CN113336663B - 一种利用鸟氨酸催化液制备门冬氨酸鸟氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用鸟氨酸催化液制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，属于生物医药领域。本发明将鸟氨酸转化液利用超滤膜进行超滤处理得到超滤膜清液，然后用门冬氨酸调pH到6.2‑6.7，一方面可以一步法制备门冬鸟氨酸收率高，总收率80％，另一方面可以营造偏酸性环境，减少有关杂质的产生。本发明采用电渗析法脱盐，也可以避免在离子交换柱中进行洗脱时，碱性的洗脱环境容易导致有关物质的产生。

Description

一种利用鸟氨酸催化液制备门冬氨酸鸟氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用鸟氨酸催化液制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，属于生物医药领域。
背景技术
门冬氨酸鸟氨酸能直接参与肝细胞的代谢，并能激活肝脏解毒功能中的两个关键酶，因而能够协助清除对人体有害的自由基，增强肝脏的排毒功能，迅速降低过高的血氨，促进肝细胞自身的修复和再生，从而有效地改善肝功能，恢复机体的能量平衡。
目前，门冬氨酸鸟氨酸的制备方法主要包括两大类：一类是以L-精氨酸与L-天门冬氨酸为起始原料，利用化学法或者生物法将L-精氨酸转化为L-鸟氨酸，然后再与L-天门冬氨酸反应制得。这类方法工艺过程较为复杂，尤其是生物法更是条件苛刻，成本较高，不适于工业化大生产。另一类则是以L-鸟氨酸盐与L-天门冬氨酸为起始原料，利用L-鸟氨酸盐制备L-鸟氨酸自由碱，然后再与L-天门冬氨酸反应制得。这类方法中采用的L-鸟氨酸盐包括L-鸟氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸硫酸盐以及L-鸟氨酸醋酸盐，其中L-鸟氨酸硫酸盐不易得到，而L-鸟氨酸醋酸盐价格相对较高。
采用L-鸟氨酸盐酸盐与L-天门冬氨酸为起始原料制备门冬氨酸鸟氨酸的方法主要包括：将L-鸟氨酸盐酸盐溶解于水中，用氢氧化钠调节pH值后，采用电渗析方法除盐，然后再与L-门冬氨酸反应制得。该方法中电渗析除盐条件苛刻，价格较高，不适于工业化大生产。或者，将L-鸟氨酸盐酸盐溶解于水中，利用阳离子交换树脂脱盐，然后再与L-门冬氨酸反应制得，该方法收率较低，同样不适于工业化大生产，并且在离子交换柱中进行洗脱时，碱性的洗脱环境容易导致有关物质的产生，从而不符合原料药的品质要求。
发明内容
[技术问题]
现有的制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，纯化条件比较严苛，并且采用离子交换纯化方法时还容易产生有关物质。
[技术方案]
本发明提供一种利用鸟氨酸转化液制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)将鸟氨酸转化液升温至55-60℃，保温20-30min，然后采用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体得到超滤膜清液，其中，超滤膜的工作温度为28-32℃；所述鸟氨酸转化液是以精氨酸为底物，通过精氨酸酶催化精氨酸转化成鸟氨酸得到的；
(2)将步骤所得的超滤膜清液用门冬氨酸调pH到6.2-6.7；
(3)把调过pH的液体进行电渗析法脱盐，电导≤300μs/cm时反应结束，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液；
(4)将步骤(3)得到的门冬氨酸鸟氨酸溶液浓缩至浓度65-75％，然后升温55-60℃，加10-15％活性炭脱色30-60min，得到脱色液；
(5)将脱色液反滴入4-5倍体积的乙醇中，30℃搅拌，得到晶体，抽滤、离心、烘干。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中超滤膜的工作温度为28-32℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)电渗析时，淡室、浓室的体积相同。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)烘干温度是80℃。
[有益效果]
本发明将鸟氨酸转化液利用超滤膜进行超滤处理得到超滤膜清液，然后用门冬氨酸调pH到6.2-6.7，一方面可以一步法制备门冬鸟氨酸收率高，总收率80％，另一方面可以营造偏酸性环境，减少有关杂质的产生。
本发明采用电渗析法脱盐，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液，也可以避免在离子交换柱中进行洗脱时，碱性的洗脱环境容易导致有关物质的产生。
本发明方法制备得到的门冬氨酸鸟氨酸的杂质含量均符合要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的主要检测方法如下：
门冬氨酸鸟氨酸的检测方法是：取烘干后的样品约70mg，加无水甲酸5mL与冰醋酸50mL溶解后，照电位滴定法，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL的高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于8.84mg的C5H12N2O2·C4H7NO4。
鸟氨酸转化液的制备方法：在40L的反应体系中，4kg精氨酸、加水定容至40L，加入精氨酸转化酶160g(比酶活1000U/g)，37℃转化24h。
有关物质的检测方法(高效液相色谱法测定)：
供试品溶液：取本品约0.4g，精密称定，置100ml量瓶中，加0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液40ml使溶解，用乙腊稀释至刻度，摇匀。
对照溶液：精密量取供试品溶液适翟，用流动相定量稀释制成每1ml中约含门冬氨酸鸟氨酸4μg的溶液。
各杂质对照品溶液：取马来酸、富马酸、精氨酸、杂质I与杂质Il各对照品适量，精密称定，分别加流动相溶解并定盐稀释制成每1ml中各约含4μg的溶液。
***适用性溶液：取门冬氨酸鸟氨酸、马来酸、富马酸、精氨酸、杂质I与杂质II各对照品适量，置同一械瓶中，加流动相适量使溶解并稀释制成每1ml中约含门冬氨酸鸟氨酸4mg，马来酸、富马酸、精氨酸、杂质I与杂质Il各4μg的溶液。
色谱条件：用氨基键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(取磷酸二氢钾2.2g，加水500ml溶解后，加入浓氨溶液5ml，用水稀释至1000ml，混匀后用磷酸调节pH值至5.60±0.05)-乙腊(40：60)为流动相；检测波长为205nm；流速为每分钟1.3ml；柱温为30℃，进样体积20μL。
***适用性要求：***适用性溶液色谱图中，门冬氨酸、鸟氨酸、马来酸、富马酸、精氨酸、杂质I(即鸟氨酸内酰胺)与杂质Il峰之间的分离度均应符合要求。
测定法：精密量取供试品溶液、对照溶液与各杂质对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至门冬氨酸峰保留时间的4倍。
限度：供试品溶液色谱图中如有与各杂质对照品溶液主峰保留时间相同的色谱峰，按外标法以峰面积分别计算各己知杂质的含量，含马来酸、富马酸与精氨酸均不得过0.1％,含杂质I不得过0.1％(供注射用)或0.3％(供口服制剂用)，含杂质Il不得过0.15％；其他单个未知杂质的峰面积均不得大于对照溶液两主峰面积之和(0.1％)；杂质总量不得过0.5％(供注射用)或1.0％(供口服制剂用)。
酶法转化L-精氨酸得到L-鸟氨酸转化液
(1)转化条件：
体积：5000L；底物浓度：L-精氨酸100g/L；L-精氨酸酶浓度：1000U/L，温度：37℃，转速：100rpm，pH:9-10，底物L-精氨酸溶解后pH约为10，所以无需调节pH。
(2)制备流程：
a、准确称取500kg底物L-精氨酸，加入装有3000L水的7000L的带夹套反应罐中，第一次定容至4000L，设置温度为37℃，转速为100rpm，搅拌溶解并加热底物溶液。
b、按照酶浓度1000U/L，体积5000L计量，当反应罐中的温度达到37℃时，添加L-精氨酸酶液，然后，第二次定容至5000L。控制反应釜的蒸汽和循环水量，使反应釜内温度保持在37±1℃，搅拌均匀后，反应开始计时，反应24小时，升温灭酶，反应结束。
实施例1
(1)将鸟氨酸转化液升温至60℃，保温30min，然后采用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，其中，超滤膜的工作温度为30℃，进膜压力为0.1Mpa，得到超滤膜清液；
(2)将步骤所得的超滤膜清液用门冬氨酸调pH到6.2；
(3)把调过pH的液体进行电渗析法脱盐，将10L调pH后的液体置于淡室，浓室加入10L纯水，加电压50v，进行电渗析，电导率为300μs/cm时反应结束，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液；
(4)将步骤(3)得到的门冬氨酸鸟氨酸溶液浓缩至波美度70％，然后升温至60℃，加15％活性炭脱色30min一次，得到脱色液；
(5)将200mL脱色液反滴入800mL乙醇中，于30℃搅拌5小时，得到晶体，抽滤、离心，80℃烘干16h。所得产品的杂质含量均符合要求。
本技术为一步法制备门冬鸟氨酸收率高，总收率80％。现有工艺大多是鸟氨酸制备成鸟氨酸盐酸、鸟氨酸盐酸盐脱盐后，再用门冬氨酸调pH制备门冬鸟氨酸，步骤多收率低，总收率仅达到50％。
实施例2
(1)将鸟氨酸转化液升温至55℃，保温30min，然后采用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体得到超滤膜清液，其中，超滤膜的工作温度为32℃；
(2)将步骤所得的超滤膜清液用门冬氨酸调pH到6.5；
(3)把调过pH的液体进行电渗析法脱盐，将调pH后的液体置于淡室，浓室加入等体积的纯水，加电压50v，进行电渗析，电导≤300μs/cm时反应结束，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液；
(4)将步骤(3)得到的门冬氨酸鸟氨酸溶液浓缩至浓度75％，然后升温60℃，加10％活性炭脱色50min，得到脱色液；
(5)将脱色液反滴入4倍体积的乙醇中，30℃搅拌，得到晶体，抽滤、离心、80℃烘干16h。所得产品的杂质含量均符合要求，马来酸、富马酸与精氨酸低于0.1％，杂质I低于0.1％，杂质Il低于0.15％。
实施例3
(1)将鸟氨酸转化液升温至60℃，保温30min，然后采用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体得到超滤膜清液，其中，超滤膜的工作温度为32℃；
(2)将步骤所得的超滤膜清液用门冬氨酸调pH到6.7；
(3)把调过pH的液体进行电渗析法脱盐，将调pH后的液体置于淡室，浓室加入等体积的纯水，加电压50v，进行电渗析，电导≤300us/cm时反应结束，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液；
(4)将步骤(3)得到的门冬氨酸鸟氨酸溶液浓缩至浓度75％，然后升温60℃，加15％活性炭脱色60min，得到脱色液；
(5)将脱色液反滴入4倍体积的乙醇中，30℃搅拌，得到晶体，抽滤、离心、80℃烘干16h。所得产品的杂质含量均符合要求，马来酸、富马酸与精氨酸低于0.1％，杂质I低于0.1％，杂质Il低于0.15％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于，利用鸟氨酸转化液制备门冬氨酸鸟氨酸，包括以下步骤：
(1)将鸟氨酸转化液升温至55-60℃，保温20-30min，然后采用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体得到超滤膜清液；所述鸟氨酸转化液是以精氨酸为底物，通过精氨酸酶催化精氨酸转化成鸟氨酸得到的；
(2)将步骤(1)所得的超滤膜清液用门冬氨酸调pH到6.2-6.7；
(3)把调过pH的液体进行电渗析法脱盐，电导≤300μs/cm时反应结束，得到门冬氨酸鸟氨酸溶液；
(4)将步骤(3)得到的门冬氨酸鸟氨酸溶液浓缩至浓度65-75％，然后升温55-60℃，加10-15％活性炭脱色30-60min，得到脱色液；
(5)将脱色液反滴入4-5倍体积的乙醇中，30℃搅拌，得到晶体，抽滤、离心、烘干。
2.根据权利要求1所述的一种制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中超滤膜的工作温度为28-32℃。
3.根据权利要求1所述的一种制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)电渗析时，淡室、浓室的体积相同。
4.根据权利要求1所述的一种制备门冬氨酸鸟氨酸的方法，其特征在于，步骤(5)烘干温度是80℃。
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