CN111944772B - 茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白及编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白及编码基因,所述基因的cDNA具有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因参与调控光敏感型茄子花青素合成和下胚轴伸长,在根、茎、叶、花、果皮、萼片、果肉均有表达,在花青素富集部位的表达量显著高于其它组织。本发明为今后利用基因工程技术改良茄子品质提供理论依据,具有很大的应用价值。

Description

茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白及编码基因
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及茄子光信号通路中的关键酶及其编码基因,具体涉及一种茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1(blue light inhibitor 1 ofcryptochromes)蛋白及其编码基因。
背景技术
BIC1在植物中是一种隐花色素蓝光抑制因子,它可以和蓝光受体CRY1和CRY2互作调控植物的光形态建成。研究发现,在黑暗条件下,CRYs以无活性的单体存在,光照使CRYs转变为活跃的二聚体,从而触发一系列光形态发生,然而BIC1蛋白会通过抑制CRYs的二聚化,来维持细胞的光敏性,从而参与调控植物的光形态建成。
BIC1可以调控植物光形态建成和花青素合成过程中的转录因子,比如,HY5、TT8、MYB1、LZF1、HFR1和CO等。BIC1通过抑制HY5、LZF1和HFR1来调控拟南芥幼苗下胚轴的伸长,抑制HY5、TT8、MYB1调控茄子花色素苷的积累,通过调控CO的蛋白稳定性来调控拟南芥的光周期开花。
BIC1调控了植物的光形态建成,那么光又是如何调控BIC1的呢?研究发现,BIC1的转录不只是受蓝光调控,红光和远红光同样可以促进BIC1的表达,同时红光、远红光受体以及蓝光受体都能通过COP调控HY5的表达,因此推测光是通过HY5调控BIC1的转录。
目前,只在拟南芥中克隆得到BIC1基因,并对其进行了功能分析。茄子为数不多富含花青素的重要的蔬菜作物,但相关研究相对比较滞后。目前,未有任何与茄子SmBIC1基因及其编码蛋白的相关文献报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷,本发明的目的在于填补茄子SmBIC1基因的空白,提供一种茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白及编码基因。本发明提供了一种茄子SmBIC1的cDNA以及氨基酸序列;进一步地,本发明提供了茄子SmBIC1基因在不同组织器官的表达模式。本发明还提供了SmBIC1转入拟南芥和茄子后表型发生改变的结果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
第一方面,本发明提供一种茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白,包括SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。
第二方面,本发明提供一种编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因,所述基因的cDNA序列包括:
(a)如SEQ ID NO.1所示第1~420位所示的碱基序列;或
(b)与SEQ ID NO.1所示第1~420位所示的碱基序列具有至少70%的同源性的碱基序列;或
(c)能与SEQ ID NO.1所示第1~420位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
作为本发明的一个实施方案,所述cDNA序列包括SEQ ID NO.1第1~420位所示的核酸序列中1~90个核苷酸的缺失、***和/或取代,以及在5′和/或3′端添加60个以内核苷酸形成的序列。
第三方面,本发明提供一种用于扩增所述茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因的引物对,所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
第四方面,本发明提供一种用于编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因荧光定量PCR分析的引物对,所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
第五方面,本发明提供一种所述编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因在基因工程调控植物下胚轴伸长中的用途。
第六方面,本发明提供一种所述编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因在基因工程调控植物花青素合成中的用途。
作为本发明的一个实施方案,所述植物包括拟南芥、茄子。
在本发明中,术语“SmBIC1基因编码序列”指SEQ ID NO.1所示的第1~420位核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmBIC1相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为1~90个核苷酸的缺失、***和/或取代,以及在5′和/或3′端添加为60个以内核苷酸。
在本发明中,可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmBIC1基因产物的表达模式,即分析茄子SmBIC1基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外,根据本发明的茄子SmBIC1核苷酸序列和氨基酸序列,可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上,筛选茄子SmBIC1相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与茄子SmBIC1相关基因的点阵,可以用DNA探针筛选茄子cDNA文库,这些探针是在低严谨条件下,用32P对茄子SmBIC1相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外,许多这样的cDNA文库也可以购买到,例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmBIC1相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的茄子SmBIC1相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
当获得了有关序列后,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
光信号能调控许多次生代谢途径,例如花青素的合成。茄子是广泛种植的蔬菜作物,紫色茄子的果皮含有丰富的花青素。近年来的研究结果表明,紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
1、将SmBIC1基因在野生型拟南芥和茄子中过表达,可以促进拟南芥和茄子下胚轴的伸长,同时抑制了花青素合成;
2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状,克隆光信号通路中的关键基因SmBIC1,为今后利用基因工程技术改良植物品质,获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据,具有很大的应用价值。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明的茄子SmBIC1蛋白与拟南芥BIC1蛋白的氨基酸序列比较(FASTA)结果,其中,相同的氨基酸在两个序列之间用黑色标出,并用横线标出与蓝光受体CRY互作的CID结构域;
图2为本发明的茄子SmBIC1基因在不同组织的表达情况;
图3为转SmBIC1基因拟南芥植株的RT-PCR检测;
图4为转SmBIC1基因的野生型拟南芥幼苗表型变化情况;
图5为转SmBIC1基因的野生型拟南芥幼苗下胚轴变化情况;
图6为转SmBIC1基因的野生型拟南芥幼苗花青素合成变化情况;
图7为转SmBIC1基因的茄子幼苗表型变化情况;
图8为转SmBIC1基因的茄子幼苗下胚轴变化情况;
图9为转SmBIC1基因的茄子幼苗花青素合成变化情况;
图10为转SmBIC1基因的茄子幼苗花青素合成主要结构基因的变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、茄子SmBIC1基因的克隆
1.植物材料的获得
本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源‘蓝山禾线茄’。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗,生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性,然后在分光光度计(Thermo ScientificNANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
3.基因的全长克隆
基于茄子基因组数据库(http://eggplant.kazusa.or.jp/),利用拟南芥AtBIC1基因的序列,比对找到SmBIC1的同源序列并设计特异引物。将提取RNA进行反转录(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程(大连)有限公司),以第一链cDNA为模板,利用引物
F1(SEQ ID NO.3):5′-ATGTCAACTATGGATGATGGAGATA-3′
R1(SEQ ID NO.4):5′-CTATCCACTTTTGATCTCTAGCATT-3′
进行PCR,扩增得到预期长度后回收并连接到Blunt Simple Vector(北京全式金生物技术有限公司)载体上,转化大肠杆菌DH5α,利用菌落PCR筛选阳性克隆,送至上海生工生物有限公司进行测序,得cDNA序列SEQ ID NO.1。
实施例2、茄子SmBIC1基因的序列信息
本发明新的茄子SmBIC1基因全长CDS开放读框序列为420bp,详细序列见SEQ IDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子SmBIC1的氨基酸序列,共139个氨基酸残基,分子量为15.77KDa,理论等电点(pI)为4.606,详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。
比对茄子SmBIC1编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥AtBIC1蛋白的氨基酸序列,发现茄子SmBIC1和拟南芥AtBIC1一样,也具有与蓝光受体CRY互作的CID domain,如图1所示(SmBIC1:茄子的氨基酸序列;AtBIC1:拟南芥AtBIC1的氨基酸序列;CID domain:与CRY互作的结构域)。由此可见,茄子SmBIC1基因与拟南芥AtBIC1基因具有相似的结构域。
实施例3、茄子SmBIC1基因在不同组织中的表达
1.植物材料的获得
在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、萼片、果皮、果肉,将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中,接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。
2.RNA的提取
采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA,A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。
3.cDNA的获得
以500ng的总RNA为模板,按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子SmBIC1基因序列,利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中SmBIC1基因定量分析的特异性引物,
SmBIC1-F(SEQ ID NO.5):5′-GATGAAGGCAAATCAAGGTGAATGT-3′
SmBIC1-R(SEQ ID NO.6):5′-CTGTTTCATCTTCATCATCCACCAT-3′
内参基因为Actin(GU984779.1),其引物为
SmACTIN-F(SEQ ID NO.7):5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′
SmACTIN-R(SEQ ID NO.8):5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′
5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释,然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板,以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增,反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线,判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰,以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板,分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析,Real-time PCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行,反应体系为20μL。反应采用三步法,95℃变性1min,接着40个循环:95℃30s;58℃30s;72℃45s。每次扩增完成后,均做溶解曲线,以检验扩增产物是否为特异产生。
7.采用2-△△Ct法作相对定量分析。结果表明SmBIC1基因在茄子的根、茎、叶、花、萼片、果皮、果肉中都有表达,其中在花中的表达量最高,其次是叶,而在果肉中的表达量较低,说明SmBIC1基因在合成花青素的部位表达量较高(图2)。
实施例4、茄子SmBIC1基因转拟南芥的功能验证
所用转化载体为PHB,拟南芥材料为野生型(哥伦比亚)植株。将含有SmBIC1-PHB的农杆菌培养至OD 0.8~2.0,6000rpm离心5min,弃上清,菌体沉淀用MS液(购自上海少辛生物科技有限公司)重悬,调整OD600为0.8~1.2,侵染拟南芥花序10~60sec,暗培养12h后正常培养,收集成熟的种子。
收集的T0代转基因种子,铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS(购自上海少辛生物科技有限公司)平板上,4℃春化3d,光照培养箱培养6-10d,选取根长的长,且长出真叶的健壮幼苗,移栽至土盆,培养。收集的T1代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上,选取抗性:不抗比为3:1的株系收集T2代种子。T2代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100%的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real-time PCR检测SmBIC1的表达量(图3)。所用拟南芥actin(NM_179953)引物如下:
SEQ ID NO.9:5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′
SEQ ID NO.10:5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′
将筛选得到的阳性转化株和野生型一起置于8h黑暗/16h光下培养。结果显示,BIC1-OE转基因植株与野生型相比具有更长的下胚轴(图4,5),并且下胚轴的花青素含量也明显低于野生型(图4,6),这说明SmBIC1基因具有促进下胚轴伸长,抑制花青素合成的功能。
实施例5、茄子SmBIC1基因转拟南芥的功能验证
所用转化载体为PHB,茄子材料为‘蓝山禾线茄’。将含有SmBIC1-PHB的农杆菌培养至OD 0.8~2.0,6000rpm离心5min,弃上清,菌体沉淀用MS液重悬,调整OD600为0.8~1.2,侵染预培养2d的外植体15min,吸干表面水分后共培养(暗培养)2d。外植体用无菌水清洗4遍,300mg/L的Cb羧苄青霉素溶液(上海生工生物科技有限公司,CAS:4800-94-6))浸泡30min,接种于第一恢复培养基(MS+玉米素(2.0mg·L-1)+羧苄青霉素(300mg·L-1)+琼脂粉(7.0g·L-1))上,培养7d后进行筛选培养(MS+玉米素(2.0mg·L-1)+羧苄青霉素(300mg·L-1)+潮霉素(50mg·L-1)+琼脂粉(7.0g·L-1))。14d继代培养(MS+玉米素(2.0mg·L-1)+羧苄青霉素(300mg·L-1)+潮霉素(50mg·L-1)+琼脂粉(7.0g·L-1))1次,筛选培养(MS+玉米素(2.0mg·L-1)+羧苄青霉素(300mg·L-1)+潮霉素(50mg·L-1)+琼脂粉(7.0g·L-1))42d,当外植体形成不定芽并有真叶时,将其基部切下,转接至生根培养基(MS+生长素(0.1mg·L-1)+琼脂粉(7.0g·L-1))。待再生植株主根生长至3-5cm,将瓶口敞开2d,清洗根部后将其移栽至营养钵并置于培养箱,待植株生长良好后转至温室培养。
通过PCR鉴定成功转化的阳性植株,并将其连续自交三代获得纯合的转基因株系,对获得的纯合株系采用Real-time qPCR检测SmBIC1的表达量(图10)。所用茄子actin(GU984779.1)引物如下:
SEQ ID NO.9:5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′
SEQ ID NO.10:5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′
将纯合的阳性转化株和野生型一起置于8h黑暗/16h的白光下培养14天。结果显示,BIC1-OE转基因植株与野生型相比具有更长的下胚轴(图7,8),并且下胚轴的花青素含量也明显低于野生型(图7,9),同时还采用Real-time qPCR检测花青素合成主要结构基因SmCHS,SmDFR,SmANS的表达量,发现BIC1-OE转基因植株中结构基因的表达量显著低于野生型(图10),这说明SmBIC1基因具有促进下胚轴伸长,抑制花青素合成的功能。
所用茄子花青素合成结构基因SmCHS引物如下:
SEQ ID NO.11:5′-GGGAACAGTACTCCGGCTAGCC-3′
SEQ ID NO.12:5′-AACACCTGAAATTGGGTCTGAACCA-3′
所用茄子花青素合成结构基因SmDFR引物如下:
SEQ ID NO.13:5′-CATTGAGACTTGCCGACAGA-3′
SEQ ID NO.14:5′-ATTCTCCTTGCCACTTGCAT-3′
所用茄子花青素合成结构基因SmANS引物如下:
SEQ ID NO.15:5′-CTCGATTCCCACCTCGGACCTT-3′
SEQ ID NO.16:5′-TCAGCTGCAGCGTCCTGTTTGT-3′
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白及编码基因
<130> DD09801
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 茄子(Solanum melongena L.)
<400> 1
atgtcaacta tggatgatgg agataaaata gccgaatttt gtgactccgc gacgatgaag 60
gcaaatcaag gtgaatatga atatcaagat tctatcaaga actttggatc attgtcatta 120
atggtggatg atgaagatga aacaggcgat ctttatgttg aatcggagaa attagggtta 180
tcggggcgtg agaagttgaa gaggcattgg agagaagttg gagatagggt ttttgtgcca 240
gaaagatggg agcatgaggg ttctttgaag gaatggatgg attgttcttc ttttgataaa 300
atactagctc caaaggaatt aaaatcagct cgagaagcct tgatgtctca aggaaaacgt 360
gtacgttcaa gttcaggttc agattcaact tcaagaatgc tagagatcaa aagtggatag 420
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> 茄子(Solanum melongena L.)
<400> 2
Met Ser Thr Met Asp Asp Gly Asp Lys Ile Ala Glu Phe Cys Asp Ser
1 5 10 15
Ala Thr Met Lys Ala Asn Gln Gly Glu Tyr Glu Tyr Gln Asp Ser Ile
20 25 30
Lys Asn Phe Gly Ser Leu Ser Leu Met Val Asp Asp Glu Asp Glu Thr
35 40 45
Gly Asp Leu Tyr Val Glu Ser Glu Lys Leu Gly Leu Ser Gly Arg Glu
50 55 60
Lys Leu Lys Arg His Trp Arg Glu Val Gly Asp Arg Val Phe Val Pro
65 70 75 80
Glu Arg Trp Glu His Glu Gly Ser Leu Lys Glu Trp Met Asp Cys Ser
85 90 95
Ser Phe Asp Lys Ile Leu Ala Pro Lys Glu Leu Lys Ser Ala Arg Glu
100 105 110
Ala Leu Met Ser Gln Gly Lys Arg Val Arg Ser Ser Ser Gly Ser Asp
115 120 125
Ser Thr Ser Arg Met Leu Glu Ile Lys Ser Gly
130 135
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtcaacta tggatgatgg agata 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctatccactt ttgatctcta gcatt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgaaggca aatcaaggtg aatgt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtttcatc ttcatcatcc accat 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcggaatgg gacagaagga tg 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgcctcagt caggagaaca gggt 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcggaatgg gacagaagga tg 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgcctcagt caggagaaca gggt 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggaacagta ctccggctag cc 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacacctgaa attgggtctg aacca 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cattgagact tgccgacaga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attctccttg ccacttgcat 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcgattccc acctcggacc tt 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcagctgcag cgtcctgttt gt 22

Claims (4)

1.一种茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白,其特征在于,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列为:如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
3.一种如权利要求2所述编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因在基因工程促进植物下胚轴伸长中的用途;所述植物为拟南芥或茄子。
4.一种如权利要求2所述编码茄子隐花色素蓝光抑制因子SmBIC1蛋白的基因在基因工程抑制植物花青素合成中的用途;所述植物为拟南芥或茄子。
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