CN109593131B

CN109593131B - 一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途

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Publication number: CN109593131B
Application number: CN201811608242.3A
Authority: CN
Inventors: 李�远; 汤黎明; 金铭; 仇咏欣; 戴易; 杨叶; 沈健; ***; 宋振云
Original assignee: Shanghai Zhuoli Biotech Co ltd; Nanjing Medical University
Current assignee: Shanghai Zhuoli Biotech Co ltd; Nanjing Medical University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109593131A

Abstract

本发明提供了一种抗14‑3‑3η蛋白单克隆抗体及其用途，具体地本发明人在研究过程中成功获得一株特异性抗14‑3‑3η蛋白的单克隆抗体，实验结果表明，该单克隆抗体能够特异地结合14‑3‑3η蛋白，亲和力强、灵敏度高。该抗体不仅能够用于检测血浆、新鲜组织中的14‑3‑3η蛋白，还可用于石蜡包埋的临床组织样本切片的检测。对于实验室研究以及临床中研究均有重要意义。

Description

一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地说，本发明涉及一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途。

背景技术

14-3-3是一类磷酸丝氨酸/苏氨酸结合蛋白家族，包括α/β、γ、ε、σ、ξ、θ/τ和η七个亚型。已有研究表明：5种14-3-3蛋白亚型(α/β、γ、ε、σ和ξ)参与了肿瘤进程。

肿瘤(tumor)是指细胞在致瘤因素作用下失去对其生长的正常调控，导致异常增生而产生的疾病。肿瘤可分为良性和恶性肿瘤两大类。前者生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。后者生长迅速，可转移到身体其它部位，还会产生有害物质，破坏正常器官结构，使机体功能失调，威胁生命。

恶性肿瘤也叫癌症(cancer)是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。癌症的早期诊断在癌症的治疗中具有巨大的意义。另外，在癌症的治疗中，需要通过对肿瘤标志性蛋白进行检测，进而对癌症的分子类型进行评估，来制定更为合理的治疗方案。

因此，本领域技术人员致力于开发检测效果更为准确，灵敏度更高，且使用更为方便的肿瘤标志性蛋白的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体，

本发明的第一方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)重链可变区；和/或

(2)轻链可变区；

其中，所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:1所示的CDR1，

SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.:3所示的CDR3；

所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.:5所示的CDR1'，

SEQ ID NO.:6所示的CDR2'，和

SEQ ID NO.:7所示的CDR3'。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述抗体还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源、或兔源。

在另一优选例中，所述抗体还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源、或兔源。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗14-3-3η蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、兔源抗体或人源化抗体。

本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，它编码如本发明第一方面所述的抗体。

本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第五方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备***的药物，所述的肿瘤选自下组：肝癌、胃癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***、子宫内膜癌、***癌、肾上腺肿瘤、或***。

本发明的第七方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第五方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：

(1)检测样品中14-3-3η蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的14-3-3η蛋白；和/或

(3)检测表达14-3-3η蛋白的肿瘤细胞；

所述药剂用于治疗或预防表达14-3-3η蛋白的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、***癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、***、子宫内膜癌、***癌、小细胞肺癌、黑色素瘤或头颈肿瘤、或肾上腺肿瘤。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

本发明的第八方面，提供了一种检测样品中14-3-3η蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第一方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在14-3-3η蛋白。

在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。

在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。

在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。

本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

第一容器，所述第一容器中含有本发明第一方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：

第二容器，所述第二容器中含有细胞裂解试剂。

在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。

本发明的第十方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第一方面所述的抗体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了108A5H11单克隆抗体在肝癌组织细胞中的染色结果。

图2显示了108A5H11单克隆抗体在正常肝细胞中的染色结果。

图3显示了108A5H11单克隆抗体在正常肝细胞中的染色结果。

图4显示了108A5H11单克隆抗体在正常肝细胞中的染色结果。

图5显示了WB检测肝癌病人肝脏样本14-3-3η的电泳结果。

图6显示了WB检测肝癌病人肝脏样本14-3-3η的电泳结果。

具体实施方式

本发明人通过深入的研究，经过大量筛选，成功获得一株特异性抗14-3-3η蛋白的单克隆抗体，实验结果表明，该单克隆抗体能够特异地结合14-3-3η蛋白，亲和力强、灵敏度高。该抗体不仅能够用于检测新鲜组织中的14-3-3η蛋白，还可用于***固定、石蜡包埋的临床组织样本切片的检测。在此基础上，完成了本发明。

14-3-3是一类磷酸丝氨酸/苏氨酸结合蛋白家族，包括α/β、γ、ε、σ、ξ、θ/τ和η七个亚型。已有研究表明：5种14-3-3蛋白亚型(α/β、γ、ε、σ和ξ)参与了肝癌进程。本发明人研究发现：相较于已报道亚型，14-3-3η在肝癌组织中的肿瘤细胞和血管内皮细胞中均存在分布，且其表达水平随肝癌进展逐渐升高。进一步发现：在肝癌和血管内皮细胞中14-3-3η均可通过与p-ERK1/2形成正反馈环路，进而促进肝癌的进程，且肝癌患者组织14-3-3η的高表达与索拉菲尼抵抗和预后不良相关。

14-3-3η的氨基酸序列如下：

本发明人在研究过程中意外地发现肝癌患者血清中的14-3-3η蛋白显著升高，因此可以作为肝癌标志性蛋白。14-3-3η的血浆学检测作为潜在的肝癌早期发现、肿瘤预后预测具有重要的价值。

但是肝癌患者肿瘤组织中的14-3-3η检测极为不便，本发明人尝试在血清/浆中检测14-3-3η的水平，但是由于14-3-3η分子量比较小，约28KD，接近于蛋白的轻链大小，因此检测结果上无法观察到肿瘤患者血清/浆样本和正常人血清/浆样本中14-3-3η水平的差异。

本发明人进一步去除血浆/血清中高丰度蛋白(诸如IgG、IgM、IgA、白蛋白、α1-酸性糖蛋白等)后，通过改良的免疫印记检测方法成功在血清/浆样本中检测到了14-3-3η，并且意外发现肿瘤患者血清/浆样本和正常人血清/浆样本中14-3-3η水平具有显著差异。进一步地，通过大样本肝癌病人血浆样本和正常人血浆样本进行对比分析，发现血浆中14-3-3η可以作为肝癌标记物，可以用于潜在的肝癌早期发现、肿瘤预后预测等。

具体地，本发明采用重组14-3-3η蛋白蛋白免疫BALB/C小鼠，并使用14-3-3η蛋白重组蛋白作为筛选抗原，筛选获得阳性单克隆杂交瘤细胞株。最终获得7株能特异性结合14-3-3η蛋白的细胞株。

将7株单克隆细胞株进行鼠腹水抗体制备，对***固定，石蜡包埋的肝癌组织切片进行检测，最终获得一株能够特异性识别石蜡组织切片14-3-3η蛋白并且可以用血清中目的蛋白检测的单克隆抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，本文中的兔单克隆抗体是通过噬菌体文库筛选后通过分子生物的方法构建全长兔单克隆抗体基因表达载体，将该载体转入真核表达***，培养后收取细胞上清而获得，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗14-3-3η蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗14-3-3η蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的14-3-3η蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗14-3-3η蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

CDR1，其氨基酸序列为GYTFTSYIS(SEQ ID NO.:1)；

CDR2，其氨基酸序列为QRYDA(SEQ ID NO.:2)；

CDR3，其氨基酸序列为YYPAFYDKAMVNL(SEQ ID NO.:3)。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：

EVQLQQSGPGSVKPGASLKLSCKASGYTFTSYISAISKQRQTPEKSLEWIGSIQRYDATAYMDSVGKRGTISYDRARLINYLDMSSLRSEDTAMYFCARYYPAFYDKAMVNLDWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:4)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

CDR1'，其氨基酸序列为WKPVGTGKFTPHEVI(SEQ ID NO.:5)；

CDR2'，其氨基酸序列为PVRETLS(SEQ ID NO.:6)；

CDR3'，其氨基酸序列为QDNTPYT(SEQ ID NO.:7)；

在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：

DIVLTQSPSSLAVQTGQTMICSYWKPVGTGKFTPHEVIWYQQKPGQPPRLLIYPVRETLSGVPDRFSGSGSGTDFTLTIHMVEAEDAAVYYCQDNTPYTFGGTKEEGGR(SEQ ID NO.:8)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源、人源或兔源。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合14-3-3η蛋白的抗体。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗14-3-3η蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有14-3-3η蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合14-3-3η蛋白分子，因而可用于预防和***。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)，噬菌体展示技术或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

噬菌体展示技术是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于病毒粒子内，从而使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。

在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经亲和层析柱(Protein A/G-Sephrose)进行纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，抽取腹水，经亲和层析柱(Protein A/G-Sephrose)进行纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用重组DNA方法组建真核表达***，瞬转HEK293细胞来表达抗体，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱(Protein A/G-Sephrose)进行纯化。

方法和样本

本发明涉及用于在组织样本检测癌症的方法。该方法步骤大致如下：获得组织样本；检测在所述样本中14-3-3η蛋白的水平。本发明方法所使用的样本是血清样本、或临床病理通常应用的***固定,石蜡包埋的组织切片。

本发明中所采用的样本(样品)包括组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的组织样本。组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(***、Cytyc“PreservCyt”或Tripath Imaging“Cytorich”等)。合适的保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。

试剂盒

本发明还提供了一种只含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测14-3-3η蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识别14-3-3η蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的针对14-3-3η蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。

(2)本发明提供的针对14-3-3η蛋白的抗体检测灵敏度极高，能够用于血清样本中目的蛋白的检测。

(3)本发明提供的检测14-3-3η蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好。

(4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期诊断，并可用于评语癌症的预后。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1抗14-3-3η蛋白单克隆抗体的制备

1、小鼠免疫

免疫原为重组14-3-3η蛋白(SEQ ID NO.:17)，取4周龄雌性Balb/C健康小鼠(购自上海斯莱克公司)，进行免疫。第一次免疫：将200μg(250μl)抗原与250μl完全佐剂混匀，注射于Balb/c小鼠皮下多点及足掌。第一次免疫间隔三周后进行同法同剂量第二次免疫。第二次免疫间隔二周后，同法同剂量进行第三次免疫。第三次免疫间隔二周后，同法同剂量进行第四次免疫。

每次免疫前进行小鼠断尾采血，采用14-3-3η蛋白重组蛋白(5μg/ml)作为检测抗原，ELISA法检测小鼠血清效价，待免疫小鼠血清效价滴度大于1:10,000时取脾细胞进行融合。

2、细胞融合与培养

将生长良好的对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)，和按常规方法收集的免疫小鼠的脾细胞融合，脾细胞：SP2/0比例为10:1，以2×10⁴个细胞的密度将融合细胞种入96孔培养板，37℃，5％CO₂恒温培养箱中抚育。培养14天后，进行ELISA检测筛选14-3-3η蛋白抗体阳性克隆。

采用间接ELISA进行阳性杂交瘤筛选，抗原为免疫原蛋白混合液，包板后4℃过夜，5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h，洗涤拍干后，加入杂交瘤上清并设置阳性(P)、阴性(N)及空白对照，37℃反应1h，洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(Sigma A2554)37℃反应45～60min，采用TMB显色，2M H₂SO₄终止。扩增经过两次连续检测均为阳性的克隆。

3、杂交瘤细胞亚克隆

采用有限稀释法进行亚克隆。将细胞悬液稀释至60个/ml，于96孔板中每孔加100μl(约6个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排。重复一次。置37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育。每隔2～3天，更换1/2培养液。培养约10d后，选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后，经ELISA法检测抗体阳性率为100％时确定为稳定细胞株。共获得七株结合免疫原蛋白的稳定单克隆抗体株105A5H18、0795、0823、0826、108A5H19、109A5H15、0931。

4、单克隆抗体的制备

将6周龄的Balb/c雌性小鼠提前1周预先用液体石蜡注射致敏，然后腹腔注射杂交瘤细胞，1～2x10⁶杂交瘤细胞/只，每种杂交瘤注射3只。7-10天后抽取腹水。通过ELISA检测腹水效价达到1：10,000以上的以Protein A/G亲和柱层析法纯化。

实施例2单克隆抗体的特异性和亲和力检测

ELISA检测单克隆抗体交叉反应，抗原分别选用14-3-3的α/β、γ、ε、σ、ξ、θ/τ和η七个亚型重组蛋白，2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入单抗1μg/ml，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(Sigma A2554)(1:10000)37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2MH₂SO₄终止，OD450nm处读数。结果表明：105A5H18、108A5H11、108A5H19、109A5H15单抗可特异性结合14-3-3η蛋白，与其它亚型蛋白无明显的交叉反应。

检测结果表明105A5H18单克隆抗体的亲和力常数为2.76E^-9,108A5H11单克隆抗体的亲和力常数为8.76E^-9,108A5H19单克隆抗体的亲和力常数为1.68E^-10,109A5H15单克隆抗体的亲和力常数为5.23E^-9。

提取108A5H11单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA反转录后进行抗体基因克隆测序：

重链可变区序列信息如下：

轻链可变区序列信息如下：

实施例3免疫组织化学染色法检测肝癌组织中的14-3-3η蛋白

以以105A5H18、108A5H11、108A5H19、109A5H15单克隆抗体为一抗对肝癌组织和肝正常组织进行免疫组织化学染色。将石蜡组织切片依次置于二甲苯、乙醇中浸泡后，放入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液中，煮沸；洗涤后用含10％小牛血清的TBST室温封闭20分钟；加入待测抗体，抗体浓度为15ug/ml，室温孵育后滴加Anti-Mouse IgG-HRP，室温孵育30分钟显色观察。

108A5H11单克隆抗体在肝癌组织细胞中有明显的染色(图1、图2)，在正常肝细胞中染色较弱(图3、图4)，染色背景干净，区分显著，因此，实验结果表明108A5H11单克隆抗体能够特异的识别肝癌肿瘤细胞。108A5H19单克隆抗体在肝癌组织细胞中有明显的染色，但是染色背景较深，存在较明显的背景着色，很难区分背景和肿瘤细胞；而105A5H18、109A5H15单克隆抗体在肝癌组织中无染色。因此，实验结果表明仅108A5H11单克隆抗体能够特异的识别肝癌肿瘤细胞。

实施例4WB检测

本实施例中使用108A5H11单克隆抗体对组织样本中的14-3-3η蛋白进行检测。

1、组织中蛋白上清液的制备和浓度测定

1)把组织剪切成细小的碎片；

2)融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入酶抑制剂三联装。

3)按照每20mg组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液。

4)在匀浆机中研磨，直至裂解液中组织块消失。

5)充***解后，12000rpm离心5分钟，取上清。

6)取部分上清蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按如下步骤：

①按试剂盒说明书将A液和B液以50：1的比例配制成工作液；

②取2000μg/ml的BSA标准品，用PBS(pH 7.4)稀释成2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml、0μg/ml共9个浓度梯度；

③取蛋白提取液10μl，用PBS稀释10倍；

④每管中加100μl蛋白标准品或稀释后的组织蛋白提取液，再加上述工作液2ml，37℃孵育30min，562nm处测吸光度，记录OD值；

⑤根据OD值及蛋白标准品浓度绘制标准曲线，计算样品总蛋白浓度。

2、WB(Western blotting)检测14-3-3η

1)灌胶

①蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干。

②按上述方法配制15％分离胶10ml：水2.3ml，30％丙烯酰胺5.0ml，1.5MTris缓冲液2.5ml，10％SDS 0.1ml，尿素6.4g、TEMED 4μl、10％(w/v)AP100μl混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2～3mm(事先做好标记)，用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置45分钟待胶完全聚合。

③待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。

④配制5％浓缩胶6ml：水4ml，30％丙烯酰胺1ml，1.0M Tris缓冲液1ml，10％SDS80ul，10％AP 60ul，TEMED 8ul，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直***Teflon齿梳，室温静置20分钟待胶聚合。

⑤待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。

2)电泳

①取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。

②将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。

③每孔加上样液10ul，留一孔加10μl预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70v恒压电泳，约30min，当指示剂溴芬兰进入分离胶后改用90v恒压电泳，当25Kd Marker其电泳条带到分离胶中间位置时即停止电泳，关闭电源，取出胶板。

3)转印蛋白及免疫检测

①在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH₂O漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。

②在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。

③按黑面(负极)→海绵→滤纸→胶→PVDF膜(0.2um)→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。

④接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。

⑤将电转仪置于冰水中，200mA恒流转膜70min。

⑥转膜结束后，快速取出PVDF膜，放入5％BSA室温封闭2h。

⑦取出膜，于摇床上用TBST洗膜5min×3次。

⑧孵育袋中加入TBST稀释的抗14-3-3η抗体(105A5H18、108A5H11、108A5H19、109A5H15单克隆抗体)，4℃孵育过夜。

⑨TBST洗膜5min×3次，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗室温孵育2h。

⑩TBST洗膜10min×3次。膜于化学发光检测试剂(试剂A：试剂B＝1：1)反应2min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用X胶片感光、显影、定影。

实验结果如图5和图6所示，图5中各泳道分别为108A5H11(泳道1、2、3)、105A5H18(泳道4、5、6)单克隆抗体的免疫印迹结果(分别为同一个肝癌病人肝脏手术标本的三重复样本，蛋白上样量40ug，抗体稀释度1:2500)，其中1-3泳道在28kd处有明显清晰条带，4-6也可以在28kd处观察目的条带，但是目的条带不清晰。

图6中各泳道分别为108A5H19(泳道1、2、3)、109A5H15(泳道4、5、6)单克隆抗体的免疫印迹结果(分别为同一个肝癌病人肝脏手术标本的三重复样本，蛋白上样量40ug，抗体稀释度1:2500)，其中1-6泳道在28kd处有明显清晰条带，但抗体杂带较多，特异性不强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南京医科大学

上海卓立生物科技有限公司

<120> 一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途

<130> 1801007

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ile Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Gln Arg Tyr Asp Ala

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Tyr Tyr Pro Ala Phe Tyr Asp Lys Ala Met Val Asn Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ser Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ile Ser Ala Ile Ser Lys Gln Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Gln Arg Tyr Asp Ala Thr Ala Tyr Met Asp Ser

50 55 60

Val Gly Lys Arg Gly Thr Ile Ser Tyr Asp Arg Ala Arg Leu Ile Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Tyr Tyr Pro Ala Phe Tyr Asp Lys Ala Met Val Asn Leu

100 105 110

Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Trp Lys Pro Val Gly Thr Gly Lys Phe Thr Pro His Glu Val Ile

1 5 10 15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Pro Val Arg Glu Thr Leu Ser

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Gln Asp Asn Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Gln Thr Gly

1 5 10 15

Gln Thr Met Ile Cys Ser Tyr Trp Lys Pro Val Gly Thr Gly Lys Phe

20 25 30

Thr Pro His Glu Val Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Pro Val Arg Glu Thr Leu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His

65 70 75 80

Met Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asp Asn Thr

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Thr Lys Glu Glu Gly Gly Arg

100 105

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Ser Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 10

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

Ala Ile Ser Lys Gln Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile

1 5 10 15

Gly Ser Ile

<210> 11

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

Thr Ala Tyr Met Asp Ser Val Gly Lys Arg Gly Thr Ile Ser Tyr Asp

1 5 10 15

Arg Ala Arg Leu Ile Asn Tyr Leu Asp Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu

20 25 30

Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg

35 40

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Gln Thr Gly

1 5 10 15

Gln Thr Met Ile Cys Ser Tyr

20

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 15

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile His Met Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

Phe Gly Gly Thr Lys Glu Glu Gly Gly Arg

1 5 10

<210> 17

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln

1 5 10 15

Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Thr Glu

20 25 30

Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala

35 40 45

Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser

50 55 60

Ser Ile Glu Gln Lys Thr Met Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Leu Glu

65 70 75 80

Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Thr Val

85 90 95

Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys

100 105 110

Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly

115 120 125

Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Ser Gly Glu Lys Lys Asn

130 135 140

Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Glu Ile

145 150 155 160

Ser Lys Glu Gln Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala

165 170 175

Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln

180 185 190

Ala Cys Leu Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu

195 200 205

Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln

210 215 220

Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Glu

225 230 235 240

Glu Ala Gly Glu Gly Asn

245

Claims

1.一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)重链可变区；和

(2)轻链可变区；

其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一种多核苷酸，其特征在于，它编码如权利要求1所述的抗体。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、或酶。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(i)如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

7.如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：

(1)检测样品中14-3-3η蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的14-3-3η蛋白；和/或

(3)检测表达14-3-3η蛋白的肿瘤细胞；

所述药剂用于治疗或预防表达14-3-3η蛋白的肿瘤。

8.一种非诊断目的的检测样品中14-3-3η蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)将样品与权利要求1所述的抗体接触；

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

第一容器，所述第一容器中含有权利要求1所述的抗体。

10.一种制备重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体。