸类免疫激动剂完全装载(如图3)。本实施例二中，亲和素纳米粒与肿瘤抗原的质量比为50：1，在肿瘤抗原完全被亲和素纳米粒结合，再结合核酸免疫激动剂，亲和素纳米粒与免疫激动剂比例为125：1，因此核酸类激动剂也完全与亲和素纳米粒结合。
实施例三：亲和素纳米粒(Cy5.5-Avidin-G250)装载表皮生长因子2(Biotin-ERBB2)及核酸类激动剂(Bio-CpG)制备肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-ERBB2-CpG)的方法
取60μL肿瘤抗原Biotin-ERBB2(1mg mL-1)，加入66μL PBS以及150μL Cy5.5-Avidin-G250纳米粒溶液(2mg mL-1)，混匀，在4℃放置30min，即得Cy5.5-Avidin-G250-ERBB2，再往反应液中加入24μL Biotin-CpG(1mg mL-1)，混匀，在4℃放置30min，即得肿瘤疫苗
Cy5.5-Avidin-G250-ERBB2-CpG。
实施例四：基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合制备的亲和素纳米粒(Cy7-Avidin-R250)的制备方法
先取1mg链霉素亲和素用1mL磷酸缓冲盐溶液PBS溶解，加入10μL荧光染料Cy7-NHS溶液(5mg/mL，DMSO)在4℃搅拌过夜，再加入8μL考马斯亮蓝R250溶液(10mg/mL,DMSO)搅拌2h，产物用截留分子量50KD的超滤管超滤除去杂质，最终用1mL PBS分散获得Cy7-Avidin-R250纳米粒。
实施例五：基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合制备的亲和素纳米粒(Cy3-Avidin-R250)的制备方法
先取1mg链霉素亲和素用1mL磷酸缓冲盐溶液PBS溶解，加入10μL荧光染料Cy7-NHS溶液(5mg/mL，DMSO)在4℃搅拌过夜，再加入8μL考马斯亮蓝R250溶液(10mg/mL，DMSO)搅拌2h，产物用截留分子量50KD的超滤管超滤除去杂质，最终用1mL PBS分散获得Cy7-Avidin-R250纳米粒。
实施例六：纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)在肿瘤免疫治疗中的应用
(1)纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)在***的靶向作用
挑取5-7周龄C57BL/6雌性小鼠，从后足垫皮下注射100μg Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG(以Avidin计)，6h后杀死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾以及腿部***，用活体小动物成像***如图5，分析各器官中荧光染料Cy5.5的荧光强度，可见***中荧光最强，说明本纳米肿瘤疫苗可靶向至***。
(2)纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)在刺激树突状细胞(DCs)表达CD80与CD86
将骨髓来源DCs种植于96孔板中，(每孔10万个细胞)，Cy5.5-Avidin-G250NPs(50μg mL-1Avidin)，OVA(1μg mL-1OVA)，CpG(0.4μg mL-1CpG)，Cy5.5-Avidin-G250-OVA NPs(50μg mL-1Avidin以及1μg mL-1OVA)，Cy5.5-Avidin-G250-CpG(50μg mL-1Avidin以及0.4μg mL- 1CpG)，Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG(50μg mL-1Avidin，1μg mL-1OVA以及0.4μg mL-1CpG)分别与BMDCs孵育24小时，分别收集细胞，细胞表面的共刺激分子(CD80，CD86)的表达采用流式细胞技术分析结果如图6和表1，说明纳米肿瘤疫苗Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG刺激DCs表达CD80与CD86效果最佳。
表1 不同药品刺激DCs表达CD80与CD86的效果
Figure BDA0002426746330000071
(3)纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)促进小鼠产生特异性抗体
挑取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分成四组：空白组，OVA组，OVA+CpG组，Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG组，后足垫皮下注射对应的药物：20μg OVA，8μg CpG，Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG(含20μg OVA以及8μg CpG)，每周一次，共两次。第14天小鼠摘眼球收集血，离心取血清，用Elisa测定血清中抗OVA IgG的表达如图7和表2，可见经Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG处理可显著增加血清中抗OVA的IgG的表达。
表2 不同药物促进小鼠特异性抗OVA的IgG结果
Figure BDA0002426746330000072
(4)纳米肿瘤疫苗(Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG)对小鼠黑色素瘤的治疗效果
挑取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，分成四组：Blank，OVA，OVA+CpG，Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG组，第0天皮下注射106个B16-OVA肿瘤细胞，待第5天长出肉眼可见的肿瘤时，后足垫皮下注射对应的药物：空白组、OVA组(20μg)，OVA(20μg)+CpG(8μg)组，Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG组(含20μg OVA以及8μg CpG)，每周一次，共两次。用肿瘤测量***(TM900，Peira)监测肿瘤大小的变化如图8，并记录小鼠存活情况如表3。可见Cy5.5-Avidin-G250-OVA-CpG明显抑制肿瘤生长，提高小鼠存活率。
表3 不同药品对小鼠黑色素瘤的治疗效果
Figure BDA0002426746330000081
综上所述，采用本发明所提供的亲和素纳米粒子，尺寸均匀合适，利用亲和素纳米粒子可共同装载肿瘤相关抗原与核酸类免疫激动剂制备肿瘤疫苗，不仅可特异性靶向***，生物相容性好，毒副作用小，且在相应的肿瘤抗原高表达的肿瘤治疗中具有显著疗效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将荧光染料与亲和素按照一定质量比混合，搅拌反应过夜，再加入考马斯亮蓝搅拌反应，超滤或透析除去杂质，用缓冲溶液分散获得亲和素纳米粒子，所述荧光染料与亲和素的质量比为1：40，所述考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：25，每毫克所述亲和素纳米粒装载有20μg肿瘤抗原以及8μg核酸类免疫激动剂。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒的制备方法，其特征在于，所述荧光染料为Cy3-NHS、Cy5.5-NHS、Cy7-NHS中的一种；所述亲和素选用链霉素亲和素，鸡蛋白亲和素，中性亲和素的一种；所述考马斯亮蓝为R250或G250。
3.一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒，根据权利要求1或2所述的方法制备而得。
4.一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒在构建肿瘤疫苗中的应用，其特征在于，将肿瘤抗原与亲和素纳米粒在低温下混合搅拌以装载肿瘤抗原，后加入一定比例核酸类免疫激动剂装载制备而得肿瘤疫苗，所述亲和素纳米粒中荧光染料与亲和素的质量比为1：40，考马斯亮蓝与亲和素的质量比为1：25，所述肿瘤疫苗中每毫克亲和素纳米粒装载有20μg肿瘤抗原以及8μg核酸类免疫激动剂。
5.权利要求4所述的一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒在构建肿瘤疫苗中的应用，其特征在于，所述肿瘤抗原和核酸类免疫激动剂均经过生物素修饰，CpG的序列为：5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’。
CN202010223065.8A 2020-03-26 2020-03-26 基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的亲和素纳米粒及其制备方法和在构建肿瘤疫苗中的应用 Active CN111407897B (zh)

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