CN103114152B - 一种测定重组腺相关病毒滴度的定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种实时荧光定量PCR检测重组腺相关病毒（rAAV）滴度的方法，通过分析AAV的空间构象，确定可能影响其检测的空间构象位置及消除方法，本发明比传统的方法能够显著提高重组腺相关病毒滴度检测的准确度，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域:
本发明涉及定量实时荧光PCR检测重组腺相关病毒滴度的方法。
背景技术:
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是含有单链的DNA，无包膜，属于依赖辅助病毒的细小病毒B19家族。这种病毒是1965年Atchison等人在猿猴腺病毒15（SV-15）中发现并定义为腺相关病毒（AAV）。AAV在宿主中的复制需要宿主细胞或其他病毒的协助才能完成，如腺病毒和疱疹病毒，也因此被称为腺相关病毒。AAV病毒颗粒直经大约20nm，呈二十面体，分子量约为5.5-6.2×106道尔顿，在CsCl梯度中的密度为1.39-1.42g/cm。相较于其它病毒，腺相关病毒更加稳定，可以承受60度的温度及离子去污剂的作用。AAV基因组为线性单链的正链或负链DNA，长度约为4700个核苷酸。腺相关病毒的基因组中含有两个开放的阅读框，rep和cap，两端分别有末端重复序列（ITR）。
重组腺相关病毒（rAAV）载体因其在体内外表达效率高、表达周期长、免疫性低、无致病和致瘤性、遗传毒性低并可规模化生产等诸多优点,使其成为目前基因治疗领域非常有前途的生物载体,现已被广泛应用于临床试验且取得很好的疗效。
然而，迄今世界上还没有形成统一的标准化的AAV滴度测定和临床剂量使用标准，给不同实验室临床试验结果间的比较造成了困难。目前国际基因治疗中应用较多的另一种腺病毒，已由腺病毒标准样品工作小组（Adenovirus Reference Material Working Group，ARMWG）根据5型腺病毒制定出标准样品指南。其对腺病毒的滴度测定和基因治疗中使用的剂量进行了统一规定。参照这一经验，美 国食品药品监督管理局（FDA）、美国国家健康研究所重组DNA顾问委员会（NIH-RAC）、美国国家基因载体实验室和来自其他9个国家的科学家共同成立了AAV标准样品工作小组（AAV Reference Standard Working Group，AAVRSWG），试图建立起AAV的标准化指南。rAAV2是基因治疗领域应用最早和最广泛的亚型，也是目前物理、化学和生物性质研究得最清楚的AAV亚型。所以标准化指南首先建立在rAAV2的基础上。该组织对rAAV2标准样品统一测定时，要求被测定的rAAV2标准样品，必须要达到在不同实验室能进行不同测定所需的量，并具有一定时间内的稳定性。同时，规定了生产和纯化rAAV2的标准指南。该组织确定，选择四个方面进行测定实施对rAAV2的质量控制：（1）使用A20酶联免疫吸附法测定rAAV2外壳滴度；（2）定量聚合酶链反应qPCR测定rAAV2的基因组滴度；（3）qPCR和增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达测定感染滴度；（4）SDS-PAGE测定病毒纯化和外壳蛋白。
如所周知，rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。研究发现，临床试验对病毒生产的要求为103和105DRP/cell（DNA酶-抗性颗粒/细胞，DNase-Resistant Particles/cell）。而临床试验中的剂量一般为2×1011DRP/kg，需要的单批产量约为1015DRP。而且不同组织对rAAV的使用滴度要求有所不同。在眼科临床试验中，大约只需要2×108DRP，而对肌肉或者肝脏疾病进行治疗时却需要1×1014DRP。目前涉及rAAV应用于临床试验的研究有81项。多数临床研究处于临床I期和II期，但是有8项临床研究已经进入III期。临床结果表明，基因表达量与rAAV的滴度成正比关系，而且大多数基因药物的疗效与表达量有很大关系，表达量太低达不到其起作用的药物需求量。某些基因药物高表达可能会导致正常功能的紊乱，从而对人体产生伤害。研究发现，rAAV对于某些病人会产生针对其外壳蛋白的免疫反应，包括抗原特异性记忆性CD8+T细胞、抗体和干扰素等。所以，rAAV的滴度测定对临床试验至关重要。而整个基因治疗领域制定标准化的滴度测定方法，将使不同实验室间临床结果比较和药物研发成为可能。目前测定rAAV滴度的方法主要检测以下几个方面：病毒颗粒滴度（Viral Particles，V.P.），基因组滴度（viral genome，V.G.），感染滴度（Infectious Particles， I.P.），转导滴度（Transduction Units，T.U.）或增强的转导滴度（Enhanced Transduction Units，E.T.U.）。
重组单链腺相关病毒ssAAV2基因组由两个末端反向重复序列（ITR）包含CAG启动子、目的基因cDNA、土拨鼠肝炎病毒后调控元件（woodchuck hepatitisB virus post-regulatory element，WPRE）、牛生长激素polyA元件（bovine growth hormone polyadenylation signal，poly A BGH）构成。双链互补腺相关病毒scrAAV2基因组因为含有两条互补的链，其中一半基因组的序列由末端ITR、牛生长激素polyA元件、目的基因cDNA和CB启动子组成，另一半是上述基因组的反向互补序列，中间由缺失了末端断裂位点（TRS）的ITR连接。重组ssAAV2和scAAV2-cDNA结构如图1所示。
分别将ssrAAV2和scrAAV2的全基因组序列通过在线DNA构象分析网站进行生物信息学分析（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form），显示野生型的AAV2基因组主要有两种可能的构象。其中一种主要构象中，两段ITR形成反向互补的发卡结构，而其他部分形成松散的DNA构象展开。另一种主要构象为两段ITR相互之间形成反向互补的构象，从而使ITR之间的序列结合在一起，形成一种松散的互补性结构。从野生型的两种主要构象中可以看到，ITR对AAV2基因组构象的影响非常大，ITR特殊的构象会导致整个AAV2基因组的构象发生变化。
重组ssAAV2-cDNA基因组的构象分析表明，虽然只有ITR与野生型AAV2基因组相同，中间的序列都不相同，但是基因组的构象与野生型基因组极为相似。表明在重组ssAAV2中，其他序列对基因组构象形成所起的作用有限，两段ITR所具有的反向重复序列，在单链AAV2的基因组构象形成中起到至关重要的作用。重组scAAV2-cDNA的基因组构象分析表明，在其基因组主要受到中间突变ITR的影响，其他自身互补性序列形成非常紧密的互补结构。虽然末端的两个ITR会形成不同的构象，但是对整体的构象影响不大。
通过对重组腺病毒载体构象分析发现，可能因其基因组上ITR的特殊构象导致qPCR的检测结果偏低。而ITR存在于所有腺相关病毒AAV中，为消除 AAV结构ITR特殊构象对qPCR检测滴度的影响，以增加其测定准确性方法的研究，迄今尚未见有相关报道。本发明目的在于提供一种能准确反映所测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法。
发明内容：
本发明首先以AAV2为例，研究证明AAV2空间构象对定量PCR（qPCR）检测的影响。为此，使用靶向不同元件CAG、cDNA、WPRE、pBGH的引物对重组ssAAV2基因组，或者CB、EGFP、pBGH等元件引物对重组scAAV2基因组进行qPCR滴度测定（图2和图3），表明不同引物qPCR测定的滴度是不同的。在测定重组ssAAV2时，由于ITR主要存在于两端，接近ITR序列进行qPCR时受到特殊构象的影响较大，所以测得的滴度较低。而重组scAAV2因其ITR序列引起的双链互补构象在qPCR的过程中不易变性，而靠近两端ITR的序列较易打开，所以测定的滴度较高。上述实验结果与生物信息学分析完全一致。
本发明所提供的一种检测重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法，是利用腺相关病毒基因组共有的空间构象末端重复序列ITR中的SmaI限制性酶切位点，通过SmaI酶切，消除影响定量PCR检测重组腺相关病毒滴度的干扰，再以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板进行实时定量PCR检测。
本发明的关键在于通过分析AAV2基因组的空间构象，确定可能干扰影响qPCR检测的空间构象ITR。然后选择合适的限制性酶，通过酶切将形成特殊空间构象的部分除去，从而消除影响qPCR主要空间构象。
具体实施步骤包括：将重组腺相关病毒感染细胞，扩增制备重组腺相关病毒；采用三质粒磷酸钙共转染HEK293细胞，制备含各种元件的重组ssAAV2和scAAV2基因组；经过超声裂解，CaCl2和PEG8000/NaCl沉淀后，再进行CsCl密度梯度离心和缓冲液透析；使用银染试剂盒鉴定各种rAAV2的纯度。
振荡离心管混匀。向每管样品中加入2.5倍体积的无水乙醇，移液枪轻轻吹打混匀，置于-20℃中过夜沉淀病毒DNA。离心沉淀DNA。70%乙醇洗涤病毒DNA。室温静置挥发，TE溶解干燥后的DNA沉淀，然后置于4℃中备用。
用SmaI酶切处理腺相关病毒DNA，破坏ITR的构象，酶切反应条件为：
37℃温育，3小时。
提取纯化重组腺相关病毒DNA。rAAV2经过DNase I于25℃孵育1小时然后，使用Proteinase K37℃孵育1小时。等体积向每管样品中加入配制好的酚、氯仿及异戊醇混合液进行纯化分离。从每管样品中轻轻吸取离心后上层水相，加入到新的离心管中，向每管加入适量体积的3M醋酸钠（pH5.2）、糖原。涡旋热变性：90℃反应10min。
以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板，用不同元件如CAG、WPRE、cDNA和pBGH等设计引物进行实时定量PCR检测重组腺相关病毒的滴度。采用传统和SmaI酶切后DNA模板进行qPCR，分别测定其滴度。qPCR使用2×SYBR Green试剂盒，标准样品使用含有全部病毒基因组的线性化质粒。使用AB公司的Stepone plus仪器进行测定。反应条件如下：
结果见表1和图4、图5，显示采用本发明SmaI酶切后DNA模板，定量测定重组腺相关病毒滴度的qPCR方法，能明显提高测定的滴度，克服了传统定量PCR方法测定重组腺相关病毒滴度偏低的缺陷，使定量PCR检测方法在检测AAV2时更加准确，并且具有可重现性。与此同时，通过本发明方法测定重组scAAV2的实验结果发现，使用靶向cDNA引物测定的滴度增长倍数，明显高于使用靶向pBGH的引物测定滴度的增长倍数（图5）；鉴于使用传统定量PCR实验中，使用靶向cDNA的引物测定的滴度明显低于使用靶向pBGH的引物测定的滴度（图3），所 以，本发明方法测定重组scAAV2时能够缩小使用不同引物间的差异，为不同实验室之间的实验结果比较提供了方便。
表1采用传统和本发明qPCR测定重组腺病毒滴度比较
本发明实施方案，系以单链ssAAV2和双链互补scAAV2为例，提供了一种测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法，所述方案适用于所有AAV病毒滴度的测定。
本发明建立的测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法具有以下优点：
1、所述方法在消除了重组腺相关病毒ITR构象的影响后，定量PCR检测rAAV2滴度明显提高且更加准确；
2、所述方法能够有效缩小使用靶向不同元件的引物进行定量PCR测定rAAV2滴度之间的差异，缩小不同实验室在定量PCR使用不同引物而引起的差异，有利于不同实验室对临床试验结果进行比对；
3、所述方法具有通用性，本发明所提及的ITR存在于所有AAV2基因组中。目前国际上使用的rAAV基本均为AAV2的重组基因组。本发明使用的限制性内切酶SamI序列也是唯一存在于两端ITR的序列中，且适用于单链和互补双链两种rAAV2，故该方法有望适用于对所有AAV进行定量PCR检测；
4、所述方法的检测范围广，可检测从106到1010基因组滴度（V.G./μl）的病毒，为不同生产规模的rAAV进行检测提供了方便。
附图说明：
图1:重组ssAAV2-和scAAV2-cDNA基因组的元件组成和SmaI酶切位点
上面为ssAAV2-cDNA
下面为scAAV2-cDNA
其中：ITR5’或3’—5’或3’端末端重复序列
Mutant ITR-突变末端重复序列
CAG—CAG启动子
cDNA—重组腺相关病毒载体中的目的基因
WPRE—土拨鼠肝炎病毒后调控元件
pBGH—牛生长激素polyA元件
CB—CB启动子
SmaI—末端重复序列中的限制性酶SmaI酶切位点
图2：不同引物qPCR测定重组ssAAV2基因组1、2两个样品的滴度
其中：CAG—CAG启动子
cDNA—重组腺相关病毒载体中的目的基因
WPRE-土拨鼠肝炎病毒后调控元件
pBGH—牛生长激素polyA元件
纵坐标—病毒滴度单位以基因组拷贝/微升（V.G/μl）表示
图3：不同引物qPCR测定重组scAAV2基因组1、2两个样品的滴度
其中：CB-CB启动子
cDNA-重组腺相关病毒载体中的目的基因
pBGH-牛生长激素polyA元件
图4：本发明和传统方法对ssAAV2基因组测定的滴度比较
其中：1、2两个样品使用靶向CAG的引物
3、4两个样品使用靶向WPRE的引物
图5：本发明和传统方法对scAAV2组测定的滴度比较
其中：1、2两个样品使用靶向cDNA的引物
3、4两个样品使用靶向pBGH的引物。
Claims (1)
1.一种检测重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法，其特征是，所述方法系利用腺相关病毒基因组共有的空间构象末端重复序列ITR中的SmaI限制性酶切位点，通过SmaI酶切，消除影响定量PCR检测重组腺相关病毒滴度的干扰，再以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板进行实时定量PCR检测，具体实施步骤包括：
1）将重组腺相关病毒感染细胞，扩增制备重组腺相关病毒；
2）提取纯化重组腺相关病毒DNA；
3）用SmaI酶切处理腺相关病毒DNA，破坏ITR的构象；
4）以酶切后的重组腺相关病毒DNA为模板，用不同元件设计引物进行实时定量PCR检测重组腺相关病毒的滴度。
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