CN113412266A - D-阿洛酮糖晶体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备D‑阿洛酮糖晶体的方法，基于整个晶体的100％(w/w)，所述D‑阿洛酮糖晶体包含98％(w/w)或更多的D‑阿洛酮糖，以及0.05％(w/w)或更低的乙醇。所述制备方法包括第一步，将含有D‑阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合，以及第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D‑阿洛酮糖晶体的糖膏。因此，本发明可以提高从D‑阿洛酮糖晶体溶液获得的D‑阿洛酮糖晶体的产率，并制备用于大规模生产的具有足够尺寸和适当的形状的D‑阿洛酮糖晶体，并且没有不良味道/气味。
Description
技术领域
本发明涉及一种从含有D-阿洛酮糖的溶液中以高产率制备D-阿洛酮糖晶体的方法。
背景技术
已知D-果糖(D-fructose)的差向异构体D-阿洛酮糖(Pscicose)为一种稀有糖，还是一种功能性糖，并且已知其的热值几乎为零，同时表现出高甜度，为食糖甜度的约60％至70％，使其能够有效地预防和改善糖尿病。此外，已知D-阿洛酮糖具有优秀的溶解性，并且是一种因在食品中使用而受到关注的材料。在含有生成的D-阿洛酮糖的差向异构化反应溶液中，D-阿洛酮糖固含量为约20％(w/w)至30％(w/w)，纯度低。为了从上述溶液中制备98％或更高纯度的D-阿洛酮糖晶体制剂，需要分离和纯化技术，例如色谱法和结晶技术。通常，结晶糖类的方法的原理为在过饱和状态下诱导晶体在介稳区(metastable zone)(饱和浓度和晶体自发沉淀的最低过饱和浓度之间的范围)内的生长。D-阿洛酮糖具有这样的特征，即使在这样的过饱和浓度范围内，晶体的生成和晶体生长速率几乎没有变化。因此，D-阿洛酮糖可以被归类为具有不利于粒径生长结晶条件的糖类。
在介稳区的浓度下，没有发生例如晶体成核(crystal nucleation)等结晶现象，但从外部加入新的晶体时，发生晶体生长(crystal growth)，晶体尺寸增大。即，为了生成晶体，当晶种(seed)被添加到饱和或高于饱和浓度的溶液时，晶种会在介稳区(metastablezone)生长，从而导致晶体生长。
由于D-阿洛酮糖具有明显低于蔗糖的晶体生长速率，一般采用冷却结晶的方法，并且需要开发一种高度经济的技术来实现工业化。
已报道一种在结晶D-阿洛酮糖的过程中使用大量乙醇的方法(Kei T等人，J.Biosci.Bioeng.，90(4)，453-455，2000)，但根据这种方法，虽然发生了晶体成核现象，但是晶体并没有生长。特别地，在结晶过程中，由于无定形的块状物发生堵塞(Blocking)现象，导致颗粒状晶体的产生。在该过程中发生这样的堵塞时，很难将这样的晶体转移到结晶器的外部，此外，也无法进行粉碎，从而降低了生产产率。另外，在糖类结晶产业，晶体颗粒的尺寸被认为是一个重要的因素，当大规模生产***中产生的晶体为颗粒时，晶体很容易同晶体母液(crystal mother liquor)一起从晶体离心机设备中转移。在干燥过程中，分离的剩余颗粒在晶体之间团聚，并在筛分的过程中被排除，因此最终产品的包装体积减少或适销性受损。因此，这样的颗粒状晶体不适用于大规模生产的方法。此外，在糖类结晶时使用乙醇，当最终剩余的乙醇浓度高时，不良味道和气味的产生会降低糖类晶体产品的适销性。
鉴于目前的情况，本发明的发明人发现，通过使用浓缩的D-阿洛酮糖溶液和可操作范围内的有机溶剂，可以提高晶体的回收率并且晶体颗粒可以生长，并开发了一种制备高纯度D-阿洛酮糖的方法，其纯度为98％(w/w)或更高，且无不良味道/气味，其晶体颗粒尺寸为MA200或更高，在结晶过程中具有改进的流动性，作为产品具有改进的适销性。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种D-阿洛酮糖晶体，基于整个晶体的100％(w/w)，其包含98％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖以及0.001％(w/w)至0.05％(w/w)的乙醇。
本发明的另一个目的是提供一种制备D-阿洛酮糖晶体的方法，其包括第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合；以及第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。
技术方案
以下将更详尽地描述本发明内容。
同时，本发明公开的每一个描述和实施方案也可以适用于每一个其他的描述和实施方案。即，本发明公开的各种要素的所有的组合都属于本发明的范围。此外，以下具体描述不得限制本发明的范围。
另外，本领域技术人员可以只用通常的实验来认识和确定本发明所公开的具体实施方案的多个等同物。此外，本发明意图包括这些等同物。
作为本发明解决目标的一个方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖晶体，基于整个晶体的100％(w/w)，其包含98％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖和0.001％(w/w)至0.05％(w/w)的乙醇。
在本发明中，“D-阿洛酮糖”是一种低热量含量的单糖，具有C6H12O6的分子式和如下的结构式。除了链状结构，α(alpha)型和β(beta)型的六角环状结构也包括在D-阿洛酮糖的范围内。
在本发明中，“D-阿洛酮糖晶体”是一种固体，其中D-阿洛酮糖分子以有规律的重复结构排列，这与没有重复结构的无定形固体块状物不同。本发明的D-阿洛酮糖晶体的纯度可以为98％(w/w)或更高，特别地，为98.5％(w/w)或更高，更特别地，为99％(w/w)或更高。
在制备本发明的D-阿洛酮糖晶体时，由于加入了乙醇，D-阿洛酮糖晶体可以含有微量的乙醇。乙醇的含量可以为0.05％(w/w)或更低、特别地，为0.04％(w/w)或更低、更特别地，为0.03％(w/w)或更低。乙醇的含量可以是，例如0.001％(w/w)至0.05％(w/w)、0.001％(w/w)至0.04％(w/w)、0.001％(w/w)至0.03％(w/w)、0.005％(w/w)至0.05％(w/w)、0.005％(w/w)至0.04％(w/w)、0.005％(w/w)至0.03％(w/w)、0.01％(w/w)至0.05％(w/w)、0.01％(w/w)至0.04％(w/w)、0.01％(w/w)至0.03％(w/w)、0.02％(w/w)至0.05％(w/w)、0.02％(w/w)至0.04％(w/w)或0.02％(w/w)至0.03％(w/w)。根据本发明的一个非限性制的实施方案，当乙醇含量为上述含量时，不会出现不良味道/气味，因此，D-阿洛酮糖晶体可以等同于没有添加乙醇的D-阿洛酮糖晶体(测试例2)而使用。由于含有微量的乙醇，D-阿洛酮糖晶体的表面可以是光滑的，并且相比未添加乙醇的D-阿洛酮糖晶体(测试例3)，所述D-阿洛酮糖晶体可以是光亮的或有光泽的。此外，当含有微量的乙醇时，D-阿洛酮糖晶体的流动性增强，并且在晶种分散时可以获得高产率和结晶度的结晶。晶体的流动性可以通过测量流度和休止角来确认，其中休止角是指在斜坡上沉积时，尚未凝结的沉积物可以沉积并不流下的最大倾斜角。在D-阿洛酮糖晶体组合物以预定的速度通过安装在水平面上的漏斗后，可以使用分度器测量组合物上表面的角度来获得休止角(图6)。
％(w/w)可与wt％组合使用。％(w/w)可以指基于整个晶体的100重量份，所述晶体的重量，或基于含有晶体的溶液的100重量份，所述晶体的重量。特别地，％(w/w)可以指基于整个晶体的100重量份，D-阿洛酮糖晶体的重量，或基于含有晶体的溶液的100重量份，D-阿洛酮糖晶体的重量。晶体可以含有干燥固体(Dry solid，DS)。
此外，本发明的术语“平均晶体粒径”是代表晶体平均粒径的量度。测量D-阿洛酮糖晶体粒径的方法不受限制，并且可以使用本领域内常规使用的方法。作为测量晶体粒径的非限制的实例，包括比较法(FGC)、切割法(FGI)、平坦能力法(FGP)等。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的平均粒径(MA:面积分布的平均直径)可以为60μm或更高、100μm或更高、150μm或更高、200μm或更高、230μm或更高、250μm或更高、300μm或更高或320μm或更高。例如，平均粒径可以为100μm至500μm、150μm至450μm、200μm至400μm、230μm至400μm、300μm至400μm、320μm至400μm或320μm至390μm。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的d10是对应于较低的10％的晶体分布的数值，其可以为100μm或更高、110μm或更高、130μm或更高、或150μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d10可以为100μm至200μm、100μm至180μm、110μm至180μm、110μm至160μm、130μm至180μm、130μm至160μm、150μm至180μm或150μm至160μm。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的d50是对应于较低的50％的晶体分布的数值，其可与中位数组合使用，可以为100μm或更高、150μm或更高、200μm或更高、230μm或更高、250μm或更高、300μm或更高、或310μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d50可以为100μm至500μm、150μm至450μm、200μm至400μm、230μm至400μm、300μm至400μm、320μm至400μm或310μm至390μm。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的d90是对应于较低的90％的晶体分布的数值，其可以为200μm或更高、250μm或更高、300μm或更高、330μm或更高、350μm或更高、400μm或更高或500μm或更高。例如，D-阿洛酮糖晶体的d90可以是200μm至800μm、250μm至700μm、300μm至650μm、330μm至600μm、350μm至600μm、400μm至600μm或500μm至590μm。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的粒径分布可以通过相对标准偏差或相对粒径分布来确定。
相对标准偏差是由标准偏差除以平均粒径得到的百分比数值，其可以是30％至60％、35％至55％、37％至50％、38％至48％或40％至46％。
相对粒径分布是由d50除以d90与d10之差得到的数值，可以是0.8至1.5、0.9至1.4或1.0至1.3。
结果，在晶体离心设备中，与母液一起损失的D-阿洛酮糖晶体的量降低可以减少晶体间的聚集。因此，本发明的具有所述粒径的D-阿洛酮糖晶体适用于大规模生产。
作为本发明解决目标的另一个方面，本发明提供了一种制备D-阿洛酮糖晶体的方法，其包括第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合；第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以得到含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。
“含有D-阿洛酮糖的溶液”是没有限制的，其可以为任何溶液，只要D-阿洛酮糖可以溶解或分散在其中。含有D-阿洛酮糖的溶液可以是这样的溶液，其纯度为90％(w/w)或更高，特别地，为91％(w/w)或更高、92％(w/w)或更高、93％(w/w)或更高、94％(w/w)或更高、或95％(w/w)或更高，但本发明不限于此。
含有D-阿洛酮糖的溶液可以是通过用酶处理生产D-阿洛酮糖的底物进行差向异构化反应获得的溶液，或者可以是通过分离和纯化所述溶液获得的。底物和酶的实例包括但不限于果糖和D-阿洛酮糖差向异构酶，以及果糖-6-磷酸、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶和D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶。特别地，含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过纯化溶液来获得，所属溶液通过果糖与D-阿洛酮糖的差向异构化反应获得。特别地，果糖可以溶于水并在水中使用，在30℃至40℃的温度下，其浓度为30白利糖度(％)至50白利糖度(％)，其中果糖用作差向异构化反应的底物。在本发明中，白利糖度(％)指基于整个溶液的重量，D-阿洛酮糖或果糖的重量百分比。本文中，可以随后将果糖与通过色谱法分离的含有果糖的溶液混合，并且可以在30℃至40℃的温度下，以30白利糖度(％)至50白利糖度(％)的浓度使用。本文中，通过色谱法分离的含有果糖的溶液可以使用含有果糖的部分，其纯度为70％(w/w)或更高，特别地，为75％(w/w)。
在阿洛酮糖差向异构酶、其变体、产生所述酶的菌株或其培养物的存在下，D-阿洛酮糖的差向异构化反应可以是通过差向异构化果糖产生D-阿洛酮糖。可用于本发明的D-阿洛酮糖差向异构酶可以是衍生自各种供体微生物的酶或变体，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、Flavonifractorplauti和Clostridium hylemonae。用于转化的菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)和曲霉(Aspergillus)，但不仅限于这几种菌株。转化到大肠杆菌的菌株包括，例如，BL21(DE3)/pET24-ATPE[韩国专利公开号10-211-0035805]，BL21(DE3)/pET24-ATPE-2[韩国专利注册号10-1203856]等。棒状杆菌菌株包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032/pCJ-1-ATPE[登记号KCCM11046，韩国专利公开号10-2011-0035805]，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032/pFIS-1-ATPE-2[登记号KCCM11204P，韩国专利注册号10-1203856]、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CJ KY[登记号KCCM11403P，韩国专利注册号10-1455759]，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032/pFIS-2-ATPE-2[登记号KCCM11678P，韩国专利申请号10-2015-0047111]等，但本发明不限于此。
作为示例，差向异构化反应可以通过如下进行，将阿洛酮糖差向异构酶、其变体、产生所述酶的菌株或其培养物固定在载体(例如，海藻酸钠)上，用固定化酶填充异构化反应设备(例如色谱柱)，然后将含有果糖的溶液供给到填充的色谱柱。设备中的温度可以保持在40℃至70℃，例如，40℃至55℃，以进行差向异构化反应。这时，通过热交换器，含有所供给的果糖的溶液的温度以例如每小时5℃至20℃的速度上升，温度达到40℃至60℃的温度，例如50℃，并且溶液以0.5至3的空速(SV)[流速(L)/时间(Hr)/树脂量(L)]通过。通过差向异构化反应产生的D-阿洛酮糖的纯度可以为约15％(w/w)至约35％(w/w)，例如，约20％(w/w)至约30％(w/w)。
含有差向异构化D-阿洛酮糖的溶液可以被冷却。溶液温度或环境温度在25℃至45℃的温度范围内进行冷却，特别是30℃至40℃。特别地，可以以每小时1℃至10℃的速度缓慢进行冷却，并且可以在冷却中使用热交换器。
含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过分离和/或纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液获得。即，本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法可以包括在第一步之前，分离和/或纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液。
含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过纯化含有D-阿洛酮糖的粗制溶液获得。特别地，纯化可以通过以下中的至少一种进行：通过填充有脱色剂的色谱柱进行脱色、通过离子交换树脂色谱法进行脱盐以及连续色谱法。
特别地，含有差向异构化D-阿洛酮糖的溶液可以被冷却，然后通过填充有脱色剂的色谱柱进行脱色，并通过填充有强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的色谱柱进行纯化。在使用强碱性阴离子交换树脂的情况下，即使在25℃至45℃的低温下，D-阿洛酮糖也会变性，因此纯度可能会下降。因此，为了制备高产率的D-阿洛酮糖，可以使用弱碱性阴离子交换树脂，更特别地，可以使用100％的弱碱性阴离子交换树脂。为了有效去除离子成份，可以同时使用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。在这种情况下，阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的比例可以为1:0.5至1:3。在离子纯化过程中，保持温度为25℃至45℃，特别地，为30℃至40℃，以防止D-阿洛酮糖变性。因此，含有D-阿洛酮糖的溶液中的杂质离子成分可以被去除。离子纯化后，离子成分的含量可以为20微西门子或更低，特别是用电导***测量时，为10微西门子/单位厘米或更低。离子纯化溶液中的D-阿洛酮糖的纯度可以为约10％(w/w)至约35％(w/w)。本文中，在冷却和离子纯化过程中，通过蒸馏将乙醇从的母液中去除，然后母液可以被重新使用，所述母液在随后的D-阿洛酮糖的结晶步骤中产生。纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以被浓缩和冷却。
浓缩是这样的过程，将离子纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液浓缩至D-阿洛酮糖浓度在50白利糖度(％)至70白利糖度(％)的范围内，例如，55白利糖度(％)至65白利糖度(％)。特别地，可以在50℃至80℃的温度下进行浓缩，例如，55℃至70℃。这时，在浓缩过程中，可使用低温蒸发器来防止D-阿洛酮糖的变性。浓缩以后，可以进行冷却。进行冷却时，可以进行浓缩以使溶液或环境温度达到比浓缩时的温度低至少10℃的温度。例如，冷却温度可以在40℃至60℃的范围内。可以以每小时5℃至25℃的冷却速率缓慢进行冷却，冷却中可以使用热交换器。本文中，在浓缩和冷却过程中，通过蒸馏将乙醇从母液中去除，然后母液可以被重新使用，所述母液在随后的D-阿洛酮糖的结晶步骤中产生。
含有D-阿洛酮糖的溶液可以是通过将果糖从含有D-阿洛酮糖的溶液中分离而得到的溶液。特别地，含有果糖的溶液可以通过色谱法进行分离。
色谱法利用D-阿洛酮糖和附着于离子树脂上的金属离子的弱结合力的差异来分离D-阿洛酮糖，例如，可以使用连续色谱法。用于色谱法的离子树脂可以是附着K、Na、Ca和Mg残留物的强酸性阳离子交换树脂。特别地，该离子树脂可以是能够分离D-阿洛酮糖和果糖的离子树脂，例如，K、Ca或Na。含有果糖的溶液和纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以通过色谱法获得。纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液可以是含有纯度为90％(w/w)或更高，例如，95％(w/w)或更高的D-阿洛酮糖的溶液。特别地，D-阿洛酮糖的纯度可以是90％(w/w)至99％(w/w)或更高。含有果糖的溶液可以是含有纯度为70％(w/w)或更高的果糖的溶液。分离的含有果糖的溶液可以重新用于色谱法中的D-阿洛酮糖的差向异构化反应。果糖是未经分离而变性的，经色谱法分离，然后重新用于D-阿洛酮糖差向异构化反应以提高总产率。在重新使用以前，可以进一步包括在25℃至45℃，和30℃至40℃的范围内的冷却。
本发明的含有D-阿洛酮糖的溶液可以被浓缩。例如，将获得的纯度为95％(w/w)或更高的纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液进行浓缩，以使D-阿洛酮糖的浓度达到75白利糖度(％)或更高，例如，80白利糖度(％)或更高。特别地，浓缩可以在50℃至80℃的温度下进行，例如，55℃至70℃。这时，在浓缩过程中，可使用低温蒸发器来防止D-阿洛酮糖的变性。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法包括，第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合。因此，D-阿洛酮糖可能会部分析出。此外，加入晶种，以及下文所述的冷却可以特别有助于以高产率分离晶体。
第一步的混合可以在20℃至60℃下进行。特别地，第一步的混合可以在30℃至60℃下进行，更特别地，40℃至60℃。在比此更低的温度下，将变为过饱和状态，超出介稳区，这导致新晶体的成核而不是晶体的生长，因此导致晶体的生长受到抑制的问题。在更高的温度下，有机溶剂会在混合过程中挥发，结果，由于回收率的降低和蒸汽的产生，会导致安全方面的问题。
有机溶剂可以是醇，特别地，可以包括乙醇、甲醇和异丙醇中的至少一种。
有机溶剂可以为混合物，即水：有机溶剂的比例为1:0.5或更高，1:0.7或更高，或1:1或更高，例如，1:0.5至1:10、1:0.7至1:10、1:1至1:10、1:1至1:9或1:1至1:8。
本发明的D-阿洛酮糖晶体的制备方法，第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏(massecuite)。本文中，糖膏是指D-阿洛酮糖晶种开始结晶反应时，晶体和溶液混合的浆体状态。
制备D-阿洛酮糖晶体的方法中，最困难的方面是控制晶体的大小或形状。在本发明中，这可以通过一种结晶方法来实现，其中有机溶剂混合到含有D-阿洛酮糖的溶液后，加入晶种并缓慢冷却溶液。
在本发明中，D-阿洛酮糖晶种指主要由D-阿洛酮糖组成的细小晶体，在均匀地保持D-阿洛酮糖在有机溶剂混合溶液中的介稳区的过饱和度的同时，添加D-阿洛酮糖晶种。有机溶剂混合溶液具有低粘度，并且添加的D-阿洛酮糖晶种可以容易地分散。在低粘度和高分散度的条件下，晶体可以很好地生长。D-阿洛酮糖的晶种可以是100μm或更低的晶种，特别是具有40μm至100μm尺寸的晶种。D-阿洛酮糖晶种可以以基于混合溶液的总重量，0.01％(w/w)至1％(w/w)的重量百分比加入。
在本发明的制备方法中，当不加入D-阿洛酮糖晶种时，会产生无定形的D-阿洛酮糖块，并且不会产生具有所需尺寸或形状的D-阿洛酮糖晶体。优选以分散的形式将D-阿洛酮糖晶种加入到混合溶液中。在加入晶种后，通过调整冷却条件来生长晶体。
关于冷却条件，冷却前的第一步混合温度与上述相同，第二步冷却的最终温度可以为8℃至30℃、8℃至25℃、8℃至20℃、10℃至30℃、10℃至25℃或10℃至20℃。根据这样的温度控制，新晶体的生成被抑制，从而增大了晶体的尺寸并提高了产率。当第二步冷却的最终温度高于上述范围时，D-阿洛酮糖晶体的回收率会更低。此外，当最终温度低于上述范围时，会诱发成核，从而产生大量小于100μm的颗粒，导致在干燥过程中，晶体之间的团聚，结果产品的包装体积减少或适销性受损。
在本发明中，调整冷却速率以控制D-阿洛酮糖晶体的生长速率。特别地，冷却速率可以为0.05℃/小时至1.4℃/小时、0.6℃/小时至1.4℃/小时、0.7℃/小时至1.3℃/小时、0.8℃/小时至1.2℃/小时或0.9℃/小时至1.1℃/小时。作为另一个实例，冷却速率可以调整为在介稳区范围内冷却。当冷却速率快于该范围时，混合溶液迅速进入超过介稳区的过饱和区，并导致大量的颗粒。此外，当冷却速率太低，单位时间内的生产率会降低，导致大规模生产的效率低下。
在第二步中，冷却和/或结晶可以进行20小时至70小时，或30小时至70小时。
根据本发明的一个非限制实施方案，当D-阿洛酮糖晶体通过使用有机溶剂并控制冷却速率来制备时，可能产生结构化的阿洛酮糖晶体堵塞。
本发明的制备方法进一步包括第三步，将D-阿洛酮糖晶体从糖膏中分离并干燥。特别地，含有过量有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体可以从第一步和第二步获得的糖膏中分离。
在从糖膏中分离D-阿洛酮糖晶体时，可以不受限制地使用任何能够分离晶体的方法，例如，可以使用离心脱水机。分离的晶体可以含有0.07％(w/w)或更高、0.1％(w/w)或更高和0.13％(w/w)或更高的有机溶剂，例如，基于总的晶体的100％(w/w)，0.07％(w/w)至0.5％(w/w)、0.1％(w/w)至0.3％(w/w)或0.13％(w/w)至0.2％(w/w)。
将含有过量有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体进行干燥，以获得基于总的晶体的100％(w/w)，含有98％(w/w)或更高的D-阿洛酮糖，以及0.05％(w/w)或更低的有机溶剂的D-阿洛酮糖晶体。对获得的D-阿洛酮糖晶体的描述与上述相同。
本发明的制备方法可以进一步包括第四步，从分离出D-阿洛酮糖晶体的第三步的母液中回收有机溶剂，然后将回收的有机溶剂作为第一步的有机溶剂重新使用。
此外，本发明的制备方法可以进一步包括第五步，重新使用晶体母液以在第一步中制备D-阿洛酮糖溶液，其中在第四步除去晶体母液的有机溶剂。
本发明的制备方法的产率，即最终获得的D-阿洛酮糖晶体相对于第一步中的含有D-阿洛酮糖的溶液中存在的D-阿洛酮糖重量的重量百分比，可以为65％(w/w)或更高、70％(w/w)或更高、75％(w/w)或更高或80％(w/w)或更高。
即，在本发明中，产率可以用以下公式表示。
[式1]
产率(％)＝(脱水和干燥的D-阿洛酮糖晶体重量/结晶前粗制溶液中的D-阿洛酮糖重量)×100
当计算产率时，通过HPLC分析粗制溶液中的D-阿洛酮糖g/L来测定结晶前粗制溶液中D-阿洛酮糖的重量，然后根据预先测量的结晶粗制溶液的量(L)，将测得的D-阿洛酮糖g/L代入，以计算包含于特定粗制溶液量(L)的D-阿洛酮糖的重量(g)。
此外，在结晶过程中分离的母液，即，从糖膏中脱水出来的上清液，可以通过蒸馏回收有机溶剂重新用于第一步，并将回收的有机溶剂与D-阿洛酮糖溶液混合。将蒸馏除去有机溶剂的含有D-阿洛酮糖的溶液冷却至30℃，其可以在色谱柱中再循环，在所述色谱柱中，强酸性阳离子交换树脂被氢基取代，弱碱性阴离子交换树脂被羟基取代，通过连续色谱法再循环，或在第一步再循环。D-阿洛酮糖结晶产生的母液可以是含有D-阿洛酮糖的部分，其纯度为75％(w/w)或更高、85％(w/w)或更高或95％(w/w)或更高。
有益效果
在本发明的制备D-阿洛酮糖晶体的方法中，通过在含有D-阿洛酮糖的溶液中混合有机溶剂，加入晶种，然后缓慢冷却混合物的结晶方法，可以提高从D-阿洛酮糖溶液中获得D-阿洛酮糖晶体的产率，并制备用于大规模生产的具有足够大小和适当的形状的D-阿洛酮糖晶体，并且没有不良味道/气味。
附图说明
图1是实施例1制备的D-阿洛酮糖晶体的显微照片。
图2是实施例1制备的D-阿洛酮糖晶体的粒径分析结果。
图3是实施例2制备的D-阿洛酮糖晶体组合物的粒径分析结果。
图4是实施例6中制备的D-阿洛酮糖晶体饼的形状的图示。
图5A是实施例1制备的D-阿洛酮糖晶体的一个表面的扫描电子显微照片(SEM)。
图5B是对比例中制备的D-阿洛酮糖晶体的一个表面扫描电子显微照片(SEM)。
图6是说明一个测量休止角的方法的图示。
具体实施方式
下面将参照以下实施例更详细地描述本发明的内容。然而，以下实施例仅仅是对本发明内容的说明，本发明的范围并不限于此。
实施例1:高纯度D-阿洛酮糖晶体组合物的制备，其纯度为98％(w/w)或更高并含有0.05％(w/w)的乙醇
(1)利用微生物生产低纯度D-阿洛酮糖溶液
制备纯度为95％(w/w)或更高的50白利糖度(％)的果糖溶液(酶反应底物溶液)。如韩国专利公开号KR 10-2011-0035805 A(韩国专利申请号10-2009-0118465)中公开的差向异构化酶反应，其中从谷丙氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)KCCM 11046P菌株中分离出的D-阿洛酮糖差向异构酶被固定在海藻酸钠载体上，并填入异构化设备(异构化塔，HANJOO Machine Industrial Co.，Ltd.)，然后制备好的酶反应底物溶液以空速(Space Velocity,SV)[流速(L)/时间(Hr)/树脂量(L)]通过热交换器，以每小时5℃至20℃的速度提升至50℃的温度，以获得差向异构化的D-阿洛酮糖溶液。此时，D-阿洛酮糖的纯度为约24％(w/w)。
(2)D-阿洛酮糖溶液的纯化
首先将差向异构化的D-阿洛酮糖溶液通过热交换器以每小时5℃至10℃的速率冷却至30℃至40℃的温度，然后通过填充有脱色剂的色谱柱进行脱色，随后通过SV3柱进行脱盐，所述SV3柱填充有氢基取代的强酸性阳离子交换树脂和羟基取代的弱碱性阴离子交换树脂。通过电导***的测量，最终的离子组合物被调整为每单位厘米10微西门子或更低，脱盐酶反应液中D-阿洛酮糖的纯度保持在24％(w/w)。
(3)使用色谱法分离高纯度D-阿洛酮糖溶液
将离子纯化的含有D-阿洛酮糖的溶液加入到低温蒸发器(强制薄膜蒸发器(ForceThin Film Evaporator)，WELCRON Hantec)中，在55℃至70℃的温度下，在10分钟至15分钟的短时间内浓缩至60白利糖度(％)的浓度，并再次通过热交换器以每小时5℃至25℃的速度冷却，在50℃至60℃的温度下，通过填充有具有钙活性基团的强酸性阳离子交换树脂的色谱柱进行连续色谱，分离成纯度95％(w/w)或更高的纯化的D-阿洛酮糖溶液，以及纯度为70％(w/w)或更高的含有果糖的溶液。
通过连续色谱法分离的纯度为70％(w/w)或更高的含有果糖的溶液被回收，并以每小时20℃至30℃的速度冷却，以便在30℃的果糖差向异构化过程中再循环。
(4)通过D-阿洛酮糖溶液的浓缩、有机溶剂处理和冷却进行结晶
在55℃至70℃的温度下，浓缩通过连续色谱法分离的具有95％(w/w)或更高纯度的纯化的D-阿洛酮糖溶液，以调整至85白利糖度(％)的浓度。浓缩的D-阿洛酮糖溶液具有95％(w/w)或更高的纯度，通过热交换器，将其以每小时5℃至20℃的速度将其快速冷却至40℃的温度，然后与乙醇混合，与不计固体的水的含量相比，相应的重量比为水:乙醇＝1:1.13。
将适量的晶种加入到与乙醇混合的D-阿洛酮糖溶液中，所述溶液冷却至40℃，然后以每小时1℃的冷却速率将其冷却至10℃，并结晶30小时以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。
将含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏加入到高速离心脱水机中，以4000rpm旋转10分钟，然后排出上清液获得含有过量乙醇的D-阿洛酮糖晶体。此时，通过喷洒去离子水或乙醇，对残留的上清液进行清洗，获得的D-阿洛酮糖晶体含有的乙醇的浓度为约0.15％(w/w)。
将回收的含有过量乙醇的D-阿洛酮糖晶体移到流化床干燥器或真空干燥器中，干燥1小时至2小时，以除去过量的乙醇，并获得纯度为98％(w/w)或更高并含有0.03％(w/w)的乙醇的D-阿洛酮糖晶体。干燥后获得的D-阿洛酮糖晶体的量为2,252g，相比通过连续色谱法分离和浓缩的D-阿洛酮糖溶液中存在的2,780g，其回收率为约81％，晶体尺寸为MA336(图1和图2)。
此外，在结晶过程中分离的母液，即，由糖膏脱水的上清液，可以通过如下方法重新用于回收乙醇的步骤，即蒸馏回收的乙醇，并将其与D-阿洛酮糖溶液混合的步骤。蒸馏后，除去乙醇的含有D-阿洛酮糖的溶液冷却至30℃，并可以在色谱柱中再循环，所述色谱柱填充有氢基取代的强酸性阳离子交换树脂和羟基取代的弱碱性阴离子交换树脂，或通过连续色谱法再循环。
实施例2:纯度为98％(w/w)或更高并含有0.05％(w/w)或更低的乙醇的高纯度D-阿洛酮糖晶体的制备
在上述实施例1中，将浓缩到80.0白利糖度(％)的含有D-阿洛酮糖的溶液冷却到50℃，相比不计固体的水的含量，以乙醇相比水为水：乙醇＝1:9的重量比，将乙醇混合，冷却速率为每小时0.5℃，最终温度为至少20℃，持续60小时，除上述以外，按照与实施例1相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高，并具有0.05％(w/w)或更低的乙醇的高纯度的D-阿洛酮糖晶体组合物。
获得的纯度为98％(w/w)或更高并含有0.05％(w/w)或更低的乙醇的D-阿洛酮糖晶体的量为2,307g，与2,780g最初溶解的D-阿洛酮糖相比，其回收率为约83％，晶体尺寸为MA 241(图3)。
实施例3:纯度为98％(w/w)或更高并含有0.05％(w/w)的乙醇的D-阿洛酮糖晶体组合物的制备
在上述实施例1中，除了干燥时间为30分钟至1小时外，按照与实施例1相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高的高纯度的D-阿洛酮糖晶体组合物。
获得的D-阿洛酮糖晶体含有0.05％(w/w)的乙醇，纯度为98％(w/w)或更高。
实施例4:纯度为98％(w/w)或更高并含有0.06％(w/w)的乙醇的D-阿洛酮糖晶体组合物的制备
在上述实施例1中，除了干燥时间为10分钟至20分钟外，按照与实施例1相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高的高纯度的D-阿洛酮糖晶体组合物。
获得的D-阿洛酮糖晶体含有0.06％(w/w)的乙醇，纯度为98％(w/w)或更高。
实施例5:通过改变混合有机溶剂的类型制备高纯度的D-阿洛酮糖晶体
在上述实施例1中，除了在浓缩的含有D-阿洛酮糖的溶液中混合甲醇和异丙醇外，按照与实施例1相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高的高纯度的D-阿洛酮糖晶体组合物。
当使用甲醇时，获得的D-阿洛酮糖晶体产率为33％，平均粒径为MA 109。
当使用异丙醇时，获得的D-阿洛酮糖晶体产率为32％，平均粒径为MA 61。
实施例6:使用有机溶剂而不控制冷却速率制备高纯度的D-阿洛酮糖晶体组合物
在上述实施例2中，相比不计固体的水的含量，以乙醇相比水为水：乙醇＝1:4的重量比，在浓缩的含有D-阿洛酮糖的溶液中，将将乙醇混合，并加入晶种，然后不控制冷却速率，在30分钟至1小时的时间内达到最终温度20℃，结晶30小时，除了上述外，以与实施例2相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高并含有0.05％(w/w)或更低乙醇的高纯度D-阿洛酮糖晶体组合物。
获得的D-阿洛酮糖晶体的量为1,056g，与最初溶解的D-阿洛酮糖相比，其回收率为约38％，生成的阿洛酮糖晶体块为1,084g，确认其回收率为39％。
对比例：通过冷却结晶而不使用有机溶剂的方法制备高纯度D-阿洛酮糖晶体
在上述实施例2中，将浓缩的含有D-阿洛酮糖的溶液冷却到初始温度40℃，然后不与乙醇混合，冷却至20℃持续80小时，除了上述外，按照与实施例2相同的方式制备纯度为98％(w/w)或更高的高纯度的D-阿洛酮糖晶体。
获得的D-阿洛酮糖晶体的产率为53％，平均粒径为MA 374。
测试例1：确定去除残留乙醇的效果
受试者以预定量摄入粉末形式的实施例1(含有0.03％(w/w)或以下残留乙醇)、对比例、实施例4和实施例3中的高纯度的D-阿洛酮糖晶体，然后进行3点测试以评估是否能区分出差异。两个测试组被安排了3个选项，一个测试者在不知道安排顺序的情况下，依次摄入这三个选项以选择哪一个有不同的味道。该测试由20名测试者进行三次，并根据相比测试总数的正确回答率来评估是否存在差异。表1显示了评估中使用的D-阿洛酮糖晶体和残留乙醇浓度％(w/w)，表2显示了评估结果。评估是通过如下进行，计算正确答案的数量，将总的答案数量和正确答案数量与显著性检验表进行比较，并确定是否具有统计学意义。当测试进行了60次时，如果正确答案数量是27或以上，就可以确定存在明显的质量差异。
表1
| 实施例3 | 实施例1 | 实施例4 | 对比例 | |
| 残留乙醇浓度(％，w/w) | 0.05 | 0.03 | 0.06 | 0 |
表2
经证实，与不使用有机溶剂的方法制备的D-阿洛酮糖晶体(对比例)相比，含有0.05％(w/w)或更低的残留乙醇的D-阿洛酮糖晶体(实施例1和3)没有功能上的差异。从中可以看出，当残留的乙醇被调整为预定浓度以下时，可以达到与原来的D-阿洛酮糖晶体相当的味道。
测试例2：确定通过去除残留乙醇来减少不良味道/气味强度的效果
在上述测试例1中，对实验中使用的同一测试组(表1)的不良味道/气味强度进行了评估。20名测试者摄入D-阿洛酮糖晶体，然后将不良味道/气味强度以等级表示(5分表示不良味道/气味最大的情况)，评估结果见表3。经证实，与不使用有机溶剂的方法制备的D-阿洛酮糖晶体(对比例)相比，含有0.05％(w/w)或以下残留乙醇的D-阿洛酮糖晶体(实施例1和3)在不良味道/气味上没有差异。从中可以看出，当残留的乙醇被移除为预定浓度以下时，不良味道/气味与原来的D-阿洛酮糖晶体相当。
表3
| 对比例 | 实施例4 | 实施例3 | 实施例1 |
| 1.9±0.8 | 3.0±0.4 | 2.0±0.9 | 1.9±0.7 |
测试例3：确认含有乙醇的光滑表面效果
用SEM检测实施例1(含有0.03％(w/w)或更低的残留乙醇)和对比例中高纯度D-阿洛酮糖晶体的表面。结果如图5所示。
经证实，与对比例中没有加入乙醇的D-阿洛酮糖晶体(图5B)相比，实施例1中加入乙醇的D-阿洛酮糖晶体(图5A)的表面是光滑的。从中可以看出，加入乙醇后，D-阿洛酮糖晶体表面的光滑度提高，因此其表面是有光泽的或光亮的。
测试例4：确认通过含有乙醇提高晶体流动性的效果
测试例4.1：流动性的测量
将含有0.03％(w/w)或更低残留乙醇的D-阿洛酮糖晶体(实施例1)的流动性与通过没有使用有机溶剂的方法制备的D-阿洛酮糖晶体(对比例)的流动性进行比计较和评估。为了评估流动性，使用了流度计。
表4
| 进口直径 | 1.5cm |
| 托盘直径 | 5.0cm |
| 进口-托盘间距 | 15cm |
| 加入量 | 30g |
上表4显示了流度计的测量条件。
流动性＝[(添加的粉末的重量-托盘残留粉末的重量)/添加的粉末的重量×100)]
随着公式计算结果值的增加，晶体的流动性提高。
测试例4.2：休止角的测量
另外，通过测量休止角确认含有乙醇对流动性提高的效果。休止角是指在斜坡上沉积时，尚未凝结的沉积物可以沉积并不流下的最大倾斜角，休止角越小，晶体流动性越大(图6)。
在D-阿洛酮糖晶体组合物以预定的速度通过安装在水平面上的漏斗后，可以使用分度器测量组合物上表面的角度来获得休止角。
表5
| 流动性 | 休止角 | |
| 实施例1 | 59.7 | 35 |
| 对比例 | 48 | 45 |
上表5显示了流动性和休止角的测量结果。从表5中可以确认，D-阿洛酮糖在加入乙醇的情况下，流动性提高，结果表明，含有乙醇的D-阿洛酮糖的粘度低，可在晶种分散的同时进行结晶，因此可以提高产率和结晶程度。
本领域技术人员可以理解，如上述的本发明可以在不背离其技术与精神或基本特征的情况下实施成其他具体形式。因此，应该理解上述的实施方案在各种意义上是说明性的，而不是限制性的。本发明的范围由以下描述的权利要求书而不是详细说明来表示，应该解释为权利要求书的含义和范围以及由其等同物衍生的所有变化或修改形式都属于本发明的范围。
Claims (17)
1.一种D-阿洛酮糖晶体，其包含：
基于整个晶体的100％(w/w)，
98％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖以及0.001％(w/w)至0.05％(w/w)的乙醇。
2.权利要求1的D-阿洛酮糖晶体，其中
平均粒径(MA)为200μm或更高。
3.一种制备D-阿洛酮糖晶体的方法，其包括：
第一步，将含有D-阿洛酮糖的溶液与有机溶剂混合；以及
第二步，向第一步的混合溶液中加入晶种，然后将其冷却以获得含有D-阿洛酮糖晶体的糖膏。
4.权利要求3的制备方法，其中
第一步中的混合在40℃至60℃下进行，并且
第二步中的冷却的最终温度为10℃至20℃。
5.权利要求3的制备方法，其中
在第二步中，通过调整冷却速率使晶种在介稳区生长。
6.权利要求5的制备方法，其中
在第二步中，冷却速率为0.05℃/小时至1.4℃/小时。
7.权利要求3的制备方法，其中
在第二步中，冷却和结晶进行20小时至70小时。
8.权利要求3的制备方法，其中
所述含有D-阿洛酮糖的溶液含有95％(w/w)或更多的D-阿洛酮糖。
9.权利要求3的制备方法，其中
与第一步中存在于所述含有D-阿洛酮糖的溶液中的D-阿洛酮糖含量相比，最终获得的D-阿洛酮糖晶体的重量百分比为65％(w/w)或更高。
10.权利要求3的制备方法，其中
所述有机溶剂为醇。
11.权利要求3的制备方法，其中
所述有机溶剂包括选自乙醇、甲醇和丙醇中的至少一种。
12.权利要求3的制备方法，其中
所述有机溶剂为混合物，在所述含有D-阿洛酮糖的溶液中，水：有机溶剂的比例为1:0.5或更高。
13.权利要求3的制备方法，其中
在所述含有D-阿洛酮糖的溶液中，D-阿洛酮糖的浓度为80白利糖度至85白利糖度。
14.权利要求3的制备方法，其进一步包括：
第三步，将所述D-阿洛酮糖晶体从所述糖膏中分离并干燥。
15.权利要求14的制备方法，其进一步包括：
第四步，从分离出D-阿洛酮糖晶体的第三步的晶体母液中回收所述有机溶剂，然后重新使用回收的有机溶剂作为第一步的有机溶剂。
16.权利要求14的制备方法，其进一步包括：
第五步，从分离出D-阿洛酮糖晶体的第三步的晶体母液中除去所述有机溶剂，然后重新使用所述晶体母液制备含有D-阿洛酮糖的溶液。
17.权利要求14的制备方法，其中
通过干燥，将所述D-阿洛酮糖晶体中的有机溶剂的浓度调整至0.05％(w/w)或更低。
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