CN110184280B

CN110184280B - 一种控制水稻粒长和千粒重的glw10基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN110184280B
Application number: CN201910531566.XA
Authority: CN
Inventors: 陈薇兰; 袁华; 钦鹏; 李仕贵; 刘艺; 邓朝杨; 涂斌; 王玉平; 马炳田; 陈郡雯
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN110184280A

Abstract

本发明公开了一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。

Description

一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程及遗传育种技术领域，具体涉及一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国65％以上的人口以稻米为主食，稻米消费量极其巨大。水稻是我国第一大粮食作物，其种植面积、总产和单产均居粮食作物首位，在保障国家粮食安全中起着决定性作用。但近年来，随着我国人口持续增加、而农业劳动力数量不断减少、以及可耕地面积逐年减少、全球气候变暖等环境影响加剧，使我国水稻产业发展面临多方面挑战。因此，进一步提高水稻产量，对于确保我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重要的战略意义。

水稻产量属于复杂的农艺性状，由单株有效穗数、每穗粒数、结实率和千粒重组成，这些性状均是复杂的数量性状。千粒重作为水稻产量的直接组成因素之一，它是由粒型和籽粒充实度决定的。粒型主要包括粒长，粒宽以及粒厚3个方面。粒型不仅会影响水稻产量，而且还会影响水稻品质，尤其是其外观品质。因此挖掘粒型相关基因的遗传基础对水稻高产优质育种是十分必要的，目前已经有大量的粒型相关基因或者QTL位点被克隆，其中，粒长主效QTL位点包括：GS3、GL3.1、GS2、OsLG3、OsLG3b/LGY3、TGW3/GL3.3等；粒宽主效QTL位点包括：GW2、GS5、GW8、GW5/GSE5、GL7/GW7、OsOTUB1等。

虽然目前已经报道不少粒型相关基因，但是对这些基因的调控机制研究仍然还只是片面化的，尤其是基因之间的互作关系，调控网络等还不清楚，迫切需要进一步挖掘粒型和千粒重相关基因。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用，该基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述GLW10基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。

包含上述GLW10基因的质粒。

包含上述GLW10基因的重组表达载体。

包含上述GLW10基因的转基因细胞系。

包含上述GLW10基因的工程菌。

上述GLW10基因在改良水稻粒长和千粒重，提高水稻产量中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明利用蜀恢498的EMS诱变小粒突变体glw10为研究材料，利用BSA混池测序，结合MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因。利用CRISPR/Cas9***编辑GLW10获得敲除转基因株系，敲除株系与野生型相比粒长显著降低，千粒重下降。而过量表达GLW10的转基因植株表现为粒长和千粒重显著增加，说明GLW10具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。

附图说明

图1为GLW10基因敲除载体GLW10-BGK03结构示意图；

图2为GLW10基因过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP结构示意图；

图3为GLW10基因敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图；“.”表示该位置碱基缺失；

图4为GLW10基因敲除株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；

图5为GLW10基因敲除株系粒长和粒宽示意图；标尺为3mm；

图6为GLW10基因过量表达转基因株系定量检测；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；

图7为GLW10基因过量表达转基因株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；

图8为GLW10基因过量表达转基因株系粒长和粒宽示意图，标尺为3mm。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

本发明在蜀恢498的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变突变体库中意外发现一个小粒突变体glw10，将glw10与野生型蜀恢498杂交构建F₂分离定位群体，将群体中极端小粒单株进行BSA混池测序，利用MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因；利用CRISPR/Cas9***敲除GLW10，发现该基因在调控水稻粒长和千粒重方面的功能。

实施例1 GLW10的CRISPR/Cas9敲除载体构建

本发明利用百格公司的CRISPR/Cas载体构建试剂盒构建GLW10的敲除载体，具体过程如下：

(1)利用http://skl.scau.edu.cn/网站的targetDesign在线工具，设计敲除靶位点；在网站输入GLW10基因核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，生成19bp的gRNA靶点序列T1，该靶点序列如下：

T1：5’-GGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’(SEQ ID NO.3)

(2)将以上靶点序列T1输入百格公司Oligo序列在线设计网站(http://121.41.105.238/index/excrispr)，选择BGK03载体，生成与试剂盒对应的Oligo序列，Oligo-F和Oligo-R序列如下：

Oligo-F：5’-TGTGTGGGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’(SEQ ID NO.4)

Oligo-R：5’-AAACGCTTGGACAGGAAGCACCCCA-3’(SEQ ID NO.5)

由生工生物公司合成以上Oligo-F和Oligo-R序列，然后将合成的Oligo-F和Oligo-R引物加水溶解至10μM。

(3)按照百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒说明书进行如下操作：

步骤1：制备Oligo二聚体

配制PCR反应体系(18μL Buffer Anneal，1μL Oligo-F，1μL Oligo-R)混匀后，用PCR仪按照如下反应程序进行：95℃加热3分钟，之后以0.2℃/秒的速度缓慢降至20℃，冷却复性之后即得到Oligo二聚体。

步骤2：将以上Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体

在冰上配制反应体系(2μL CRISPR/Cas Vector、1μL Oligo二聚体、1μL EnzymeMix，最后加水至10μL)混匀后，室温反应1小时。

步骤3:将以上反应体系转化大肠杆菌

将大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1(北京全式金生物技术有限公司)从-80℃中取出，置于冰水浴中融化；再加入步骤2制备得到的5μL反应体系，轻轻混匀，冰上孵育30分钟(不要晃动)；之后置于42℃金属浴，热激60秒后，立刻置于冰水浴中，静置2分钟；再向离心管中加入500μL无抗LB液体培养基，37℃金属浴复苏10分钟；之后置于摇床，200rpm、37℃振荡培养1小时，使菌体复苏；吸取适当体积菌液，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的LB平板上轻轻涂匀，37℃倒置培养过夜。

步骤4：提取质粒，获得GLW10敲除载体GLW10-BGK03。

挑取以上LB平板上的单克隆摇菌提取质粒(按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书进行)，将质粒送生工生物公司进行测序，得到测序正确的载体GLW10-BGK03(见图1)。

实施例2 GLW10过量表达载体构建

利用Takara公司的反转录试剂盒，按照说明书操作，将500ng总RNA用于反转录合成cDNA。以该合成的cDNA为模板扩增GLW10基因的编码区序列(SEQ ID NO.1)，扩增引物F和R分别带KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点(下划线所示序列)，序列如下所示：

F：5’-CGGGGTACCATGGGGTGCTTCCTGTCCA-3’(SEQ ID NO.6)

R：5’-CGCGGATCCACCTCGCCAGCTATTTTG-3’(SEQ ID NO.7)

将以上扩增获得的GLW10基因编码区序列，利用T4连接酶，连接到植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP的KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，得到GLW10的过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP(见图2)。

实施例3 GLW10敲除载体以及过量表达载体转化水稻日本晴

(1)将以上构建好的GLW10敲除载体GLW10-BGK03以及过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP的质粒分别转化农杆菌EHA105

农杆菌转化方法的具体过程为：从-80℃冰箱取出EHA105感受态细胞，快速放手心化冻；加1μL质粒于1管感受态细胞中，冰上放置30分钟；液氮中冷冻2分钟；37℃水浴5分钟，溶化细胞；之后立即加入5倍体积的无抗LB培养基，于28℃、170rpm的条件下摇床培养2-3小时后；于7000rpm离心2分钟，再悬浮细胞于体积为100μL的LB培养基中；然后涂布在含利福平以及卡那霉素抗性的LB平板上，吹干，28℃培养2-3天。

(2)将上述转化农杆菌之后的敲除载体和过量表达载体，利用农杆菌介导的方法，分别转化野生型水稻日本晴品种，获得GLW10的敲除以及过量表达转基因植株。

实施例4 GLW10敲除植株的鉴定及表型分析

获得实施例3中的GLW10敲除转基因植株后，取叶片提取DNA，利用检测引物KO-F和KO-R扩增测序，确定敲除植株突变方式；引物KO-F和KO-R的具体序列如下：

KO-F:5’-TGCTTCCCTACTACACACT-3’(SEQ ID NO.8)

KO-R:5’-GGAATGTACTAGCAGCAA-3’(SEQ ID NO.9)

一共获得3种不同突变方式的敲除突变体株系，命名为KO1，KO2和KO3(见图3)。考察敲除突变体各株系粒型表型，并与野生型日本晴(WT)进行对比，其结果见图4和图5。

图4为GLW10敲除突变体株系与野生型日本晴(WT)的水稻粒型检测数据；其中，A为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴(WT)的粒长对比结果；B为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴(WT)的粒宽对比结果；C为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴(WT)的千粒重对比结果。

图5为GLW10敲除突变体株系与野生型日本晴(WT)的水稻籽粒示意图；其中，A为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3与野生型日本晴(WT)水稻粒长示意图；B为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3与野生型日本晴(WT)水稻粒宽示意图；由图4和图5说明，敲除GLW10后，水稻的粒长和千粒重明显下降，具体表现为粒长显著降低10.4％-12％，千粒重显著下降17.9％-21.5％；而粒宽则无明显变化。

实施例5：GLW10过量表达植株的鉴定及表型分析

获得实施例3中的GLW10过量表达植株后，分单株取叶片提取总RNA(利用OMEGA公司的植物RNA提取试剂盒，按照说明书进行)。利用Takara公司的反转录试剂盒，按照说明书操作，将500ng总RNA用于反转录合成cDNA。用引物qGLW10进行荧光定量PCR检测，以ACTIN引物作为内参。荧光定量检测引物序列如下：

qGLW10-F：5’-GTATGGACCTTACAGCAGTA-3’(SEQ ID NO.10)

qGLW10-R：5’-GAGATGCTGAATACCAAGAAG-3’(SEQ ID NO.11)

ACTIN-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’(SEQ ID NO.12)

ACTIN-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’(SEQ ID NO.13)

对3个定量检测为过量表达的独立转基因株系OE1，OE2和OE3(见图6)，进行粒型考察，并与野生型日本晴进行对比，其结果见图7和图8。

图7为GLW10过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)的水稻粒型检测数据；其中，A为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)籽粒粒长检测数据；B为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)籽粒粒宽检测数据；C为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)籽粒千粒重检测数据。

图8为GLW10过量表达植株与野生型日本晴(WT)的水稻籽粒示意图；其中，A为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)籽粒粒长检测示意图；B为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴(WT)籽粒粒宽检测示意图；由图7和图8说明，GLW10过表达能够提升水稻的粒长和千粒重，具体表现为，粒长增加的幅度与表达水平呈正相关，最终千粒重显著增加8.5％-12.6％，而粒宽无显著差异。

由此，综上所述，GLW10基因能正调控水稻粒长和千粒重，可应用于增加水稻粒长和千粒重，提高水稻产量。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1539

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggggtgct tcctgtccaa gccggcgggg gcgggtcccc tcccgcccaa cgacgccgcc 60

gcgctccccg ccgacaaccc cgcagatccc gaggcggcgg ccgcgaatgg cggcgctgac 120

tccgcggcgg ccgacggcgg cggcgacgac aaggacgccg ccaagcgcgc ggtcccggtg 180

ttcagggagt tcggcctcgc cgagctgcgc gccgccacca agggcttcag cgccgacctc 240

atcgtctccg agagcggcga gaaggccccc aacgtcgtct accgcggccg cctcgacggc 300

ggccgcctca tcgccgtcaa gcgcttctcc cgcctctcct ggcccgaccc gcagcagttc 360

ctcgcggagg cggccggggt ggggaaggtg cgccacaagc gcctcgtcaa cctcatcgga 420

tgctgcgccg agggcgacga gaggctgctc gtcgccgagt acatgcccaa cgacaccctt 480

tccaagcatc tcttccactg ggataagcag cccttgccat gggaaatgcg gttaagggtt 540

gcgtattaca ttgcgcaggc actcgatcac tgcaatgccg agaaccgaaa aatctatcat 600

gacttgaatg cttatagagt actttttgat gaggaaggtg atcctcggct gtcaagtttt 660

ggactaatga agaacagccg cgatgggaaa agttatagca ctaatctggc ttacaccccg 720

cctgagtttc tacgaactgg cagagtcatc gccgagagtg tgatatatag ctatggaaca 780

gttcttttgg atcttttgag tgggaagcac atacctccta gccatgcact tgatttgata 840

agagggaaga atatactgtt gctcatggat tcctccttag aagggcagta tgctaatgaa 900

gatgcttcaa aactagttga ccttgcgtcg aaatgcttgc aatttgaagc gagggacaga 960

cccaatataa agtatctctt gtcttctgtt gggcctcttc agaagcaaaa ggaggtagca 1020

tcacatgtgt tgatgggtat tacaaaagcc acggcggtgt tgccaactat tctttctccc 1080

cttgggaagg cctgttccgg tatggacctt acagcagtac atgatatatt gctcaaaaca 1140

ggttacaaag atgaagaagg tgcagaaaat gagctgtcct ttcaagaatg gactcagcaa 1200

gtgcaagaga tgctgaatac caagaagttt ggtgacattg catttagaga caaggatttc 1260

aagactgcaa ttgactacta ctccaagctt gttggaatga tgtcagtgcc ttcagccaca 1320

gtttttgccc ggagaagttt ctcctatttg atgaatgggc agtcagagct tgctctccgg 1380

gacgcaatgc aggcccaggt ctgcatgccc gagtggccaa ctgccttcta cctacaagcc 1440

cttgctctct caaagctcgg catggaaact gacgcacaag atatgctaaa cgatggagcc 1500

acttttgagg ccaagaagca aaatagctgg cgaggttag 1539

<210> 2

<211> 512

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Cys Phe Leu Ser Lys Pro Ala Gly Ala Gly Pro Leu Pro Pro

1 5 10 15

Asn Asp Ala Ala Ala Leu Pro Ala Asp Asn Pro Ala Asp Pro Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Asn Gly Gly Ala Asp Ser Ala Ala Ala Asp Gly Gly Gly

35 40 45

Asp Asp Lys Asp Ala Ala Lys Arg Ala Val Pro Val Phe Arg Glu Phe

50 55 60

Gly Leu Ala Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Gly Phe Ser Ala Asp Leu

65 70 75 80

Ile Val Ser Glu Ser Gly Glu Lys Ala Pro Asn Val Val Tyr Arg Gly

85 90 95

Arg Leu Asp Gly Gly Arg Leu Ile Ala Val Lys Arg Phe Ser Arg Leu

100 105 110

Ser Trp Pro Asp Pro Gln Gln Phe Leu Ala Glu Ala Ala Gly Val Gly

115 120 125

Lys Val Arg His Lys Arg Leu Val Asn Leu Ile Gly Cys Cys Ala Glu

130 135 140

Gly Asp Glu Arg Leu Leu Val Ala Glu Tyr Met Pro Asn Asp Thr Leu

145 150 155 160

Ser Lys His Leu Phe His Trp Asp Lys Gln Pro Leu Pro Trp Glu Met

165 170 175

Arg Leu Arg Val Ala Tyr Tyr Ile Ala Gln Ala Leu Asp His Cys Asn

180 185 190

Ala Glu Asn Arg Lys Ile Tyr His Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Val Leu

195 200 205

Phe Asp Glu Glu Gly Asp Pro Arg Leu Ser Ser Phe Gly Leu Met Lys

210 215 220

Asn Ser Arg Asp Gly Lys Ser Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Tyr Thr Pro

225 230 235 240

Pro Glu Phe Leu Arg Thr Gly Arg Val Ile Ala Glu Ser Val Ile Tyr

245 250 255

Ser Tyr Gly Thr Val Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro

260 265 270

Pro Ser His Ala Leu Asp Leu Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Leu Leu

275 280 285

Met Asp Ser Ser Leu Glu Gly Gln Tyr Ala Asn Glu Asp Ala Ser Lys

290 295 300

Leu Val Asp Leu Ala Ser Lys Cys Leu Gln Phe Glu Ala Arg Asp Arg

305 310 315 320

Pro Asn Ile Lys Tyr Leu Leu Ser Ser Val Gly Pro Leu Gln Lys Gln

325 330 335

Lys Glu Val Ala Ser His Val Leu Met Gly Ile Thr Lys Ala Thr Ala

340 345 350

Val Leu Pro Thr Ile Leu Ser Pro Leu Gly Lys Ala Cys Ser Gly Met

355 360 365

Asp Leu Thr Ala Val His Asp Ile Leu Leu Lys Thr Gly Tyr Lys Asp

370 375 380

Glu Glu Gly Ala Glu Asn Glu Leu Ser Phe Gln Glu Trp Thr Gln Gln

385 390 395 400

Val Gln Glu Met Leu Asn Thr Lys Lys Phe Gly Asp Ile Ala Phe Arg

405 410 415

Asp Lys Asp Phe Lys Thr Ala Ile Asp Tyr Tyr Ser Lys Leu Val Gly

420 425 430

Met Met Ser Val Pro Ser Ala Thr Val Phe Ala Arg Arg Ser Phe Ser

435 440 445

Tyr Leu Met Asn Gly Gln Ser Glu Leu Ala Leu Arg Asp Ala Met Gln

450 455 460

Ala Gln Val Cys Met Pro Glu Trp Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Gln Ala

465 470 475 480

Leu Ala Leu Ser Lys Leu Gly Met Glu Thr Asp Ala Gln Asp Met Leu

485 490 495

Asn Asp Gly Ala Thr Phe Glu Ala Lys Lys Gln Asn Ser Trp Arg Gly

500 505 510

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtgcttcc tgtccaagc 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgtggggt gcttcctgtc caagc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacgcttgg acaggaagca cccca 25

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggggtacca tggggtgctt cctgtcca 28

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca cctcgccagc tattttg 27

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcttcccta ctacacact 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaatgtact agcagcaa 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtatggacct tacagcagta 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagatgctga ataccaagaa g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gactctggtg atggtgtcag c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggctggaaga ggacctcagg 20

Claims

1.一种GLW10基因在控制水稻粒长和千粒重提升水稻产量中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种包含GLW10基因的质粒在控制水稻粒长和千粒重中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种包含GLW10基因的重组表达载体在控制水稻粒长和千粒重中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种包含GLW10基因的工程菌在控制水稻粒长和千粒重中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。