CN113388016A

CN113388016A - 一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白gsw8及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN113388016A
Application number: CN202110775754.4A
Authority: CN
Inventors: 袁华; 许正艳; 高鹏; 袁敏; 陈薇兰; 李仕贵; 涂斌; 马炳田; 王玉平; 钦鹏
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: CN113388016B; KR20230009299A

Abstract

本发明公开了一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用，该蛋白质GSW8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因在调控水稻粒型和千粒重方面具有生物学功能，能应用于水稻的粒型和千粒重改良，提高水稻产量，具有重要的育种利用价值，同时为研究水稻粒型和千粒重调控机制提供了新的思路。

Description

一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为一半以上的人口提供食物和营养来源，也是我国最重要的粮食作物。据统计，到2030年我国人口将达到16亿，粮食需求总量将从2010年的5.8亿吨增至7.4亿吨。在人口不断增长，可耕土地面积日益减少、环境恶化等问题影响下，粮食生产仍然面临着巨大的压力，因此粮食安全问题越来越受到人们的关注。加之这两年全球新冠疫情的发生，进一步提高水稻产量，对确保我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重要的战略意义。水稻产量构成因素主要包括单株有效穗数、每穗实粒数和千粒重，其中千粒重主要由粒型(包括粒长、粒宽和粒厚)决定，研究水稻粒型相关基因的分子机制、发掘优异等位基因，对提高水稻产量具有十分重要的意义。

迄今，有水稻粒型和千粒重相关基因被克隆，但水稻粒型和千粒重是复杂的数量性状，其分子调控网络仍然还很不清楚，很多基因也没有被应用于水稻育种。因此，迫切需要进一步挖掘更多新基因，为解析粒型调控网络提供新的思路，为育种利用提供新的基因资源。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用，为解析粒型调控网络提供新的思路，为育种利用提供新的基因资源。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8，蛋白GSW8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有相同功能的氨基酸序列。

一种编码权利要求1所述的蛋白GSW8的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

一种表达载体，含有上述基因。

一种调控水稻粒型和千粒重的制剂，该制剂包括上述蛋白质GSW8，或包括能促进上述基因过表达的有效成分。

上述蛋白质GSW8或基因可用于调控水稻粒型和千粒重。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的水稻粒型和千粒重的调控基因，该基因命名为GSW8，其编码的蛋白为GSW8。本发明利用CRISPR/Cas9***编辑GSW8，获得的gsw8-KO突变体，表现为粒宽和千粒重显著降低，明确了该基因在调控水稻粒型和千粒重方面的生物学功能，能应用于水稻的粒型和千粒重改良，提高水稻产量，具有重要的育种利用价值，同时为研究水稻粒型和千粒重调控机制提供了新的思路。

附图说明

图1为GSW8的表达模式定量PCR分析结果图；其中R表示苗期根；LB表示苗期叶片；LS表示孕穗期剑叶；C表示孕穗期茎秆；YP1-YP15表示不同长度的幼穗(cm)；H9-H15表示不同长度幼穗上的颖壳(cm)；E5-E15表示受精后不同天数的颖果(d)。

图2是GSW8敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图；其中，下划线表示PAM序列；“.”表示该位置碱基缺失；WT是野生型中花11。

图3是GSW8敲除载体GSW8-BGK03结构示意图。

图4是野生型中花11和GSW8敲除突变体的氨基酸对比示意图。

图5是野生型中花11与GSW8敲除突变体的粒型对比；A和B图分别是野生型和突变体粒长和粒宽对比，标尺为3mm；C-E图分别是野生型和敲除突变体粒长、粒宽和千粒重数据统计分析，“**”表示在0.01水平下差异显著。

具体实施方式

本发明在蜀恢498的EMS诱变突变体库中鉴定到一个粒型和粒重相关突变体，通过MutMap定位方法，在第8染色体鉴定到候选基因，命名为GSW8(Grain size and grainweight 8)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白GSW8的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。利用CRISPR/Cas9***编辑GSW8，获得的gsw8-KO突变体，表现为粒宽和千粒重显著降低，明确了该基因在调控水稻粒型和千粒重方面的生物学功能。

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：水稻中GSW8基因的表达模式分析

1、定量PCR引物设计

本发明利用定量PCR引物在线设计网站(https://quantprime.mpimp-golm.mpg.de/)，在GSW8的编码区设计一对跨第1和第2外显子的定量PCR引物，具体序列如下：

Y1879-F：5’-GGTGGTTTCATTCTTGGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

Y1880-R：5’-CACATCTTGGGACCCTTTG-3’(SEQ ID NO.4)。

2、RNA提取和反转录

为了分析GSW8表达模式，分别取蜀恢498不同发育时期、不同组织的材料(包括苗期根和叶片，孕穗期茎秆和剑叶，不同长度幼穗、颖壳和受精后不同天数的颖果)保存于-80℃冰箱备用。利用OMEGA的植物RNA提取试剂盒(R6827-01)，按照说明书操作进行，分别提取不同组织的RNA；利用Takara反转录试剂盒(RR047A)，按照说明书操作进行，反转录获得cDNA，用于定量PCR分析。

3、表达谱分析

使用SYBR Green Master Mix kit试剂盒，在qTOWER³G Real-Time PCRthermocycler***进行定量PCR反应，每个样品三次生物学重复，Actin引物作为内参，序列具体如下：

Actin-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’(SEQ ID NO.5)；

Actin-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’(SEQ ID NO.6)。

具体PCR体系如下：

表1定量PCR体系(10μl)

定量PCR反应程序为：95℃预变性3min，然后进行以下循环：95℃变性5s，58℃退火30s，共进行39个循环，最后65℃-95℃(0.5℃/cycles)5s制备溶解曲线。

结果分析发现，GSW8在检测的不同组织中均有表达，属于组成性表达，但在幼穗、颖壳和颖果中高表达(见图1)，这与其调控粒型和千粒重的生物学功能是相符的。

实施例2：GSW8基因的CRISPR/Cas9敲除载体构建和遗传转化

1、CRISPR/Cas9敲除靶位点选择

为了获得功能完全丧失的突变体，我们在GSW8的第1外显子靠近ATG的位置设计了一个敲除靶位点，靶位点序列为：5’-CCAACTAAGCAATGGCCTTT-3’(SEQ ID NO.7)(图2)。

2、CRISPR/Cas9敲除载体构建

本发明利用百格生物技术有限公司的CRISPR/Cas载体构建试剂盒，选择水稻适用的CRISPR/Cas载体BGK03，构建GSW8的敲除载体GSW8-BGK03，具体过程如下：

(1)合成Oligo序列，制备Oligo二聚体

根据上述靶点序列设计与试剂盒对应的Oligo-F和Oligo-R序列，序列分别如下：Oligo-F：5’-TGTGTGCCAACTAAGCAATGGCCTTT-3’(SEQ ID NO.8)；

Oligo-R：5’-AAACAAAGGCCATTGCTTAGTTGGCA-3’(SEQ ID NO.9)。

在成都擎科公司合成上述Oligo引物，将合成的Oligo引物加水溶解至10μM，配制反应体系(18μl Buffer Anneal，1μl Oligo-F，1μl Oligo-R)，混合后，在PCR仪上95℃加热3min，然后以0.2℃/s缓慢降至20℃，即得到Oligo二聚体。

(2)将Oligo二聚体连接至BGK03载体上

在冰上配制连接反应体系(10μl)，配方如下：1μl Enzyme Mix、2μl BGK03Vector、1μl Oligo二聚体、6μl ddH₂O。混匀后，室温反应1小时，即完成连接。

(3)大肠杆菌转化

将DH5α感受态(唯地生物)从-80℃冰箱取出，置于冰上融化，之后加入上述步骤(2)的连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min；之后42℃水浴热激50s，立即放回冰上静置2min；向离心管中加入900μl无抗LB液体培育基(配方见表2)，混匀后置于37℃摇床，180rpm孵育60min；3000rpm室温离心3min收集菌液，留取80μl上清(其余丢弃)轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，置于37℃培养箱培养过夜。

表1LB培养基配方

(4)获得GSW8敲除载体GSW8-BGK03质粒

挑取步骤(3)中LB平板上生长的单克隆，接种于5ml含卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床，200rpm培养过夜；用OMEGA质粒小量提取试剂盒I(D6943)，按照说明书操作步骤提取质粒；将提取的质粒用BGK03载体构建专用测序引物(5’-CCCAGTCACGACGTTGTAA-3’，SEQ ID NO.10)测序验证靶位点序列，获得连接正确的GSW8敲除载体GSW8-BGK03(见图3)。

3、水稻遗传转化

(1)敲除载体质粒转化农杆菌EHA105

将1μl敲除载体的质粒加入1管EHA105感受态细胞中，冰上静置30min；液氮中迅速冷冻2min；37℃金属浴放置5min，溶化细胞；立即加入600μl无抗LB培养基，置于28℃摇床，180rpm培养2-3h；5000rpm，离心3min，留取100μl LB培养基重悬菌体；均匀涂布在含利福平和卡那霉素抗性的LB平板，28℃培养箱培养2-3天。挑取平板上生长的单克隆摇菌，鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌液保存于-80℃冰箱备用。

(2)转化水稻品种中花11

利用农杆菌介导法(参考Hiei et al.1994)，转化野生型水稻品种中花11，用潮霉素进行抗性筛选，获得阳性转基因植株。

实施例3：GSW8基因的敲除植株鉴定和表型分析

1、敲除植株鉴定

获得实施例二中阳性转基因植株之后，分单株取叶片提取DNA，设计跨敲除靶位点的扩增测序引物Y2118-F(5’-TTCGTAGTGCGATTGTTTC-3’，SEQ ID NO.11)和Y2119-R(5’-ACCGACCAAGAGCATTAGA-3’，SEQ ID NO.12)，扩增后测序确认突变情况。如图2所示，一共获得3种不同突变方式的独立敲除株系，命名为KO1-KO3。其中KO1和KO2分别缺失和***1个碱基A，KO3缺失4bp(CTAA)，均导致移码突变，蛋白翻译提前终止(图4)，因此，所获得的GSW8敲除突变体是功能完全丧失型突变体。

2、敲除植株表型分析

获得上述GSW8敲除突变体之后，分别与野生型中花11回交1次，检测获得无载体残留的纯合T3代株系进行表型分析。结果如图5所示，GSW8敲除突变体的粒长与野生型无明显差异，但粒宽显著减小，平均减小10.25％，导致千粒重平均降低17.45％，说明GSW8正调控水稻粒宽和千粒重。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8及其编码基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggttcac ggtttccatc ccaccaacta agcaatggcc tttatgtctc gggccgacca 60

gagcaaccta aggagaaggc tccagtcatt tgctccacag caatgccata cactgggggt 120

gacataaaga aatctggaga actagggaaa atgtttgacc tccatgttga aaagtcgcgg 180

aagtctggtc ctttgggtaa tcaaccttca agaaatactt catttggtgg tgctggttcc 240

aactctggac cagtttctaa tgctcttggt cggtccaact actctggttc tatttcatca 300

tctgttcctg gtgctggagg atcagcaagg gcaaaatcaa attctggacc tctcaataag 360

catggagaac caggaaagaa gtcatctggt ccccagtcag gcggagtgac cccaatggca 420

cgtcagaatt ctggtccttt acctcctgtt cttcctacaa ctgggctgat cacatcaggg 480

cctatctcct ctggacctct gaattcatct ggtgctccac gaaaagtatc aggccctctt 540

gatcctagtg tatcaatgaa gatgcgtgca acttcttttg ctcacaaccc agctgttaca 600

aacctgaatg ccgatgatgg ttactctatt aagggcagca ttcctaagac aatactctgg 660

atggttattc tgctcttttt gatggggttc atagcaggtg gtttcattct tggagctgtt 720

cataacccta ttctgctggt agttgtggtg gtcatatttt gctttgttgc tgctcttgtg 780

atttggaaca tttgctgggg aacaagaggt gtgactgggt tcgtcagtcg ctatcctgat 840

gctgatctca gaacagcaaa agatggacag tatgtgaaag ttactggggt tgttacatgt 900

ggaaattttc ctctcgagtc ctcatttcaa agggtcccaa gatgtgtgta cacttcaact 960

tgcttgtatg agtacagggg ctgggattcg aaagctgcta acactgagca ccgccaattt 1020

acttggggtc ttaggtcaat ggagagacat gctgttgatt tctacatctc tgatttccaa 1080

tctggactac gagcattggt caaaacagga tatggagcac gggtaacccc ttatgttgat 1140

gaatctgttg ttattgacat aaacccagat aacaaggaca tgtctcccga gttcttgaga 1200

tggctgcgtg aaaggaatct atcaagtgat gatcggataa tgcgcctgaa agaaggatac 1260

attaaggagg gcagcacggt gagtgttatg ggggttgttc aaaggaacga caacgtgttg 1320

atgattgttc ctccatcgga acccatctcc actggctgcc agtgggccaa gtgcatcctc 1380

cctactagcc ttgatgggct agtcttaaga tgcgaagata catcgaacat cgatgtaata 1440

ccagtctga 1449

<210> 2

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ser Arg Phe Pro Ser His Gln Leu Ser Asn Gly Leu Tyr Val

1 5 10 15

Ser Gly Arg Pro Glu Gln Pro Lys Glu Lys Ala Pro Val Ile Cys Ser

20 25 30

Thr Ala Met Pro Tyr Thr Gly Gly Asp Ile Lys Lys Ser Gly Glu Leu

35 40 45

Gly Lys Met Phe Asp Leu His Val Glu Lys Ser Arg Lys Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Gly Asn Gln Pro Ser Arg Asn Thr Ser Phe Gly Gly Ala Gly Ser

65 70 75 80

Asn Ser Gly Pro Val Ser Asn Ala Leu Gly Arg Ser Asn Tyr Ser Gly

85 90 95

Ser Ile Ser Ser Ser Val Pro Gly Ala Gly Gly Ser Ala Arg Ala Lys

100 105 110

Ser Asn Ser Gly Pro Leu Asn Lys His Gly Glu Pro Gly Lys Lys Ser

115 120 125

Ser Gly Pro Gln Ser Gly Gly Val Thr Pro Met Ala Arg Gln Asn Ser

130 135 140

Gly Pro Leu Pro Pro Val Leu Pro Thr Thr Gly Leu Ile Thr Ser Gly

145 150 155 160

Pro Ile Ser Ser Gly Pro Leu Asn Ser Ser Gly Ala Pro Arg Lys Val

165 170 175

Ser Gly Pro Leu Asp Pro Ser Val Ser Met Lys Met Arg Ala Thr Ser

180 185 190

Phe Ala His Asn Pro Ala Val Thr Asn Leu Asn Ala Asp Asp Gly Tyr

195 200 205

Ser Ile Lys Gly Ser Ile Pro Lys Thr Ile Leu Trp Met Val Ile Leu

210 215 220

Leu Phe Leu Met Gly Phe Ile Ala Gly Gly Phe Ile Leu Gly Ala Val

225 230 235 240

His Asn Pro Ile Leu Leu Val Val Val Val Val Ile Phe Cys Phe Val

245 250 255

Ala Ala Leu Val Ile Trp Asn Ile Cys Trp Gly Thr Arg Gly Val Thr

260 265 270

Gly Phe Val Ser Arg Tyr Pro Asp Ala Asp Leu Arg Thr Ala Lys Asp

275 280 285

Gly Gln Tyr Val Lys Val Thr Gly Val Val Thr Cys Gly Asn Phe Pro

290 295 300

Leu Glu Ser Ser Phe Gln Arg Val Pro Arg Cys Val Tyr Thr Ser Thr

305 310 315 320

Cys Leu Tyr Glu Tyr Arg Gly Trp Asp Ser Lys Ala Ala Asn Thr Glu

325 330 335

His Arg Gln Phe Thr Trp Gly Leu Arg Ser Met Glu Arg His Ala Val

340 345 350

Asp Phe Tyr Ile Ser Asp Phe Gln Ser Gly Leu Arg Ala Leu Val Lys

355 360 365

Thr Gly Tyr Gly Ala Arg Val Thr Pro Tyr Val Asp Glu Ser Val Val

370 375 380

Ile Asp Ile Asn Pro Asp Asn Lys Asp Met Ser Pro Glu Phe Leu Arg

385 390 395 400

Trp Leu Arg Glu Arg Asn Leu Ser Ser Asp Asp Arg Ile Met Arg Leu

405 410 415

Lys Glu Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Ser Thr Val Ser Val Met Gly Val

420 425 430

Val Gln Arg Asn Asp Asn Val Leu Met Ile Val Pro Pro Ser Glu Pro

435 440 445

Ile Ser Thr Gly Cys Gln Trp Ala Lys Cys Ile Leu Pro Thr Ser Leu

450 455 460

Asp Gly Leu Val Leu Arg Cys Glu Asp Thr Ser Asn Ile Asp Val Ile

465 470 475 480

Pro Val

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtggtttca ttcttggag 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacatcttgg gaccctttg 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactctggtg atggtgtcag c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctggaaga ggacctcagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaactaagc aatggccttt 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgtgccaa ctaagcaatg gccttt 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacaaaggc cattgcttag ttggca 26

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccagtcacg acgttgtaa 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcgtagtgc gattgtttc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accgaccaag agcattaga 19

Claims

1.一种调控水稻粒型和千粒重的蛋白GSW8，其特征在于，所述蛋白GSW8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有相同功能的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的蛋白GSW8的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因。

4.一种调控水稻粒型和千粒重的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述蛋白质GSW8，或包括能促进权利要求2所述基因过表达的有效成分。

5.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在调控水稻粒型和千粒重中的应用。