CN113308492B - 一种用于复制性aav的检测方法 - Google Patents

一种用于复制性aav的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113308492B
CN113308492B CN202110604419.8A CN202110604419A CN113308492B CN 113308492 B CN113308492 B CN 113308492B CN 202110604419 A CN202110604419 A CN 202110604419A CN 113308492 B CN113308492 B CN 113308492B
Authority
CN
China
Prior art keywords
supernatant
culture medium
cell
cells
rcaav
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110604419.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113308492A (zh
Inventor
陈邵宏
郝丹丹
史天永
和赛超
牛琳琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Chinagene Tech Co ltd
Original Assignee
Beijing Chinagene Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Chinagene Tech Co ltd filed Critical Beijing Chinagene Tech Co ltd
Priority to CN202110604419.8A priority Critical patent/CN113308492B/zh
Publication of CN113308492A publication Critical patent/CN113308492A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113308492B publication Critical patent/CN113308492B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于复制性AAV的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更为具体的，本发明涉及一种对复制型AAV的检测方法。
背景技术
复制型AAV(rcAAV)是指含有wtAAV rep和cap基因的载体。当野生型基因存在时，如果存在辅助病毒，AAV将进行复制。除了具有完全复制能力的AAV之外，还检测到仅含有部分AAV野生型基因组的假重组AAV。rcAAV以及假重组AAV是通过ITR和载体质粒上的相邻序列之间和辅助质粒上的病毒序列之间发生同源重组而产生，wtAAV在很大程度上被认为是非致病性的，但是通过rcAAV或假重组AAV潜在的病毒DNA转移会产生具有解旋酶或DNA剪切酶活性的AAV Rep蛋白的风险，其衣壳蛋白也有可能会触发细胞毒性T淋巴细胞反应。因此，出于安全考虑，在用于临床应用重组AAV生产中，rcAAV的检测十分必要。
目前rcAAV的检测方式大致有两种，其一是在包括腺病毒在内的辅助病毒存在的情况下，感染重组AAV；使用前一轮的细胞裂解液进行多轮感染；使用Southern或qPCR对rep或cap序列进行检测；另一种方式则是不经过放大培养，直接在纯化后的重组AAV产品中进行rep或cap序列PCR检测。
两种检测方式都有它们各自的局限性：直接的qPCR检测虽然可以直接检测出产品中包装的野生型AAV的rep或cap序列，但是这并不等同于野生型AAV的存在，绝大多数被包装的序列都是经错误包装的不完整的质粒序列，因此这种方式存在大量的假阳性情况；如果我们把qPCR序列定位于包装质粒经改造过的ITR-P5位置，虽然可以避免假阳性的情况，但是未经过多轮培养放大的过程，难以达到PCR的检测限。而另一种利用辅助病毒共感染的方式，虽然可以解决直接PCR检测所存在的两个缺点，但是因为检测过程中，一直使用野生型腺病毒或HPV的共感染，而腺病毒或HPV对人的易感性和致病性，对检测人员有着一定的感染风险，相应对培养环境的要求也很高。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种不依赖于辅助病毒的rcAAV的细胞学检测方法，所述方法不使用辅助病毒，对环境和检测人员安全友好，并且具有极高的检测灵敏度和准确度。
本发明的第一个方面，提供一种不依赖于辅助病毒的检测rcAAV的方法，所述方法包括如下步骤，
A.细胞的转染和感染:
第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测rcAAV，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；优选的，待检测的rcAAV包含病毒衣壳和包含两端ITR的病毒基因组DNA。
第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；
B.用DNase I处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；
C.利用taqman qPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV。
优选的，步骤A中所述N＝2-5。
在一种实施方式中，所述细胞为可包装和感染重组AAV病毒的细胞，如293细胞、CHO细胞、HeLa细胞等。
在另一种实施方式中，步骤B包括如下步骤：
在EP管中配置2ⅹDNase I mix，加入无核酶水、2ⅹDNase I Buffer、100U/mlDNase I，吹吸混匀后依次加入待测样品，得到2倍稀释样品1，PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min。处理后样品涡旋混匀，瞬时离心，离心后取稀释样品1加入无核酶水，将其稀释为20倍稀释样品2，涡旋混匀，瞬时离心。
在另一种实施方式中，步骤C中taqman qPCR所用的引物和探针序列如下所示：rcAAV primer SET：
ITR-P5-taqF AGTGGCCAACTCCATCACTA
ITR-P5-taqR CCTCTAATACAGGACCTCCCTAAC
ITR-P5-probe CGTAATTCACGTCACGACTCCACCC
BGH primer SET：
BGH-F CCAGCCATCTGTTGTTTGCC
BGH-R ACTCAGACAATGCGATGCAAT
BGH-Probe CCCGTGCCTTCCTTGACCCT
在另一种实施方式中，步骤C中taqman qPCR配置体系为：
2*AceQ qPCR probe master mix 10ul
50*ROX reference Dye 1 0.4ul
Primer F(10uM) 0.4ul
Primer R(10uM) 0.4ul
Taqman probe(100uM) 0.02ul
Template DNA 2ul
ddH<sub>2</sub>O 6.8ul
Total 20ul
本发明的第二方面，提供一种用于检测rcAAV的试剂盒，所述试剂盒包括表达腺病毒辅助蛋白的细胞、pHelper质粒和pRC8质粒。更为优选的，所述试剂盒还包括用于PCR检测的引物和探针。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例1中转染和感染实验流程图；
图2为本发明实施例3中qPCR检测结果图(利用重组AAV基因组上的BGH来表征重组AAV的表达滴度)；
图3为本发明实施例3中qPCR检测结果图(利用野生型AAV基因组上的P5-ITR来表征可复制型AAV的表达滴度)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：HEK293T细胞的转染和感染
第一轮感染实验过程：
1.Day1.提前24小时消化HEK293T细胞，计数，按照每孔1×106细胞/2ml铺至6孔板(100ug/ml多聚赖氨酸-PBS溶液预处理10min)，共4孔。另外1×106细胞铺至6cm dish传代。37℃培养过夜。
2.Day2.4个孔细胞，2个孔为复孔。其中2个孔转染2ug pHelper质粒，另外两个孔转染1ug pHelper+1ug pRC8质粒。
3.Day3.感染待测重组AAV病毒。
4.Day4.PBS洗一次，换1.5ml新鲜DMEM-10％FBS培养基。
5.Day5.收集培养基上清于1.5ml EP管，室温离心1000rpm，5min，除去细胞和细胞碎片。取100ul上清冻存-80℃留作检测样品；1ml上清与1ml新鲜DMEM-10％FBS培养基混合后加入第二轮待感染细胞。
第2-N轮感染实验过程(1＜N≤5)：
1.Day1.提前24小时消化HEK293T细胞，计数，按照每孔1×106细胞/2ml铺至6孔板(100ug/ml多聚赖氨酸-PBS溶液预处理10min)，共4孔。另外1×106细胞铺至6cm dish传代。37℃培养过夜。
2.Day2.4个孔细胞，2个孔为复孔。其中2个孔转染2ug pHelper质粒，另外两个孔转染1ug pHelper+1ug pRC8质粒。
3.Day3.感染上一轮细胞培养基上清。
4.Day4.PBS洗一次，换1.5ml新鲜DMEM-10％FBS培养基。
5.Day5.收集培养基上清于1.5ml EP管，室温离心1000rpm，5min，除去细胞和细胞碎片。取100ul上清冻存-80℃留作检测样品；1ml上清与1ml新鲜DMEM-10％FBS培养基混合后加入第二轮待感染细胞。
实施例2：细胞培养基上清样品DNase I处理
经4-5轮实施例1中所述的感染过程后，共收集16个待测样品，对所述样品进行如下操作：
1.从-80℃冰箱取出，室温融化。
2.在EP管中配置DNase I mix，加入640ul无核酶水，160ul 10*DNase IBuffer，16ul 5U/ul DNase I，吹吸混匀。依次加入两个8联排PCR管中。
3.依次加入50ul samples(2倍稀释样品)。
4.PCR仪，37℃30min，75℃15min。
5.处理后样品涡旋混匀，瞬时离心。
6.取10ul样品加入90ul无核酶水(20倍稀释样品)，涡旋混匀，瞬时离心。
实施例3：利用taqman qPCR技术检测每一轮感染细胞培养基上清中的rcAAV
处理后的样品按照如下体系配置PCR体系：
2*AceQ qPCR probe master mix 10ul
50*ROX reference Dye 1 0.4ul
Primer F(10uM) 0.4ul
Primer R(10uM) 0.4ul
Taqman probe(100uM) 0.02ul
Template DNA 2ul
ddH<sub>2</sub>O 6.8ul
Total 20ul
rcAAV primer SET：
ITR-P5-taqF AGTGGCCAACTCCATCACTA
ITR-P5-taqR CCTCTAATACAGGACCTCCCTAAC
ITR-P5-probe CGTAATTCACGTCACGACTCCACCC
BGH primer SET：
BGH-F CCAGCCATCTGTTGTTTGCC
BGH-R ACTCAGACAATGCGATGCAAT
BGH-Probe CCCGTGCCTTCCTTGACCCT
在ABI7500上按如下条件进行PCR反应：
Figure BDA0003093866850000061
由于阳性对照孔可支持重组AAV的不断包装或者不断复制，我们利用重组AAV基因组上的BGH来表征重组AAV的表达滴度。
检测结果如图2所示(正三角和倒三角标注)，在pHelper和RC8质粒共同存在的情况下，感染的重组AAV提供病毒基因组，RC8质粒提供rep/cap蛋白，pHelper质粒提供辅助蛋白，相当于每一轮感染都可以完成一轮新病毒的包装，即病毒的复制。在两组阳性对照孔中，可见细胞培养基上清中的重组AAV的病毒滴度一直维持在1×108vg/ul的水平。
而在单独pHelper存在的情况下，由于缺乏RC8质粒所提供rep/cap蛋白，不能完成新病毒的包装，即不能支持病毒的复制。如图2所示(圆形和正方形标注)，图中待测孔的AAV病毒滴度在不断下降。相反，如果待测重组AAV中含有野生型AAV，则可以提供rep/cap蛋白，完成新病毒的包装。
我们利用野生型AAV基因组上的P5-ITR来表征可复制型AAV的表达滴度。结果如图3所示，阳性对照孔之一的检测样品中存在微量的可复制型AAV，经4轮感染后，可富集到其表达，滴度约为10vg/ul。而另一个阳性对照孔和两个待测孔均为检测到可复制型AAV的存在。因此我们的待测重组AAV样品中，(在第2-4轮感染中)rcAAV的含量少于10/1E8。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种不依赖于辅助病毒的痕量rcAAV的细胞学检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤，
A.细胞的转染和感染:
第1轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染待测重组AAV病毒，感染2-3天后收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入第2轮待感染细胞；
第2-N轮感染使用pHelper质粒和pRC8质粒转染细胞，转染后感染混合有培养基的上一轮细胞培养基上清，感染2-3天后再次收集培养基上清，将所述上清与培养基混合后加入下一轮待感染细胞；
B.用DNase I处理待测步骤A最终获得的细胞培养基上清；
C.利用taqman qPCR技术检测感染的细胞培养基上清中的rcAAV；
其中，步骤C中taqman qPCR所用的引物和探针序列如下所示：
rcAAV primer SET：
ITR-P5-taqF AGTGGCCAACTCCATCACTA
ITR-P5-taqR CCTCTAATACAGGACCTCCCTAAC
ITR-P5-probe CGTAATTCACGTCACGACTCCACCC
BGH primer SET：
BGH-F CCAGCCATCTGTTGTTTGCC
BGH-R ACTCAGACAATGCGATGCAAT
BGH-Probe CCCGTGCCTTCCTTGACCCT
步骤C中taqman qPCR配置体系为：
Figure FDA0003809365540000011
Figure FDA0003809365540000021
。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中所述N＝2-5。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤B包括如下步骤：
在EP管中配置2ⅹDNase I mix，加入无核酶水、2ⅹDNase IBuffer、100U/ml DNase I，吹吸混匀后依次加入待测样品，得到2倍稀释样品1，PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min，处理后样品涡旋混匀，瞬时离心，离心后取稀释样品1加入无核酶水，将其稀释为20倍稀释样品2，涡旋混匀，瞬时离心。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤C中taqman qPCR配置体系为：
2*AceQ qPCR probe master mix 10ul 50*ROX reference Dye 1 0.4ul Primer F(10uM) 0.4ul Primer R(10uM) 0.4ul Taqman probe(100uM) 0.02ul Template DNA 2ul ddH<sub>2</sub>O 6.8ul Total 20ul
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，细胞为可包装和感染重组AAV病毒的细胞，如293细胞、CHO细胞、HeLa细胞等。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待检测的rcAAV包含病毒衣壳和包含两端ITR的病毒基因组DNA。
CN202110604419.8A 2021-05-31 2021-05-31 一种用于复制性aav的检测方法 Active CN113308492B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110604419.8A CN113308492B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种用于复制性aav的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110604419.8A CN113308492B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种用于复制性aav的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113308492A CN113308492A (zh) 2021-08-27
CN113308492B true CN113308492B (zh) 2023-03-21

Family

ID=77376682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110604419.8A Active CN113308492B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种用于复制性aav的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113308492B (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0871483B1 (en) * 1995-06-07 2003-04-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free aav production
WO2003104413A2 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
CN103114152B (zh) * 2013-02-04 2014-12-17 许瑞安 一种测定重组腺相关病毒滴度的定量pcr方法
CN108179137B (zh) * 2018-01-24 2020-11-06 武汉枢密脑科学技术有限公司 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法
US11166996B2 (en) * 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
CN112280801A (zh) * 2020-10-30 2021-01-29 武汉枢密脑科学技术有限公司 一种利用质粒辅助进行rAAV感染滴度检测的方法及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
11.3.3.2辅助质粒的改进;梅兴国主编;《微载体药物递送***》;华中科技大学出版社;20091130;第341页 *
3.光调控神经环路;骆清铭编著;《生物分子光子学研究前沿》;上海交通大学出版社;20141031;第192页 *
Good Manufacturing Practice Production of Self-Complementary Serotype 8 Adeno-Associated Viral Vector for a Hemophilia B Clinical Trial;James A. Allay 等;《Human Gene Therapy》;20110317;第22卷(第5期);第598页右栏，第602页，图4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113308492A (zh) 2021-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1359217B1 (en) Method for direct rescue and amplification of integrated viruses from cellular DNA of tissues
Ypelaar et al. A universal polymerase chain reaction for the detection of psittacine beak and feather disease virus
Schnepp et al. Infectious molecular clones of adeno-associated virus isolated directly from human tissues
CN110846438A (zh) 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测
Schneider et al. Contamination of coagulation factor concentrates with human parvovirus B19 genotype 1 and 2
US20240076319A1 (en) Helper plasmid and method for preparing recombinant adeno-associated virus
CN106399585A (zh) 检测ⅰ群禽腺病毒的通用pcr引物、方法及检测试剂盒
CN115838399A (zh) 腺相关病毒突变体及其应用
EP3121268B1 (en) Methods for purification of a virus produced in vitro and clearance assay for the virus
CN113308492B (zh) 一种用于复制性aav的检测方法
Wagner et al. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard
Baylis et al. A proficiency testing study to evaluate laboratory performance for the detection of different genotypes of parvovirus B19
CN114250322A (zh) 用于检测水貂圆环病毒和水貂阿留申病毒的双重荧光定量pcr试剂盒
Ji et al. Simple and visible detection of novel Astroviruses causing fatal gout in goslings using one-step reverse transcription polymerase spiral reaction method
CN105132586A (zh) 含猪圆环病毒2型orf2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用
CN117660534B (zh) 一种降低重组腺相关病毒中宿主细胞dna残留的辅助质粒及应用
CN117025843A (zh) 重组型腺相关病毒制品中复制型腺相关病毒rcAAV8的检测组合物、方法及试剂盒
CN108373997A (zh) 一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用
CN117285608B (zh) 腺相关病毒突变体及其应用
CN117660532A (zh) 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的辅助质粒及应用
CN116606959A (zh) 一种用于检测慢病毒感染滴度的组合物、检测试剂、检测试剂盒及ddPCR检测方法
CN113215315A (zh) 一种h1n1禽流感病毒检测试剂盒
CN118109644A (zh) 一种人腺病毒的通用特异性型别检测引物、试剂盒和方法
CN117660533A (zh) 一种降低重组腺相关病毒中rcAAV残留的包装质粒及应用
CN116836910A (zh) 腺相关病毒易感性细胞株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant