CN113354697A

CN113354697A - 一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法

Info

Publication number: CN113354697A
Application number: CN202110800866.0A
Authority: CN
Inventors: 李坤平; 郭姣
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Ruikang Oriental Medical Research Beijing Co ltd
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2021-07-15
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-07-15
Also published as: CN113354697B

Abstract

本发明公开了一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，包括药材净选、热水提取、絮凝沉降、过滤、大孔树脂富集、洗脱、浓缩、动态轴向压缩柱层析纯化、半制备液相色谱分离纯化等步骤。本发明方法避免了传统溶剂萃取，提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高等缺点，采用大孔树脂富集串联动态轴向压缩柱层析技术，在不改变目标产品特征成份的前提下，通过实时检测，流份收集切换操作，工艺指向性明确，操作简单且工艺紧凑，降低了污染风险环节，进一步采用半制备液相色谱，可以实现柳穿鱼叶苷和蒙花苷的完全分离，分离效率高，产品纯度高。

Description

一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法

技术领域

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法。

背景技术

大蓟，别名大刺儿菜、大刺盖、山萝卜、刺萝卜等，其基源植物为菊科蓟属植物大蓟Cirsium japonicum DC.。大蓟以其干燥地上部分入药，收载于中国药典I部（2020版）。大蓟性凉，味甘、苦；归心、肝经。大蓟富含黄酮类成分，柳穿鱼叶苷、蒙花苷、橙皮苷、柳穿鱼黄素等均有报道。

其中柳穿鱼叶苷和蒙花苷是一种黄酮氧苷类化合物，具有较好的抗炎、保肝、降糖和抗肿瘤等生理活性，极具开发利用价值。经申请人前期研究发现，大蓟中柳穿鱼叶苷和蒙花苷等成分含量较低（药典规定其柳穿鱼叶苷含量不低于0.2%）。然而，大蓟为多年生草本，野生于山坡、路边等处，在我国南北各省区都有分布，资源较为丰富、价格低廉，且其人工栽培也比较方便，是极好的柳穿鱼叶苷和蒙花苷的来源。

发明人前期研究发现，柳穿鱼叶苷在其母核结构的A环的C-7位以O-苷键连接一分子葡糖糖，在6'位以6'-1"O-苷键连接一分子鼠李糖。蒙花苷与柳穿鱼叶苷相似，不同之处在于其A环的C-5位没有甲氧基取代。由于柳穿鱼叶苷和蒙花苷结构非常相似，常规的分离方法和手段很难将二者分开。

CN102477055A公开了一种从大蓟中提取纯化柳穿鱼叶苷的方法，其是经低碳醇冷浸提取，再经石油醚萃取、正丁醇萃取，大孔树脂柱层析，酸碱除杂，反复重结晶得到。该提取分离工艺存在耗时长、能耗高、有机溶剂用量大、提取分离效率低、环境兼容性差等缺陷。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，该方法避免了传统方法提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高的缺点，提高了柳穿鱼叶苷和蒙花苷的纯化效率及纯度。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，包括如下步骤：

（1）以大蓟地上部分为原料，纯水加热提取，提取液粗滤，得到粗提液，将粗提液絮凝沉降，取上清液过滤，得到澄清上清液；

（2）将澄清上清液经大孔树脂富集，洗脱、浓缩，膜过滤，得到膜滤液；

（3）将膜滤液经动态轴向压缩柱层析纯化，采用LC-qTOF-MS精确分子量快速鉴定和对照品保留时间锁定的方法，收集含柳穿鱼叶苷和蒙花苷的流份，得到大蓟总苷；

（4）将大蓟总苷采用半制备液相色谱分离纯化，得到柳穿鱼叶苷和蒙花苷。

优选的，步骤（1）中，所述纯水提取时间为1-4小时，提取温度为90-95℃，提取次数为1-2次，料液比为1：10-30。

优选的，步骤（1）中，所述提取液粗滤是采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对提取液进行过滤。

优选的，步骤（1）中，所述取上清液过滤是采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液进行过滤。

优选的，步骤（2）中，所述大孔树脂的种类为AB-8 或D-101，洗脱溶剂为70-95%的甲醇或乙醇。

优选的，步骤（3）中，所述动态轴向压缩柱以C₁₈反相硅胶键合相为填料；甲醇为流动相A和0.05% 甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；32~35 min，5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25℃，进样量10mL。

优选的，步骤（4）中，所述半制备液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；以甲醇:乙腈 1:1为流动相A和0.05%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0~90 min，95%B→30% B；90~92min，30%B →5%B；92~100min，5%B →5%B；100～102min，5％B→95％B；102～110min，95％B→95％B；流速4mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量900 µL。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明提供一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的新方法，避免了传统提取分离纯化过程繁琐、有机溶剂用量大、能耗高的缺点，采用大孔树脂富集串联动态轴向压缩柱层析技术，在不改变目标产品特征成份的前提下，通过实时检测，流份收集切换操作，工艺指向性明确，操作简单且工艺紧凑，降低了污染风险环节。

本发明进一步采用半制备液相色谱，可以实现柳穿鱼叶苷和蒙花苷的完全分离，分离效率高，产品纯度高。采用本发明方法，蒙花苷和柳穿鱼叶苷的纯度均可以达到95%以上。

附图说明

图1为本发明制备的柳穿鱼叶苷和蒙花苷的色谱图；

图2为本发明分离制备的蒙花苷（A）的高分辨质谱图；

图3为本发明分离制备的柳穿鱼叶苷（B）的高分辨质谱图；

图4为对比例1制备的柳穿鱼叶苷和蒙花苷的色谱图；

图5为对比例2制备的柳穿鱼叶苷和蒙花苷的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：

（1）以大蓟地上部分1kg为原料，净选、除杂，加入纯水，90-95℃加热提取2次，第一次提取的料液比为1：20，提取时间为2h，第二次提取的料液比为1：15，提取时间为1.5h，

采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对两次提取液进行粗滤，合并得到粗提液，将粗提液加入絮凝剂（0.005%的聚丙烯酰胺）絮凝沉降，取上清液采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液过滤，得到澄清上清液；

（2）将澄清上清液倒入已经预处理好的D101大孔吸附树脂中，静态吸附12h；接着，将吸附后的树脂滤出，用2倍量的纯水漂洗后，用95%的乙醇分3次洗脱，每次30分钟，收集洗脱液，减压浓缩后用70%乙醇溶解，0.45µm膜过滤；

（3）采用江苏汉邦科技有限公司制备色谱***，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，串联DAC-HB 动态轴向压缩柱（50×650 mm），填料为十八烷基硅烷键合硅胶（C18，华谱新创科技有限公司，ZK2016080701），以甲醇（A）和0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL。采用LC-qTOF-MS精确分子量快速鉴定和对照品保留时间锁定的方法，收集含柳穿鱼叶苷和蒙花苷的流份，得到大蓟总苷。

（4）采用江苏汉邦科技有限公司半制备色谱仪，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料（C18）半制备液相色谱柱PhenomenonexLuna C18 100A（250×10mm，10µm），以甲醇:乙腈 (1:1)（A）和0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~90 min，95%B→30% B；90~92min，30%B →5%B；92~100min，5%B →5%B；100～102min，5％B→95％B；102～110min，95％B→95％B；流速4mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量900 µL。在此条件下，蒙花苷和柳穿鱼叶苷的保留时间分别为70.968min和72.132 min，基本达到了基线分离，其色谱图如附图1所示。

收集前述两个化合物流份，真空浓缩后冷冻干燥，即得浅黄色粉末A（蒙花苷）0.042g，浅黄色粉末B（柳穿鱼叶苷）0.502g。经¹H-和¹³C-NMR（布鲁克 500MHz核磁共振谱仪）分析和相关文献数据比对，确认为蒙花苷和柳穿鱼叶苷。

本发明分离制备的柳穿鱼叶苷的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据为：

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 6.87 (1H, s, H-3), 6.83 (1H, brs,H-6),7.02 (1H, brs, H-8), 7.99 (2H, d, J = 9.0 Hz,H-2′, 6′), 7.51 (2H, d, J = 9.0Hz, H-3′, 5′), 3.70 (3H,s, -OCH₃), 5.72 (1H, d, J = 7.5 Hz, Glc-H-1″), 4.10～4.70 (6H, m, Glc-H-2″～6″), 5.50 (1H, s, Rha-H-1"'),4.70～5.30 (6H, m, Rha-H-2"'′～5"'), 1.58 (3H, d, J =6.0 Hz, Rha-H-6"')；¹³C-NMR (150 MHz, DMSO-d₆) δ:182.7(C-4), 164.5(C-2), 164.1(C-9), 163.1 (C-5),157.8(C-7), 106.6(C-10),100.8(C-6), 95.3 (C-8),104.7(C-3), 162.5(C-4′), 128.7(C-2′,6′), 123.1(C-1′),115.1 (C-3′,5′), 102.4(C-1″), 78.4 (C-5″), 77.7(C-3″), 74.7 (C-2″), 71.4 (C-4″), 67.6 (C-6″), 102.1(C-1"'), 74.1 (C-4"'), 72.8(C-3"'), 72.1 (C-2"'), 69.8(C-5"'), 18.6 (C-6"'), 55.5 (-OCH₃)。

本发明分离制备的蒙花苷的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据为：

¹H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ: 8.03(d, J＝8.5 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.18(d,J＝8.6 Hz, 2H, H-3', H-5'), 6.94(s, 2H, H-3, H-8), 5.13 (d,J＝6.3 Hz, 1H,H-1"), 4.55(s, 1H, H-1"'), 3.85 (s, 3H, OMe), 3.76 (s, 3H, OMe), 3.69～3.60(m, 2H), 3.47 (dd, J＝10.2, 6.9 Hz, 2H), 3.35～3.27 (m, 2H), 3.16 (dd, 2H),1.05 (d, 3H, H-6"'); ¹³C-NMR (150 MHz,DMSO-d₆) δ: 182.2 (C-4), 163.9 (C-2),162.2 (C-4'),159.4(C-7), 152.4(C-9), 152.1 (C-5), 132.5 (C-6),128.3 (C-2', C-6'), 122.5 (C-1'), 114.6 (C-3', C-5'),105.7 (C-10), 103.2 (C-3), 100.2 (C-1"'), 100.2(C-1"), 94.2 (C-8), 76.3 (C-3"), 75.6 (C-5"), 73.0(C-2"), 71.8 (C-4"'), 70.6 (C-3"'), 70.3 (C-2"'), 69.3(C-4"), 68.1 (C-5"'), 65.8 (C-6"), 60.1(6-OMe), 55.4(4'-OMe), 17.6 (C-6"')。

取步骤（3）所得蒙花苷和柳穿鱼叶苷各约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL。进液相色谱（Waters2695型HPLC，DAD检测器）分析，以面积归一化法计算，其中蒙花苷和柳穿鱼叶苷的纯度分别为95.2%和98.7%。

对比例1：

步骤（1）-（3）同实施例1，区别在于步骤（4）：

（4）采用江苏汉邦科技有限公司半制备色谱仪，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料（C18）半制备液相色谱柱PhenomenonexLuna C18 100A（250×10mm，10µm），以甲醇（A）-0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~10 min，5% B→51%B；10~20min，51%B→57%B；20~21 min，57%B→5%B）；21～25min，5％B→5％B；流速4.0 mL·min^-1，检测波长为254nm、330 nm，柱温25℃，进样量400 µL。在此条件下，蒙花苷和柳穿鱼叶苷的保留时间分别为18.510min和 19.060min。

其色谱图如附图4所示。

收集前述两个化合物流份，真空浓缩后冷冻干燥，即得浅黄色粉末A（蒙花苷）0.096g，浅黄色粉末B（柳穿鱼叶苷）0.399g。

取步骤（4）所得蒙花苷和柳穿鱼叶苷各约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL。进液相色谱（Waters2695型HPLC，DAD检测器）分析，以面积归一化法计算，其中蒙花苷和柳穿鱼叶苷的纯度分别为62.06%和90.32%。

对比例2：

步骤（1）-（3）同实施例1，区别在于步骤（4）：

（4）采用江苏汉邦科技有限公司半制备色谱仪，配置NP7000输液泵和NU3000 UV/VIS检测器，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填料（C18）半制备液相色谱柱PhenomenonexLuna C18 100A（250×10mm，10µm），以甲醇（A）-0.05% 甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~120 min，95%B→30% B；120~122min，30%B → 95%B；122～130min，95％B→95％B，流速4mL·min^-1；检测波长为 254nm、330 nm，柱温25℃，进样量400 µL。在此条件下，蒙花苷和柳穿鱼叶苷的保留时间分别为91.748min和 92.992 min。

其色谱图如附图5所示。

收集前述两个化合物流份，真空浓缩后冷冻干燥，即得浅黄色粉末A（蒙花苷）0.087g，浅黄色粉末B（柳穿鱼叶苷）0.412g。

取步骤（4）所得蒙花苷和柳穿鱼叶苷各约10mg，精确称定后70%乙醇溶解并定容至10mL。进液相色谱（Waters2695型HPLC，DAD检测器）分析，以面积归一化法计算，其中蒙花苷和柳穿鱼叶苷的纯度分别为 77.36%和 94.27%。

由对比例1和对比例2的结果可以看出，对比例1的分离时间短，但分离效果差，得到的目标化合物纯度低；对比例2的分离时间长，分离效果有所改善，产物纯度有所提高，但仍未达到最佳效果；而采用本发明实施例1的方法，分离效果最好，产物纯度高（可以达到95%以上），分离时间居中。

Claims

1.一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述纯水提取时间为1-4小时，提取温度为90-95℃，提取次数为1-2次，料液比为1：10-30。

3.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述提取液粗滤是采用90~100µm烧结金属滤头接真空泵对提取液进行过滤。

4.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述取上清液过滤是采用50~60µm烧结金属滤头接真空泵对上清液进行过滤。

5.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述大孔树脂的种类为AB-8 或D-101，洗脱溶剂为60-95%的甲醇或乙醇。

6.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述动态轴向压缩柱以C₁₈反相硅胶键合相为填料；甲醇为流动相A和0.05% 甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，洗脱程序为0~17 min，95%B→44% B；17~21min，44%B → 38%B；21~32 min，38%B→ 5%B；5％B→5％B；35～37min，5％→95％B；37～45min，95％B→95％B；流速 70 mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量10mL。

7.根据权利要求1所述的一种分离纯化柳穿鱼叶苷和蒙花苷的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述半制备液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；以甲醇:乙腈 1:1为流动相A，0.05% 甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱:0~90 min，95%B→30% B；90~92min，30%B →5%B；92~100min，5%B →5%B；100～102min，5％B→95％B；102～110min，95％B→95％B；流速4mL·min^-1，检测波长为 254nm和330 nm，柱温25 ℃，进样量900 µL。

8.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的柳穿鱼叶苷和蒙花苷，其特征在于，所述柳穿鱼叶苷和蒙花苷的纯度均可到达95%以上。