CN113391073A - 用于nptx2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于人神经元正五聚蛋白Ⅱ(以下简称NPTX2)的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,所述的试剂盒包括校准品、质控品、NPTX2磁微粒混悬液、NPTX2抗体标记物、浓缩洗液、发光底物;所述的校准品由NPTX2抗原配置而成;所述的质控品为含有一定浓度的NPTX2抗原,由质控品稀释液配置而成;所述的NPTX2磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的NPTX2抗体溶液。本发明的有益效果是:本发明的试剂盒具有污染小、自动化程度高、操作简单、重复性好、灵敏度高、特异性好的NPTX2快速定量检测优点。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒检测技术领域,特别是用于检测人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经***退行性痴呆,主要由于神经元的衰退和神经突出的减少引起,严重影响患者的生活。AD的病因及发病机制尚未阐明,特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。在脑脊液或血液中,β-淀粉样蛋白、Tau和NPTX2等蛋白的早期检测对于AD患者的早期发现起到非常重要的作用。NPTX2是神经元正五聚蛋白家族成员之一,此家族目前包括NPTX1、NPTX2和NPTR 3个成员,与神经突触的重塑相关。NPTX2在阿尔茨海默病患者的大脑中表达下降。NPTX2下调可导致锥体神经元-pv神经元间回路的破坏,而锥体神经元-pv神经元间回路对大脑的节律性和兴奋性的稳态非常重要。NPTX2下调作为AD发病机制中的一个重要机制,与认知功能的退化密切相关。NPTX2是一种以前未被认识的蛋白,对人类认知功能障碍和AD的进展非常重要。NPTX2被认为是预测阿尔茨海默疾病进展的较好的生物标志物。
目前可用于人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)检测方法主要有放射免疫测定法RIA,酶联免疫法(ELISA)、免疫印迹法和免疫层析法等。这些方法均有一定的缺陷,RIA污染大,ELISA法操作过程复杂,检测时间过长,不利于实现NPTX2的自动化检测,免疫层析法检测重复性差、灵敏低。因此,目前尚需一种污染小、自动化程度高、操作简单、重复性好、灵敏度高、特异性好的NPTX2的快速定量检测试剂盒及其使用方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点,提供用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。本发明的试剂盒具有污染小、自动化程度高、操作简单、重复性好、灵敏度高、特异性好的NPTX2快速定量检测优点。
本发明的目的通过以下技术方案来实现:用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,本发明所述的试剂盒包括校准品、质控品、NPTX2磁微粒混悬液、NPTX2抗体标记物、浓缩洗液、发光底物;
所述的校准品由NPTX2抗原配置而成;
所述的质控品为含有一定浓度的NPTX2抗原,由质控品稀释液配置而成;
所述的NPTX2磁微粒包被抗体含有一定浓度磁微粒标记的NPTX2抗体溶液。
本发明所述的NPTX2磁微粒混悬液制备方法如下所示:
1)活化:20μL磁微粒原液,加入100μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS,200r/min,活化0.5-1h;EDC溶液是将EDC试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到,NHS溶液是将NHS试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到;
2)洗涤:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入300μL MES缓冲液,混匀,磁架上分离弃去上清液,洗涤2次;
3)包被:加入MES缓冲液和预包被抗体,磁微粒和抗体的质量比为80:1,混匀后,室温反应8-12h;
4)封闭:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入100-300μL磁微粒封闭液,摇匀后,室温反应8-12h;
5)将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入一定的磁珠封保液,得到NPTX2磁微粒混悬液。
本发明所述的NPTX2抗体标记物为含有一定浓度的碱性磷酸酶标记的NPTX2抗体溶液或者吖啶酯标记的NPTX2抗体溶液。
本发明所述的碱性磷酸酶NPTX2抗体标记物制备方法如下所示:
1)NPTX2抗体与碱性磷酸酶,碱性磷酸酶的质量为抗体的1.5-2倍,分别除盐、浓缩,然后加入活化剂,室温,分别活化20min;除盐使用Sephadex G25凝胶柱子除盐;NPTX2抗体活化用到的活化剂为2IT(2-Iminothiolane hydrochloride),碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC(Succinimidy 4-(N-maleimidomethy1)cyclohexane-1-carboxylate);
2)活化后的NPTX2抗体与碱性磷酸酶可按照质量比例进行混合后反应;然后进行终止反应和分离纯化,除去未结合的NPTX2抗体与碱性磷酸酶,制备得到抗体标记物浓缩液,保存于2-8℃;终止反应过程中,首先加入10mM马来酰亚胺,室温反应10min;再加入乙醇胺100mM的量;分离纯化柱为SuperdexTM200。
本发明所述的吖啶酯标记抗体制备方法如下所示:
1)NPTX2抗体与吖啶酯,吖啶酯的质量为抗体的50倍,充分混匀,37度反应2小时以上,加入赖氨酸终止反应;
2)将标记后的吖啶酯标记抗体用脱盐层析柱纯化,收集纯化后的吖啶酯标记抗体,-20℃保存。
本发明试剂盒检测方法如下所示:
1)免疫反应:10μL样本/质控品、20μL磁微粒、100μL抗体标记物,37℃温育30min,洗涤6次;
2)磁分离:在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,加入150μL的洗涤液,在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,重复4次,除去未结合的抗体;
3)检测读数:加入发光底物,室温反应,10s-5min内检测发光值;
4)计算:该复合物催化发光底物发出光子,发光强度与NPTX2的含量成正比;选择适当的曲线拟和方式建立标准曲线;本试剂盒推荐采用四参数拟和方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度值的对数log值为y轴建立标准曲线,根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。
本发明所述的校准品为含有NPTX2抗原的校准品;
所述的校准品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为校准品稀释液,用校准品稀释液梯度稀释NPTX2抗原,稀释至工作浓度,分别为50,100,250,500,1000,3000pg/mL。
本发明所述的质控品为含有NPTX2抗原的质控品;
所述的质控品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为质控品稀释液,NPTX2抗原用质控品稀释液梯度稀释至500pg/mL和1000pg/mL。
本发明所述试剂盒的性能指标确定方法:
1)准确度:将浓度约为3000pg/mL(允许其浓度偏差为±20%)的NPTX2样本A加入到浓度范围在150~300pg/mL的NPTX2样本B中,所加入样本A与样本B之间的体积比为1:9,用试剂盒检测混合后的样本,重复检测3次,根据下面公式计算回收率R,
式中:R-回收率;V-加入A液体积;V0-血清B的体积;C-血清样品加入A液后的检测浓度;C0-血清样品B的检测浓度;Cs-A液的浓度;
2)空白限:用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的吸光值,计算其平均值M和标准差SD,得出M+2SD所对应的吸光值,根据试剂盒所用校准品的定标曲线,将M+2SD所对应的吸光值带入方程,求出对应的浓度值,即为空白限;
3)重复性:高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清检测,各重复检测10次,分别计算10次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于10%;
4)批间重复性:分别用三批试剂,检测高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清,每次各重复检测10次,分别计算30次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于15%;
5)线性:将接近线性区间上限的NPTX2高值样本用阴性血清按一定比例稀释为至少5个浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限;用试剂盒将每一浓度重复检测2次,分别求出检测结果的均值yi;以稀释比例(xi)为自变量,以检测结果均值yi为因变量求出线性回归方程;计算线性回归的相关系数r,r≥0.9900。
本发明所述试剂盒的评价结果参数限定:
1)准确度:通过稀释回收评价准确度,结果在85%~115%之间;
2)空白限:不大于20pg/mL;
3)重复性:重复性≤10%,批间重复性≤15%;
4)剂量-反应曲线线性:在20-3000pg/mL范围内,剂量-反应曲线相关性系数r≥0.99.
5)样本测定:对50例AD患者样本进行比较测定,并与Western blot测定进行比较,NPTX2临床符合率85%以上。
本发明用于人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)定量检测试剂盒,具有以下优点:1、实现了人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)定量检测;2、利用化学发光和磁微粒免疫分离技术相结合,操作便捷,可实现自动化,提高了人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)检测的灵敏度和准确度;3、采用碱性磷酸酶标记检测技术,灵敏度高,稳定性较好;4、采用吖啶酯标记检测技术,发光体系简单,不需要催化剂,节省成本,检测时间更快,是磁微粒化学发光免疫检测方法未来发展主方向;5、本发明的试剂盒作为产品,可以满足社会商业需求。
附图说明
图1为本发明试剂盒使用步骤原理步骤示意图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施方式中的附图,对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。实施例:用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,试剂盒组成包括:校准品、质控品、NPTX2磁微粒混悬液、NPTX2抗体标记物、浓缩洗液、发光底物,
其中校准品由NPTX2抗原配置而成,用于建立校准曲线;
质控品为含有一定浓度的NPTX2抗原,由质控品稀释液配置而成。
上述的NPTX2磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的NPTX2抗体溶液。
上述的NPTX2磁微粒混悬液制备方法如下所示。
1)活化:20μL磁微粒原液,加入100μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS,200r/min,活化0.5-1h。EDC溶液是将EDC试剂溶解于PH5.0的100mM的MES缓冲液中得到,NHS溶液是将NHS试剂溶解于PH5.0的100mM的MES缓冲液中得到。
2)洗涤:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入300μL MES缓冲液,混匀,磁架上分离弃去上清液,洗涤2次。
3)包被:加入MES缓冲液和预包被抗体,(磁微粒和抗体的质量比为80:1)混匀后,室温反应8-12h。
4)封闭:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入100-300μL磁微粒封闭液,摇匀后,室温反应8-12h。
5)将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入一定的磁珠封保液,得到NPTX2磁微粒混悬液。
上述的NPTX2抗体标记物为含有一定浓度的碱性磷酸酶标记的NPTX2抗体溶液或者吖啶酯标记的NPTX2抗体溶液。
上述的碱性磷酸酶NPTX2抗体标记物制备方法如下所示。
1)NPTX2抗体与碱性磷酸酶(碱性磷酸酶的质量为抗体的1.5-2倍)分别除盐、浓缩,然后加入活化剂,室温,分别活化20min。除盐使用Sephadex G25凝胶柱子除盐。NPTX2抗体活化用到的活化剂为2IT(2-Iminothiolane hydrochloride),碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC(Succinimidy 4-(N-maleimidomethy1)cyclohexane-1-carboxylate)。
2)活化后的NPTX2抗体与碱性磷酸酶可按照质量比例进行混合后反应。然后进行终止反应和分离纯化,除去未结合的NPTX2抗体与碱性磷酸酶,制备得到抗体标记物浓缩液,保存于2-8℃。终止反应过程中,首先加入10mM马来酰亚胺,室温反应10min。再加入乙醇胺100mM的量。分离纯化柱为SuperdexTM200。
上述的吖啶酯标记抗体制备方法如下所示。
1)NPTX2抗体与吖啶酯(吖啶酯的质量为抗体的50倍),充分混匀,37度反应2小时以上,加入赖氨酸终止反应。
2)将标记后的吖啶酯标记抗体用脱盐层析柱纯化,收集纯化后的吖啶酯标记抗体,-20℃保存。
上述的校准品为含有NPTX2抗原的校准品。
上述的校准品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为校准品稀释液,用校准品稀释液梯度稀释NPTX2抗原,稀释至工作浓度,分别为50,100,250,500,1000,3000pg/mL。
上述的质控品为含有NPTX2抗原的质控品。
上述的质控品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为质控品稀释液,NPTX2抗原用质控品稀释液梯度稀释至500pg/mL和1000pg/mL。
上述的浓缩洗液为包含Tween-20的磷酸盐缓冲液。
发光底物液为吖啶酯的发光底物溶液。
将上述各组分,组装成试剂盒,贮存于2-8℃。
试剂盒检测方法如下所示:
1)免疫反应:10μL样本/质控品、20μL磁微粒、100μL酶结合物标记抗体,37℃温育30min,洗涤6次。
2)磁分离:在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,加入150μL的洗涤液,在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,重复4次,除去未结合的抗体;
3)检测读数:加入发光底物,室温反应,5min内检测发光值。
4)计算:该复合物催化发光底物发出光子,发光强度与NPTX2的含量成正比。选择适当的曲线拟和方式建立标准曲线。本试剂盒推荐采用四参数拟和方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度值的对数(log)值为y轴建立标准曲线,根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。
具体制备过程中使用的NPTX2抗体为Abcam公司提供,使用的NPTX2抗原为Abcam公司提供,碱性磷酸酶购自英国BBI公司,2-IT购自thermo fisher scientific公司,SMCC购自thermo fisher scientific公司,磁微粒购自thermo fisher scientific公司,EDC购自sigma公司,NHS购自sigma公司,吖啶酯购自英国BBI公司。
NPTX2磁微粒混悬液制备
1)活化:20μL磁微粒原液,加入100μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS,200r/min,活化0.5-1h。EDC溶液是将EDC试剂溶解于PH5.0的100mM的MES缓冲液中得到,NHS溶液是将NHS试剂溶解于PH5.0的100mM的MES缓冲液中得到。
2)洗涤:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入300μL MES缓冲液,混匀,磁架上分离弃去上清液,洗涤2次。
3)包被:加入MES缓冲液和预包被抗体,(磁微粒和抗体的质量比为80:1)混匀后,室温反应8-12h。
4)封闭:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入100-300μL磁微粒封闭液,摇匀后,室温反应8-12h。
5)将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入一定的磁珠封保液,得到NPTX2磁微粒混悬液。
NPTX2抗体标记物制备
碱性磷酸酶标记抗体制备
1)除盐:将抗体的缓冲体系使用脱盐柱换成TSE缓冲液;将碱性磷酸酶的缓冲体系使用脱盐柱换成ALP透析缓冲液pH 7.6碱性磷酸酶的质量为抗体的1.5-2倍)。除盐使用Sephadex G25凝胶柱子除盐。TSE PH8.5缓冲液(1000g):纯化水,氯化钠5.84g,三乙醇胺14.92g,EDTA.2Na.2H2O 0.41g。
2)离心浓缩:抗体的浓度在2-4mg/mL范围内,碱性磷酸酶的浓度在3-5mg/mL范围内。
3)活化:2-IT溶解于2-IT稀释液配制成13.5mg/ml,室温,活化抗体30min。SMCC溶解于DMF配制成6.5mg/ml,室温,活化抗体30min。NPTX2抗体活化用到的活化剂为2-IT(2-Iminothiolane hydrochloride),碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC(Succinimidy 4-(N-maleimidomethy1)cyclohexane-1-carboxylate)。
4)反应:抗体与碱性磷酸酶的反应可按照质量比例进行混合后反应。放于2-8℃中反应12h以上。
5)终止反应:首先,加入10mM马来酰亚胺,室温反应10min。再加入乙醇胺100mM的量终止反应。
6)分离纯化:用纯化柱SuperdexTM200分离纯化,除去未结合的NPTX2抗体和碱性磷酸酶。抗体标记物浓缩液保存于2-8℃。
7)NPTX2抗体标记物:将NPTX2抗体标记物浓缩液,用含有1%BSA
0.1%Tween-20,0.1%P-300,5mM MgCl2的Tris缓冲液作为抗体标记物稀释液进行稀释,稀释比例为1:500-1:3000.
吖啶酯标记抗体制备
1)反应:抗体的浓度在1-5mg/mL范围内,吖啶酯浓度在5-10mmol/L,抗体与吖啶酯的反应可按照质量比例进行混合后反应。放于37℃中反应2h以上。
2)封闭:加入浓度为5-15g/L的赖氨酸溶液封闭15-60min。
3)纯化:使用脱盐层析柱纯化,除去未结合的NPTX2抗体和吖啶酯。加入抗体标记物等体积的甘油,-20℃保存。
4)抗体标记物:将标记抗体浓缩液,用含有1%BSA,0.1%Tween-20,0.1%P-300的Tris缓冲液作为抗体标记物稀释液进行稀释,稀释比例为1:1000-1:5000.
上述的校准品为含有NPTX2抗原的校准品。
上述的校准品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为校准品稀释液,用校准品稀释液梯度稀释NPTX2抗原,稀释至工作浓度,分别为50,100,250,500,1000,3000pg/mL。
上述的质控品为含有NPTX2抗原的质控品。
上述的质控品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为质控品稀释液,NPTX2抗原用质控品稀释液梯度稀释至500pg/mL和1000pg/mL。
上述的浓缩洗液为包含Tween-20的磷酸盐缓冲液,洗涤液工作浓度:用纯化水稀释10倍使用。
上述的发光底物液为碱性磷酸酶发光底物溶液或吖啶酯的发光底物溶液。
试剂盒检测方法如下所示:
1)免疫反应:10μL样本/质控品、20μL磁微粒、100μL酶结合物标记抗体,37℃温育30min,洗涤6次。
2)磁分离:在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,加入150μL的洗涤液,在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,重复4次,除去未结合的抗体;
3)检测读数:加入发光底物检测发光值。
4)计算:该复合物催化发光底物发出光子,发光强度与NPTX2的含量成正比。选择适当的曲线拟和方式建立标准曲线。本试剂盒推荐采用四参数拟和方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度值的对数(log)值为y轴建立标准曲线,根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。
本发明试剂盒的性能指标
1)准确度:将浓度约为3000pg/mL(允许其浓度偏差为±20%)的人神经元正五聚蛋白Ⅱ样本A加入到浓度范围在150~300pg/mL的人神经元正五聚蛋白Ⅱ样本B中,所加入样本A与样本B之间的体积比为1:9,用试剂盒检测混合后的样本,重复检测3次,根据下面公式计算回收率(R),式中:R-回收率;V-加入A液体积;V0-血清B的体积;C-血清样品加入A液后的检测浓度;C0-血清样品B的检测浓度;Cs-A液的浓度。回收率在85%~115%之间。
2)空白限:用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的吸光值,计算其平均值(M)和标准差(SD),得出M+2SD所对应的吸光值,根据试剂盒所用校准品的定标曲线,将M+2SD所对应的吸光值带入方程,求出对应的浓度值,即为空白限。
3)重复性:高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清检测,各重复检测10次,分别计算10次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于10%。
4)批间重复性:分别用三批试剂,检测高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清,每次各重复检测10次,分别计算30次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于15%。
5)线性:将接近线性区间上限的NPTX2高值样本用阴性血清按一定比例稀释为至少5个浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。用试剂盒将每一浓度重复检测2次,分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释比例(xi)为自变量,以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r),r≥0.9900.
本方法学评价结果
1)准确度:通过稀释回收评价准确度,结果在85%~115%之间。
2)空白限:不大于20pg/mL。
3)重复性:分析内重复性≤10%,分析间重复性≤15%。
4)剂量-反应曲线线性:在20-3000pg/mL范围内,剂量-反应曲线相关性系数r≥0.99.
5)样本测定:对50例AD患者样本进行比较测定,并与Western blot测定进行比较,人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)临床符合率85%以上。
本发明利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合,定量检测人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)的含量,实现高通量和自动化检测,检测重复性好,提高了人神经元正五聚蛋白Ⅱ(NPTX2)检测的灵敏度和准确度。
以上对本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒包括校准品、质控品、NPTX2磁微粒混悬液、NPTX2抗体标记物、浓缩洗液、发光底物;
所述的校准品由NPTX2抗原配置而成;
所述的质控品为含有一定浓度的NPTX2抗原,由质控品稀释液配置而成;
所述的NPTX2磁微粒混悬液含有一定浓度磁微粒标记的NPTX2抗体溶液。
2.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的NPTX2磁微粒混悬液制备方法如下所示:
1)活化:20μL磁微粒原液,加入100μL的50mg/mLEDC、50mg/mL NHS,200r/min,活化0.5-1h;EDC溶液是将EDC试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到,NHS溶液是将NHS试剂溶解于pH5.0的100mM的MES缓冲液中得到;
2)洗涤:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入300μL MES缓冲液,混匀,磁架上分离弃去上清液,洗涤2次;
3)包被:加入MES缓冲液和预包被抗体,磁微粒和抗体的质量比为80:1,混匀后,室温反应8-12h;
4)封闭:将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入100-300μL磁微粒封闭液,摇匀后,室温反应8-12h;
5)将上述溶液置于磁架上分离,弃去上清液,加入一定的磁珠封保液,得到NPTX2磁微粒混悬液。
3.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的NPTX2抗体标记物为含有一定浓度的碱性磷酸酶标记的NPTX2抗体溶液或者吖啶酯标记的NPTX2抗体溶液。
4.根据权利要求3所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的碱性磷酸酶NPTX2抗体标记物制备方法如下所示:
1)NPTX2抗体与碱性磷酸酶,碱性磷酸酶的质量为抗体的1.5-2倍,分别除盐、浓缩,然后加入活化剂,室温,分别活化20min;除盐使用Sephadex G25凝胶柱子除盐;NPTX2抗体活化用到的活化剂为2IT,碱性磷酸酶活化用到的活化剂为SMCC;
2)活化后的NPTX2抗体与碱性磷酸酶可按照质量比例进行混合后反应;然后进行终止反应和分离纯化,除去未结合的NPTX2抗体与碱性磷酸酶,制备得到抗体标记物浓缩液,保存于2-8℃;终止反应过程中,首先加入10mM马来酰亚胺,室温反应10min;再加入乙醇胺100mM的量;分离纯化柱为SuperdexTM200。
5.根据权利要求3所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的吖啶酯标记抗体制备方法如下所示:
1)NPTX2抗体与吖啶酯,吖啶酯的质量为抗体的50倍,充分混匀,37度反应2小时以上,加入赖氨酸终止反应;
2)将标记后的吖啶酯标记抗体用脱盐层析柱纯化,收集纯化后的吖啶酯标记抗体,-20℃保存。
6.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:试剂盒检测方法如下所示:
1)免疫反应:10μL样本/质控品、20μL磁微粒、100μL抗体标记物,37℃温育30min,洗涤6次;
2)磁分离:在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,加入150μL的洗涤液,在磁场中将磁微粒沉降,弃上清,重复4次,除去未结合的抗体;
3)检测读数:加入发光底物,室温反应,10s-5min内检测发光值;
4)计算:该复合物催化发光底物发出光子,发光强度与NPTX2的含量成正比;选择适当的曲线拟和方式建立标准曲线;本试剂盒推荐采用四参数拟和方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度值的对数log值为y轴建立标准曲线,根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。
7.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的校准品为含有NPTX2抗原的校准品;
所述的校准品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为校准品稀释液,用校准品稀释液梯度稀释NPTX2抗原,稀释至工作浓度,分别为50,100,250,500,1000,3000pg/mL。
8.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述的质控品为含有NPTX2抗原的质控品;
所述的质控品配置方法:用含有1%casein的Tris缓冲液作为质控品稀释液,NPTX2抗原用质控品稀释液梯度稀释至500pg/mL和1000pg/mL。
9.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒的性能指标确定方法:
1)准确度:将浓度约为3000pg/mL的标准样本A加入到浓度范围在150~300pg/mL的标准样本B中,所加入样本A与样本B之间的体积比为1:9,用试剂盒检测混合后的样本,重复检测3次,根据下面公式计算回收率R,
式中:R-回收率;V-加入A液体积;V0-血清B的体积;C-血清样品加入A液后的检测浓度;C0-血清样品B的检测浓度;Cs-A液的浓度;
2)空白限:用零浓度校准品或样本稀释液作为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的吸光值,计算其平均值M和标准差SD,得出M+2SD所对应的吸光值,根据试剂盒所用校准品的定标曲线,将M+2SD所对应的吸光值带入方程,求出对应的浓度值,即为空白限;
3)重复性:高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清检测,各重复检测10次,分别计算10次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于10%;
4)批间重复性:分别用三批试剂,检测高、低两种不同浓度的质控血清或新鲜人血清,每次各重复检测10次,分别计算30次检测结果的平均值M和标准差SD,根据公式CV=SD/M*100%得出变异系数CV,CV值应不大于15%;
5)线性:将接近线性区间上限的高值样本用阴性血清按一定比例稀释为至少5个浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限;用试剂盒将每一浓度重复检测2次,分别求出检测结果的均值yi;以稀释比例xi为自变量,以检测结果均值yi为因变量求出线性回归方程;计算线性回归的相关系数r,r≥0.9900。
10.根据权利要求1所述的用于NPTX2的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒的评价结果参数限定:
1)准确度:通过回收率评价准确度,结果在85%~115%之间;
2)空白限:不大于20pg/mL;
3)重复性:重复性≤10%,批间重复性≤15%;
4)剂量-反应曲线线性:在20-3000pg/mL范围内,剂量-反应曲线相关性系数r≥0.99;
5)样本测定:对50例AD患者样本进行比较测定,并与Western blot测定进行比较,NPTX2临床符合率85%以上。
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