CN113388523B - 一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻lamb204及其应用 - Google Patents

一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻lamb204及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204及其应用。该海洋微拟球藻LAMB204的分类命名为海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica，保藏号为CGMCC NO.20713，保藏日期为2020年10月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；海洋微拟球藻LAMB204可用于抑制纤毛虫种群增长。该海洋微拟球藻对病害纤毛虫具有抗性，非常适合大规模培养。

Description

一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204及其应用。
背景技术
由于微拟球藻在食品、营养及保健等多个领域均具有重要的应用价值，开发微拟球藻资源已成为获得高附加值生物活性物质及再生生物能源的理想途径，微拟球藻培养规模也逐步扩大。然而，微拟球藻资源的开发也存在一定的限制因素，例如浮游生物等敌害生物的污染便严重制约着微拟球藻的规模化培养，浮游动物能够对藻类进行摄食，影响微拟球藻正常生长，甚至会在短时期内将微拟球藻全部食光，对培养者造成十分严重的经济损失。
现阶段，在微拟球藻的工程化培养领域，尚缺乏有效的污染控制方法。已有研究大多围绕微拟球藻户外培养中原生动物的污染展开，以控制原生动物危害的理化培养条件研究为主，主要集中在改变培养水体pH、温度和氮源等方面，例如通过添加碳酸氢铵降低原生动物繁殖速率，暂时抑制原生动物摄食微拟球藻等。该类方法对淡水藻株培养中的污染尚具备一定的控制效果，但由于海水自身的缓冲能力，其对微拟球藻工程化培养中的原生动物污染控制收效甚微。
基于此，选育一种可以抵抗原生动物摄食的微拟球藻已成为现阶段微拟球藻工程化培养亟待解决的问题。
发明内容
针对微拟球藻工程化培养中的原生动物污染控制效果不理想，微拟球藻易被原生动物摄食的技术问题，本发明提供一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204及其应用，该海洋微拟球藻由野生海洋微拟球藻诱变筛选得到，对病害纤毛虫具有抗性，可显著减少病害纤毛虫的摄食，非常适合大规模培养。
第一方面，本发明提供一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204，分类命名为海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica，保藏号为CGMCC NO.20713，保藏日期为2020年10月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
进一步的，海洋微拟球藻LAMB204对纤毛虫种群增长的抑制率为73.68％。
进一步的，海洋微拟球藻LAMB204的获得方法包括如下步骤：
将野生海洋微拟球藻经诱变处理后的诱变藻株培养至3×107～5×107cells/mL后加入纤毛虫，然后继续培养，直至纤毛虫密度达到相对稳定状态，根据此时纤毛虫密度筛选抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻藻株。
进一步的，野生海洋微拟球藻诱变处理方法为：
向藻液中加入甲基磺酸乙酯得到反应体系，将反应体系置于摇床中在室温黑暗的条件下震荡孵育，然后用硫代硫酸钠溶液终止反应，离心收集藻液，取上清，用硫代硫酸钠溶液再次清洗。
进一步的，海洋微拟球藻LAMB204的培养方法为：
将海洋微拟球藻LAMB204接种到f/2培养基中，光强为100μmol photons/s/m2irradiation。
进一步的，海洋微拟球藻LAMB204的光照周期为12：12。
进一步的，海洋微拟球藻LAMB204的培养温度为20～25℃。
第二方面，本发明提供一种海洋微拟球藻LAMB204在抑制纤毛虫种群增长中的应用。
本发明的有益效果在于，
本发明提供的海洋微拟球藻LAMB204能够对纤毛虫种群增长起抑制作用，且与野生株相比，其抑制作用大幅提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是野生株与诱变株对纤毛虫种群增长抑制效果对比图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1EMS诱变处理
EMS诱变处理开展前，先对野生海洋微拟球藻进行分离纯化处理，包括如下步骤：
(1)取50mL密度为107cell/ml的藻液，在3000rpm、10min的条件下离心收集，然后用新鲜的f/2海水培养基清洗两次，重悬于30mL新鲜的培养基中；
(2)分别取200nL加入96孔板的第一列，然后按照稀释10倍的比例用新鲜f/2海水培养基进行逐级稀释；
(3)稀释后用倒置显微镜观察96孔板，将孔中只有单细胞的孔标记出来；
(4)将96孔板放置在光照培养箱中培养，每天用显微镜观察藻种的数量变化；
(5)待5-7天后，孔板中均出现明显藻液颜色，将由单细胞长出来的藻液稀释100倍涂到已经灭菌的f/2固体平板中，然后倒置于光照培养箱中培养；
(6)待长出单克隆藻落，将藻落接入50mL锥形瓶中扩大培养，保种以备后续诱变实验使用，命名为微拟球藻B。
EMS诱变处理包括以下步骤：
(1)将微拟球藻B培养在f/2海水培养基，f/2海水培养基中每1L海水含有以下物质：
NaNO3：75mg、NaH2PO4·H2O：5mg、Na2SiO3·9H2O：20mg、Na2EDTA：4.36mg、FeCl3·6H2O：3.16mg、CuSO4·5H2O：0.01mg、ZnSO4·7H2O：0.023mg、CoCl2·6H2O：0.012mg、MnCl2·4H2O：0.18mg、Na2MoO4·2H2O：0.07mg、维生素B1：0.1mg、维生素B12：0.5μg、生物素：0.5μg；
培养条件如下：
温度23±1℃，光强100μmol photons/s/m2 irradiation，光照周期12：12，盐度30‰，pH7.8；
(2)当微拟球藻B生长至指数中期时开展诱变，首先离心收集10mL藻液，然后用新鲜的f/2海水培养基清洗两遍，重悬在1mL的f/2海水培养基中；
(3)用血球计数板计数，转移106个藻细胞到1.5mL的离心管中，使藻细胞的终浓度为106cells/mL；
(4)加入EMS母液使EMS的终浓度达到1mol/L，将整个反应体系置于摇床中，在室温黑暗的条件下震荡孵育1h，转速为300rpm；
(5)用10％的DMSO(硫代硫酸钠)溶液终止反应，5000rpm离心10min收集藻液，取上清，用硫代硫酸钠溶液再次清洗，重复2遍去除残留的EMS；
(6)将藻细胞重新重悬在f/2海水培养基中，在室温黑暗的条件下过夜，第二天将诱变后的藻细胞涂至f/2海水固体培养基上；
f/2海水固体培养基由海水与NaNO3等物质混合制备，每1L海水中对应使用以下质量的物质：
NaNO3：75mg、NaH2PO4·H2O：5mg、Na2SiO3·9H2O：20mg、Na2EDTA：4.36mg、FeCl3·6H2O：3.16mg、CuSO4·5H2O：0.01mg、ZnSO4·7H2O：0.023mg、CoCl2·6H2O：0.012mg、MnCl2·4H2O：0.18mg、Na2MoO4·2H2O：0.07mg、维生素B1：0.1mg、维生素B12：0.5μg、生物素：0.5μg、琼脂：10g；
(7)诱变反应中没有死亡的藻细胞18天以后在固体平板上长出单克隆藻落，随机选取单克隆藻落至50mL锥形瓶中，扩大培养。
实施例2抗病害纤毛虫海洋微拟球藻的筛选
(1)将实施例1得到的诱变株和野生株在f/2海水培养基中扩大培养至指数初期后，在超净工作台上以体积比1：10的比例接种到500mL锥形瓶中，接种后将藻液置于光照培养室内培养，培养温度23±1℃，光强100μmolphotons/s/m2 irradiation，光照周期12：12，培养20天，直至藻的密度达到3×107cells/mL；
(2)筛选在24孔板中进行，诱变株、野生株各设置三个重复，将扇形游仆虫分别加入诱变株、野生株的藻液中，每个孔中20只扇形游仆虫，然后将24孔板放置于22℃下光照培养，确定抗病害纤毛虫性能效果好的海洋微拟球藻，命名为LAMB204。
结果如图1所示，以野生海洋微拟球藻为食的游仆虫培养基中，游仆虫的密度在60小时后的指数末期从最初的10ind/mL增加到76ind/mL，并最终维持在52ind/mL的平均密度。与野生海洋微拟球藻相比，海洋微拟球藻LAMB204对游仆虫种群增长有明显的抑制作用，游仆虫指数增长速度更慢、时间更短，最大种群密度为20ind/mL，并最终稳定在12ind/mL的平均密度。
实施例3海洋微拟球藻LAMB204的培养
将海洋微拟球藻LAMB204接种在f/2海水培养基中，培养条件为温度23±1℃，光强100μmol photons/s/m2 irradiation，光照周期12：12，盐度30‰，pH7.8；
f/2海水培养基中每1L海水含有以下物质：
NaNO3：75mg、NaH2PO4·H2O：5mg、Na2SiO3·9H2O：20mg、Na2EDTA：4.36mg、FeCl3·6H2O：3.16mg、CuSO4·5H2O：0.01mg、ZnSO4·7H2O：0.023mg、CoCl2·6H2O：0.012mg、MnCl2·4H2O：0.18mg、Na2MoO4·2H2O：0.07mg、维生素B1：0.1mg、维生素B12：0.5μg、生物素：0.5μg。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一株抗病害纤毛虫的海洋微拟球藻LAMB204，其特征在于，海洋微拟球藻LAMB204的分类命名为海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica，保藏号为CGMCC NO.20713，保藏日期为2020年10月23日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
2.一种如权利要求1所述的海洋微拟球藻LAMB204在抑制游仆虫种群增长中的应用。
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