CN113388542A - 一种多卤代芳烃降解菌及其应用 - Google Patents

一种多卤代芳烃降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于卤代烃污染土壤修复技术领域，具体涉及一种多卤代芳烃降解菌及其在修复污染土壤中的应用。多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2‑5，已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO:M 2021319。本发明所提供的多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2‑5可对多卤代芳烃进行厌氧和好氧生物代谢降解，具有良好的针对多卤代芳烃污染土壤在电动强化微生物修复***中的应用潜力。

Description

一种多卤代芳烃降解菌及其应用
技术领域
本发明属于卤代烃污染土壤修复技术领域，具体涉及一种多卤代芳烃降解菌及其在修复污染土壤中的应用。
背景技术
工业发展给社会经济增长带来了持续动力，但与此同时，早期相对粗放型的工业模式也给发展区域的生态环境带来了负面的影响，各种动力燃料、医疗制药、抗生素生产、阻燃剂生产、农药生产等工厂的产品制备工艺过程中，由于产品装卸泄漏、管道输送事故、副产物不合理排放与违规堆存等原因，造成厂区内及周边土壤受到多卤代有机物不同程度的污染，制约污染场地的应用。
多卤代有机物属于难降解的疏水性有机污染物，亦为重非水相液体，具有“三致效应”的高毒性特征。在多卤代有机物的多个种类中，又以多卤代芳烃因其具有较大的分子量与苯环结构，其降解去除难度进一步加大。在针对多卤代芳烃污染土壤的修复处置中，主要的技术尝试为光解法、低温热解析法、高温热脱附法及生物降解法等。其中，光解法效率不高，且需要不断翻混暴露土壤与光路下；低温热解析与高温热脱附法效果良好，然而较高的处置成本是制约其应用的主要因素，且在当下减碳、降碳的碳达峰理念驱动下，热解析与热脱附等方法不利于节碳操作；生物降解修复针对多卤代芳烃污染土壤的修复具有环境友好、经济方便的优势，然而，生物修复技术普遍存在的低效、耗时的缺陷，同样制约了其应用范围；综合比较分析而言，在有效措施保障下，提高生物修复效率并用其进行多卤代烃污染土壤治理将是最有效、最可取的修复工艺。
对此，高效的生物修复材料与可行的生物修复强化方法，是强化多卤代有机物污染土壤修复的关键因子。当下，已涌现分枝杆菌、芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等多种多卤代烃类有机物降解菌；同时，在生物修复强化方法开发方面，电动修复技术已被认为是石油烃降解菌等有机污染物生物降解菌剂材料强化的可行与有效方法，在电动强化微生物修复体系中，疏水性有机污染物可通过增强微生物丰度、提高微生物代谢酶活性、增加有机污染物的生物可接触性与生物可利用性、增加污染物的电化学氧化作用等过程机制，实现对有机污染物的强化生物修复过程。然而，无论是微生物修复技术，还是电动修复技术，作为单一的修复技术，其持续有效的降解能力还比较有限。现有的适用于电场条件下的卤代烃降解菌的材料研发还较少，特别是适应相对较高电场条件，适用于较宽范围pH环境及在好氧与厌氧条件下均具有电动强化特性的兼性降解菌还未见有报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种多卤代芳烃降解菌及其应用
一种多卤代芳烃降解菌，多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5，已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO:M2021319。
一种多卤代芳烃降解菌的应用，所述菌株在修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。
进一步的说，所述菌株在在电场条件下电动修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。具体为：所述多卤代芳烃的降解能力得到增强，为不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5对多卤代芳烃的厌氧脱卤和好氧矿化代谢降解能力均可得到增强。
一种修复多卤代芳烃污染土壤的菌剂，含所述的菌株。
所述菌剂为将菌株于无机培养基中培养所得培养物或培养物悬液。
所述菌剂中菌株含量为OD600达1.5～2.0为宜。
一种菌剂的应用，所述菌剂在修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。
所述菌剂在修复pH为5～9的多卤代芳烃污染土壤中的应用。
所述菌剂通过电动修复pH为5～9的多卤代芳烃污染土壤中的应用。
所述电动修复***中电场条件范围为0.5～4V/cm。，在2～3V/cm条件下获得最佳的降解功能。
所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在土壤中的氧化还原电位≤10mV时，可作为多卤代芳烃进行厌氧降解中的应用；
或，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在土壤中的氧化还原电位≥120mV时，可作为多卤代芳烃进行好氧降解中的应用；
或，当土壤中的氧化还原电位保持在10～120mV时，不动杆菌(Acinetobactersp.)JWDH2-5，可作为对多卤代芳烃的厌氧脱卤和好氧矿化降解中的应用。
所述卤代芳烃为氯苯、1,4-二氯苯、1,2,4-三氯苯、六氯苯中的一种或几种。
本发明多卤代芳烃具有降解能力，同时在电场作用下该株菌不仅可以生存并能够增强发挥降解功能，其对多卤代芳烃的厌氧脱卤和好氧矿化代谢降解能力均可得到增强。
本发明所具有的优点包括：
1)本发明多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5为兼性好氧菌，可针对≥2个卤代原子的卤代芳烃进行厌氧脱卤降解，还可针对1个以下的卤代原子的卤代芳烃进行好氧矿化降解，从而可以通过调控土壤环境中的氧化还原电位等参数，进行不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5的厌氧和好氧的氧化降解调控，更有利于将难降解的多卤代芳烃进行强效的厌氧脱卤，并更易进行接续的好氧矿化降解，从而有助于多卤代芳烃的完整代谢去除；
2)本发明中所开发的多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5为适宜在更宽范围的电压低度下进行多卤代芳烃降解，在现有的电场适应菌株中，一般均以不高于2V/cm的电压梯度作为应用上限，而本专利中不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5可应用的电场条件中电压梯度范围最高达到4V/cm，且最适电压梯度达到2～3V/cm，由于电化学氧化作用随着电压梯度的增加显著增强，这更加促进了电动对多卤代芳烃生物降解的辅助强化作用；与此同时，电场条件下，电流的作用既会促进不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5对多氯代芳烃的厌氧脱卤过程，又会促进好氧矿化过程，从而使电动对微生物降解的强化租用贯穿整个降解过程；
3)本发明中所开发的多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5，可在pH5.0～9.0的较宽的酸碱范围内生长并对氯代芳烃表现出想好的降解能力，这种较宽pH范围的适应能力具备更大的潜力以与电场条件下所引起的阴阳极区中土壤pH变化相结合，特别针对倒极条件下的电动修复过程更加匹配。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5对多卤代芳烃在摇瓶培养体系中的降解能力。
图2为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5 16SrRNA基因序列。
图3为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5 16SrRNA基因序列的***发育树。
图4为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5的菌落形态照片。
图5为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5的菌体扫描电子显微镜照片。
图6为本发明实施例提供的电动强化微生物修复多卤代芳烃污染土壤***中细菌丰度变化特征。
图7为本发明实施例提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5应用于电动强化微生物修复体系中的四种多卤代芳烃的去除率特征。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明针对多卤代芳烃有机污染物的功能降解菌的筛选及其应用效果通过以下实施例加以详细说明。
本发明以适用于电场条件下的多卤代芳烃降解生物菌剂为核心，同时进一步拓展电场广泛条件下的适应性，为多卤代芳烃污染土壤的电动强化微生物修复技术治理工程应用提供材料基础与技术支撑，实现多卤代芳烃污染土壤的安全、经济、高效的治理修复。
实施例1不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5的分离和筛选
菌源样品来源于北方地区某化工燃料有限公司搬迁后遗留的原厂区地下3m处污染土壤。首先将污染土壤样品进行直流弱电场驯化处理，为了获得宽范围电场梯度适应性的功能菌株，将电场驯化条件设置为0.5～5V/cm的电场条件。电场驯化条件的变化特征为：从0.5V/cm的初始时电压梯度开始，以0.5V/cm的电压梯度逐级增长进行电刺激处理，每一级的处理周期为1h，当电压梯度＞2V/cm后，进行倒极处理，电极切换周期为10min，每个电压梯度的总处理周期仍为1h，当达到最大设计电压梯度5V/cm后，重新开始0.5V/cm的电压梯度处理，循环往复进行，总的电刺激驯化周期为120h。
表1
驯化条件 0.5～2V/cm 2～5V/cm 电压梯度变化 倒极周期 总驯化周期
周期参数 1h 1h 0.5V/cm 10min 120h
将经过电刺激驯化后的污染土壤样品以5％(W/V)的接种比例分别加入到100mL无机盐培养基中，同时加入0.5‰葡萄糖，在150r/min，30℃好氧条件下培养24h，然后在厌氧条件下静置培养48h，获得菌株筛选的种子液。所用无机盐培养基的配方为：MgSO4·7H2O0.2g·L-1，CaCl2 0.01g·L-1，FeSO4·7H2O 0.001g·L-1，Na2HPO4·12H2O 1.51g·L-1，K2HPO4 0.4g·L-1，MnSO4·H2O 0.02g·L-1，NH4NO3 1.0g·L-1，pH 7.0。取5mL种子液加入到95mL无机盐培养基中，再分别加入氯苯、1,4-二氯苯、1,2,4-三氯苯、六氯苯作为碳源底物进行驯化筛选，总底物浓度为10mg/L，各种底物碳源比例等分，驯化培养10d，获得一级筛选培养物；取5mL一级筛选培养物加入到新鲜配置的95mL无机盐培养基中，加入前述的多种多卤代芳烃碳源底物，总底物浓度为25mg/L，继续驯化培养10d，获得二级筛选培养物；再次继续重复上述驯化过程，培养体系中多卤代芳烃碳源底物总体浓度分别增加至50mg/L和100mg/L，两个阶段分别驯化培养10d，将最后一次筛选得到的四级培养物接续进行厌氧筛选培养5d，厌氧驯化培养在厌氧瓶中30℃条件下静置进行，通入普通N2排除空气，总体静置培养，期间可间歇手动摇动培养物；完整的驯化筛选过程共计培养45d。将最终的驯化筛选所得培养物通过无菌水进行梯度稀释，将适当稀释梯度的200μL稀释液涂布在平板表面涂布有前述四种碳源的正己烷溶液的牛肉膏蛋白胨培养基上(即，正己烷作为碳源的溶剂，为了方便将碳源均匀覆盖到平板表面，涂布后正己烷即挥发，不存留在平板培养基上，只留下分别的四种碳源，碳源的含量以覆盖完整的平板表面即可)，待正己烷挥发后，进行菌液平板涂布；将涂布后的培养平板置于恒温培养箱中30℃培养5d。培养至长出成熟菌落后，利用Q-pix 420高通量筛选仪从平板上分别挑取不同形态和颜色的单一菌落，在纯化分离培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)上进行平板划线分离纯化，经多次三级划线纯化培养后，最终获得单一菌株。在无机盐培养基中接种获得的各单一菌株，接种量为20％(V/V)，并分别添加200mg/L的氯苯、1,4-二氯苯、1,2,4-三氯苯、或六氯苯作为多卤代芳烃碳源底物，相继在无氧条件下30℃培养10d，然后在有氧条件下30℃振荡培养7d，通过检测各种碳源底物的降解效率，结果表明，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5针对氯苯、1,4-二氯苯、1,2,4-三氯苯、六氯苯的降解效率均为最高，由此表明，所获得的该株菌株具有最强的多卤代芳烃降解能力(参见1)。
不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5已于2021年4月9日保藏于中国典型微生物保藏中心，其保藏登记号为CCTCC NO:M 2021319。不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5的形态与生理生化特征观察表明：属于革兰氏阴性菌，菌体大小为(0.9～1.6)μm×(1.5～2.5)μm、呈杆状，菌落形态为圆形、无色、表面光滑、***、湿润、边缘整齐，氧化酶阴性，动力阴性，硝酸盐试验阴性(参见图2-5)。
实施例2不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在电动强化微生物修复多卤代芳烃污染土壤中的应用
为了进一步验证不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在电场条件下的土壤体系中对多卤代芳烃降解活性特征，以证明其在污染土壤治理实际工程应用中的能力，人工配置含150ppm氯苯、150ppm 1,4-二氯苯、120ppm1,2,4-三氯苯、100ppm六氯苯的多卤代芳烃污染土壤，配置后经自然状态下老化1个月备用。将预先按实施例1中所述的经厌氧与好氧交替培养所得的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5培养液混入污染土壤中，混入量按1kg污染土壤对应混入1L培养物，以使最终的修复前初始总体细菌微生物丰度达5.8×108CFU/g干土。将混入不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5培养物的污染土壤装至电动强化试验装置盒内，分别在装置中土壤两端各设置两根电极，两侧电极间距为20cm，同侧电极间距为8cm，两端电极分别与电压控制***连接接入电路；由继电器与计时器共同控制倒极过程，倒极周期为30min。电动修复试验盒体上面设置封闭罩，封闭罩两侧各设置一个排气孔，排气孔外接N2输送管路，在各电极侧底部同时接入N2排气孔，在进行厌氧处置时，持续进行以100L/d的通气速率通入N2，以保持电动修复***中的相对无氧状态。
在所有的试验设置中，共设计9个试验处理(表2)分别为微生物修复处理(BIO)、微电压电动强化生物处理(EK-BIO-A)、低电压电动强化生物处理(EK-BIO-L)、中电压电动强化微生物处理(EK-BIO-M)、高电压电动强化生物处理(EK-BIO-H)，每个电动处理又划分为倒极与非倒极处理，总处理周期为60d。试验开始后，0～30d的处理周期内进行电动强化微生物厌氧处理，而后在30～60d的处理周期内进行电动强化微生物好氧处理。每10d进行一次土壤样品采样，并采用气相色谱进行多卤代芳烃残留量测定；同时针对土壤中平均细菌微生物丰度进行分析。
分析结果表明，随着修复过程的进行，土壤中总体细菌微生物的平均丰度呈现逐渐下降的变化趋势，然而，不同处理间存在显著的差异特征。其中，倒极处理的细菌微生物丰度均呈现出高于非倒极组的变化特征；对比不同电压梯度之间的处理，最高的细菌微生物丰度出现在2V/cm的处理组中；在0.5V/cm电压梯度下，微生物丰度的变化同样一定程度上高于非电刺激的BIO处理组；对于4V/cm的高电压梯度条件下，微生物丰度是三种电压梯度下最低的，但仍高于BIO处理组；由此表明，在0.5～4V/cm的电压梯度范围内，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5具有较好的丰度保持特性，尤其以2V/cm的电压梯度下优势最为明显。
针对污染土壤中的四种多卤代芳烃进行气相色谱检测分析，结果表明，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5对四种多卤代芳烃的降解在电场条件下均表现出增强的特征，尽管随着氯代原子量的增加，底物降解率呈现降低的趋势；在四种电压梯度条件下，2V/cm的电压梯度刺激下，四种多卤代芳烃的降解率均表现出总体最高的特征，而4V/cm的电压梯度下，仅针对六氯苯，在厌氧处理阶段效率低于BIO处理，但转换为好氧条件后，最终的六氯苯降解率与BIO处理基本持平，而其他三种多卤代芳烃在高电压梯度下相比于BIO仍然具有更佳的去除水平。
综上表明，本专利所开发的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5具有宽范围条件(电压梯度)的电场适应性以及良好的多卤代芳烃降解能力，并且在电场刺激条件下具有获得更强的代谢多卤代芳烃等污染底物的潜能。在已有的及已报道的功能菌株材料中(CN1030311256)，如提供了多环芳烃降解菌，适宜于在电场条件下针对多环芳烃进行降解，但该菌株的可行电压梯度条件仅为0.5～2.0V/cm，而本专利中的适宜电压梯度为0.5～4V/cm，由此进一步反映了不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5更加强大与新颖的功能；此外，在针对多卤代芳烃的生物降解材料中，目前还未见可在电场条件下具有强化多卤代芳烃降解能力的功能菌株材料。因此，本专利所提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5将对多卤代芳烃污染土壤的工程修复提供更具潜力的应用前景。
表2
Figure BDA0003107608790000071
序列表
<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所
<120> 一种多卤代芳烃降解菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1373
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcggagat gaggtgcttg caccttatct tagcggcgga cgggtgagta atgcttagga 60
atctgcctat tagtggggga caacattccg aaaggaatgc taataccgca tacgtcctac 120
gggagaaagc aggggatctt cggaccttgc gctaatagat gagcctaagt cggattagct 180
agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatctgtag cgggtctgag aggatgatcc 240
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300
gacaatgggg ggaaccctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttatggttgt 360
aaagcacttt aagcgaggag gaggctactg agactaatac tcttggatag tggacgttac 420
tcgcagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag agggtgcgag 480
cgttaatcgg atttactggg cgtaaagcgt gcgtaggcgg ctttttaagt cggatgtgaa 540
atccccgagc ttaacttggg aattgcattc gatactggga agctagagta tgggagagga 600
tggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccgatggcga 660
aggcagccat ctggcctaat actgacgctg aggtacgaaa gcatggggag caaacaggat 720
tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgtctacta gccgttgggg cctttgaggc 780
tttagtggcg cagctaacgc gataagtaga ccgcctgggg agtacggtcg caagactaaa 840
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 900
acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacata ctagaaactt tccagagatg gattggtgcc 960
ttcgggaatc tagatacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020
gttaagtccc gcaacgagcg caaccctttt ccttacttgc cagcatttcg gatgggaact 1080
ttaaggatac tgccagtgac aaactggagg aaggcgggga cgacgtcaag tcatcatggc 1140
ccttacggcc agggctacac acgtgctaca atggtcggta caaagggttg ctacacagcg 1200
atgtgatgct aatctcaaaa agccgatcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc 1260
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1320
cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtttgttgca ccagaagtag gta 1373

Claims (10)

1.一种多卤代芳烃降解菌，其特征在于：多卤代芳烃降解菌不动杆菌(Acinetobactersp.)JWDH2-5，已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏登记号为CCTCCNO:M 2021319。
2.一种权利要求1所述的多卤代芳烃降解菌的应用，其特征在于：所述菌株在修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。
3.按权利要求2所述的多卤代芳烃降解菌的应用，其特征在于：所述菌株在电动修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。
4.一种修复多卤代芳烃污染土壤的菌剂，其特征在于：含权利要求1所述的菌株。
5.按权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为将菌株于无机培养基中培养所得培养物或培养物悬液。
6.一种权利要求4所述菌剂的应用，其特征在于：所述菌剂在修复多卤代芳烃污染土壤中的应用。
7.按权利要求6所述应用，其特征在于：所述菌剂在修复pH为5～9的多卤代芳烃污染土壤中的应用。
8.按权利要求7所述应用，其特征在于：所述菌剂通过电动修复pH为5～9的多卤代芳烃污染土壤中的应用。
9.按权利要求8所述应用，其特征在于：所述电动修复***中电场条件范围为0.5～4V/cm。
10.按权利要求9所述应用，其特征在于：所述不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在土壤中的氧化还原电位≤10mV时，可作为多卤代芳烃进行厌氧降解中的应用；
或，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5在土壤中的氧化还原电位≥120mV时，可作为多卤代芳烃进行好氧降解中的应用；
或，当土壤中的氧化还原电位保持在10～120mV时，不动杆菌(Acinetobacter sp.)JWDH2-5，可作为对多卤代芳烃的厌氧脱卤和好氧矿化降解中的应用。
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