CN113215315A

CN113215315A - 一种h1n1禽流感病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN113215315A
Application number: CN202110524904.4A
Authority: CN
Inventors: 袭细毛
Original assignee: Guangzhou Boshi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Boshi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明涉及一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括：10μM H1引物对、10μM N1引物对、10μM H1探针、10μM N1探针、5×TaqMan探针荧光定量PCR反应预混液、50×Rox dye、超纯水、2.5mM dNTP Mix、5×RT Buffer、RNase‑Free Water、SuperRT(200U/μl)、阳性对照模板、阴性对照，所述的阳性对照模板为含有H1、N1序列的线性质粒，所述的阴性对照为PBS，本发明的有益效果是提供了一种快速、准确检测H1N1禽流感病毒的试剂盒。

Description

一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于A型流感病毒，主要通过呼吸道和消化道传播，可以感染禽类、哺乳动物甚至人，并且具有高度传染性的急性综合症，1918年H1N1亚型病毒导致了“西班牙人流感”，1977年H1N1亚型病毒再次导致了“俄罗斯流感”，近年来，H1N1包含有猪流感、禽流感和人流感3种流感病毒的基因片段，病毒感染能力和重症程度加强，感染甲型H1N1流感病毒后的早期临床症状与流感类似，但甲型H1N1流感病情进展迅速，严重者可出现呼吸衰竭、多器官损伤，甚至死亡，最新疫情突出特点是重症和死亡病例数量显著增加。因此，研发快速、准确检测H1N1禽流感病毒的试剂盒很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能快速、准确检测H1N1禽流感病毒的试剂盒。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本申请一方面公开了一种用于H1N1禽流感病毒检测的引物序列，H1上游引物为Seq ID No.1所示序列，H1下游引物为Seq ID No.2所示序列，H1探针为Seq ID No.3所示序列，N1上游引物为Seq ID No.4所示序列，N1下游引物为Seq ID No.5所示序列，N1探针为Seq ID No.6所示序列。

本申请的另一方面公开了用于H1N1禽流感病毒检测的试剂盒组成，该试剂盒包括：10μM H1引物对、10μM N1引物对、10μM H1探针、10μM N1探针、5×TaqMan探针荧光定量PCR反应预混液、50×Rox dye、超纯水、2.5mM dNTP Mix、5×RT Buffer、RNase-FreeWater、SuperRT(200U/μ1)、阳性对照模板、阴性对照，所述的阳性对照模板为含有H1、N1序列的线性质粒，所述的阴性对照为PBS。

本申请的再一方面还公开了一种H1N1禽流感病毒的使用方法，包括以下步骤：

1.提取待测样品的基因组RNA；

2.将RNA反转录成cDNA，体系如下：

表1反转录体系

成分	20μl反应体系(μ1)	终浓度
			2.5mM dNTP	4	500μM
H1、N1上游引物(10μM)	1	-
			H1、N1下游引物(10μM)	1	-
RNA模板	x	0.25g/l
			RNase-Free Water	up to 20μl	-

将上面配好的体系，70℃孵育10min，迅速冰浴2min，加入5×RT Buffer，轻轻吹打混匀，加入1μl SuperRT(200U/μl)，轻轻吹打混匀，42℃孵育50min，85℃孵育5min，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，或置于-20℃长期保存；

3.配制荧光定量PCR反应体系，体系如下：

表2荧光定量PCR反应体系

成分	体积(μl)
		TaqMan探针荧光定量PCR反应预混液(5×)	4
Rox dye(50×)	0.4
		H1、N1上游引物(10μM)	0.5
H1、N1下游引物(10μM)	0.5
		H1探针(10μM)	0.5
N1探针(10μM)	0.5
		超纯水	13.6

RT-PCR反应程序95℃10min，(95℃15s，60℃35s，72℃45s)，40个循环，72℃10min；

用10倍梯度稀释含有H1、N1序列的线性质粒作为标准品，进行实时荧光定量PCR，反应体系和反应程序同上，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线；

4.将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。

本发明进一步对所建立的H1N1双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的特异性、敏感性和稳定性进行分析，其中：

特异性检测：本发明以H1N1、H1N5、H5N5、H5N6、H7N1、H8N4、H1N3、H11N9、H9N1、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2 RNA为模板，用本试剂盒进行荧光定量RT-PCR检测。

敏感性检测：构建含有H1、N1序列的pcDNA3.1-H1-N1质粒，质粒用微量核酸定量仪NanoDrop进行定量，取10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μl的重组质粒作为标准品模板，分别加入到体系中进行扩增，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线，用于计算本检测体系的最低检测限度。

稳定性检测：在同一次试验中，同一个PCR板中，按照10×梯度稀释，设置三个稀释梯度，对H1N1禽流感病毒阳性核酸进行双重实时荧光RT-PCR检测，每个样本做三个重复，另外在不同PCR板上重复三次，计算各个稀释度样品的三个重复反应所获得的Ct值的变异系数。

本发明的有益效果是：

提供了一种快速、准确检测H1N1禽流感病毒的试剂盒。

附图说明

图1 H1N1基因在FAM、HEX通道的扩增结果

图2 H1N5、H1N9基因在FAM通道的扩增结果

图3 H7N1、H9N1基因HEX通道的扩增结果

图4标准曲线

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

H1N1、H1N5、H5N5、H5N6、H7N1、H8N4、H1N3、H11N9、H9N1、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2基因来自广州出入境检验检疫局，SuperRT cDNA kit购自北京华越洋生物科技有限公司，TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司，In-Fusion HDCloning Kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司，pcDNA3.1载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自赛默飞世尔科技公司；

2.主要仪器设备

Thermal Cycler Dice Real Time System TP800购自日本TaKaRa生物股份有限公司，XPR电子分析天平购自梅特勒-托利多上海有限公司，H2100R高速冷冻离心机购自湘仪离心机仪器有限公司，JH-D超纯水仪购自江辉环保科技有限公司，JC-CHP-80s水套式二氧化碳培养箱购自青岛聚创环保集团有限公司；

3.引物设计

从NCBI上查找H1N1禽流感病毒株的HA基因序列(CY257501.1，Seq ID No.7)、NA基因序列(CY257503.1，Seq ID No.8)，利用Primer Epress 3.0.1软件，针对保守区设计特异性引物和TaqMan探针序列，H1上游引物为Seq ID No.1所示序列，H1下游引物为Seq IDNo.2所示序列，H1探针为Seq ID No.3所示序列，N1上游引物为Seq ID No.4所示序列，N1下游引物为Seq ID No.5所示序列，N1探针为Seq ID No.6所示序列，H1探针荧光发射基团为FAM，N1探针荧光发射基团为HEX，淬灭基团为BHQ-1；

4.样品RNA提取

①样本采集

活禽样品采集，取咽喉试子和泄殖腔试子，取咽喉试子时将试子深入喉头口及上颚裂来回刮取咽喉分泌液，取泄殖腔试子时将试子深入泄殖腔转一圈沾取粪便，然后将试子一起放入盛有2ml PBS的试管，充分洗涤试子，转入无菌离心管中备用；

新鲜肌肉或脏器，取待测样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mlPBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用；

血清、血浆或冷冻组织渗出液可直接取用；

分离后的样本在2-8℃条件下保存应不超过24h，-80℃以下可长期保存，但应避免反复冻融；

②在样本中，加入5-10倍体积Trizol液，混匀；

③室温放置5min，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的氯仿，盖紧离心管，剧烈摇荡离心管15s；

④取上层水相于一新的离心管，按每1ml Trizol液加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min；

⑤重复步骤四；

⑥小心弃去上清液，室温干燥5-10min；

⑦将RNA溶于水中，-20℃保存备用；

5.将RNA反转录成cDNA，体系如下：

表1反转录体系

成分	20μl反应体系(μl)	终浓度
			2.5mM dNTP	4	500μM
H1、N1上游引物(10μM)	1	-
			H1、N1下游引物(10μM)	1	-
RNA模板	x	0.25g/l
			RNase-Free Water	up to 20μl	-

6.配制荧光定量PCR反应体系，体系如下：

表2荧光定量PCR反应体系

RT-PCR反应程序95℃10min，(95℃15s，60℃35s，72℃45s)40个循环，72℃10min；

7.阳性质粒构建

用针对H1N1禽流感病毒的H1基因、N1基因特异性引物分别进行普通PCR扩增，H1基因引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，N1基因引物序列如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示，其扩增范围包括荧光定量RT-PCR扩增区域，将H1基因、N1基因PCR反应结束后，混合，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用NotI、BamH I酶切pcDNA3.1质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli DH5a感受态细胞，将转化的感受态细胞涂于含有X-Gal和IPTG的琼脂平板，37℃培养12-16h，从平板上长出的蓝色、白色菌落中随机挑取3-4个白色菌落，提取质粒，用PCR反应液检测，扩增阳性的菌落，送生物公司测序，将鉴定序列正确的阳性菌落，用3-5ml液体LB培养基培养，37℃摇床振荡培养12-16h，提取质粒，使用BssH II酶切重组质粒，获得线性化质粒DNA，作为构建标准曲线的阳性质粒，命名为pcDNA3.1-H1-N1；

8.制作标准曲线

用10倍梯度稀释含有H1N1序列的线性质粒作为标准品，进行实时荧光定量PCR，反应体系和反应程序同步骤五，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线，结果判定标准为：Ct值≤33，判定为阳性；Ct值≥35，判断为阴性；Ct值在33-35之间为可疑，重复一次，如果Ct值仍在33-35之间，则为阳性，每个样本设置三个重复；

9.将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。

实施例2特异性验证

实验步骤同实施例1，分别以H1N1、H1N5、H5N5、H5N6、H7N1、H8N4、H1N3、H11N9、H9N1、H3N2、H6N6、H9N6、H9N2 RNA为模板，利用本试剂盒进行荧光定量RT-PCR扩增。

由图1可知，只有H1N1禽流感病毒核酸在FAM检测通道和HEX检测通道都出现相应的特异性荧光扩增曲线，由图2可知，H1N5、H1N3由于含有H1基因，因此在FAM检测通道出现扩增曲线，而HEX检测通道则无扩增曲线，由图3可知，H7N1、H9N1由于含有N1在HEX检测通道出现扩增曲线，而FAM检测通道则无扩增曲线，其他流感病毒两个荧光通道都无扩增曲线，说明该方法具有很强的特异性。

实施例3灵敏度验证

根据标准曲线，计算最低检测限度，实验结果表明，由pcDNA3.1-H1-N1阳性质粒构建的标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度Log值具有良好的线性关系，相关系数为0.998，根据多重荧光RT-PCR检测方法结果判定标准，灵敏度为90拷贝/μl。

实施例4稳定性验证

在同一次试验中，同一个PCR板中，按照10×梯度稀释，设置三个稀释梯度，对H1N1禽流感病毒阳性核酸进行双重实时荧光RT-PCR检测，检测方法同实施例1，每个样本做三个重复，(见表3)另外在不同PCR板上重复三次，计算各个稀释度样品的三个重复反应所获得的Ct值的变异系数(见表4)。

从试验结果可得，同一个PCR板中的变异系数在0.12-0.27％之间，不同PCR板的变异系数在0.26-0.45％之间，说明本方法双重RT-PCR检测方法误差小、重复性好，可对H1N1禽流感病毒进行稳定、可靠的检测。

表3 H1N1禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的批内重复结果

表4 H1N1禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法的批间重复结果

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaagctca tggcccaatt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccagcgtga ggacatgct 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actcgaacaa aggtgtaacg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accaactttg ctgctggaca gt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacagggcag agagaggaat tg 22

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttccgtgaa attagc 16

<210> 7

<211> 1752

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 7

ggaaaacaaa agcaacaaaa atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttacaa 60

ccgcaaatgc agacacatta tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag 120

acacagtact agaaaaaaat gtaacagtaa cacactctgt taatcttctg gaagacaagc 180

ataacggaaa actatgcaaa ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca 240

ttgctggctg gatcctggga aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agatcatggt 300

cctacattgt ggaaacatct aattcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatca 360

attatgagga gctaagagag caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgaaatat 420

tccccaagac aagctcatgg cccaattatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc 480

ctcacgctgg agcaaaaagc ttctacaaaa acttgatatg gctagttaaa aaaggaaatt 540

catacccaaa gctcaaccaa tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctgt 600

ggggcattca ccatccatct actactgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagacg 660

catatgtttt tgtggggaca tcaaaataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaacaa 720

gacccaaagt gagggatcaa gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg 780

gagacaaaat aacattcgaa gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcacaa 840

tggaaagaaa tgctggatct ggtattatca tttcagatac accagtccaa gattgcaata 900

caacttgtca gacacccgag ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatgtacatc 960

cgatcacaat tgggaaatgt ccaaagtatg taaaaagcac aaaattgaga ttggccacag 1020

gattgaggaa tgtcccgtct attcaatcta gaggcctatt cggggccatt gccggcttca 1080

ttgaaggggg gtggacaggg atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc 1140

aggggtcagg atatgcagcc gacctgaaga gcacacaaaa tgccattgac aagattacta 1200

acaaagtaaa ttctgttatt gaaaagatga atacacagtt cacagcagtg ggtaaagagt 1260

tcaaccacct ggaaaaaaga atagagaatc taaacaaaaa agttgatgat ggtttcctgg 1320

acatttggac ttacaatgcc gaactgttgg ttctactgga aaatgaaaga actttggact 1380

atcacgattc aaatgtgaag aacttgtatg aaaaagtaag aaaccagtta aaaaacaatg 1440

ccaaggaaat tggaaacggc tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acatgcatgg 1500

aaagtgtcaa aaatgggact tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca 1560

gagaaaaaat agatggggta aagctggaat caacaaggat ctaccagatt ttggcgatct 1620

attcaactgt cgccagttca ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga 1680

tgtgctctaa tgggtctcta cagtgtagaa tatgtattta acattaggaa ttcagaatca 1740

tgagaaaaac ac 1752

<210> 8

<211> 1434

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 8

agtttaaaat gaatccaaac caaaagataa taactattgg ttctatctgt atgacaattg 60

gaatggctaa cttaatatta caaattggaa acataatctc aatatgggtt agccactcaa 120

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aatgctcctg ttaccctgat tctagtgaaa tcacatgtgt gtgcagggat aactggcatg 900

gctcgaatcg accgtgggtg tctttcaacc agaatctgga atatcagatg ggatacatat 960

gcagtggggt tttcggagac aatccacgcc ctaatgataa gacaggcagt tgtggtccag 1020

tatcgtctaa tggagcaaat ggagtaaaag gattttcatt caaatacggc aatggtgttt 1080

ggatagggag aactaagagc attagttcaa gaaaaggttt tgaaatgatt tgggatccga 1140

atggatggac tgggactgac aataaattct caataaagca agatatcgta ggaataaatg 1200

agtggtcagg gtatagcggg agttttgttc agcatccaga actaacaggg ctggattgta 1260

taagaccttg cttctgggtt gaactaataa gaggacgacc cgaagagaac acaatctgga 1320

ctagcgggag cagcatatcc ttttgtggtg tagacagtga cactgtgggt tggtcttggc 1380

cagacggtgc tgagttgcca tttaccattg acaagtaatt tgttcaaaaa aact 1434

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccctctaga ctcgagcggc cgctcactct ccacagcaag atcatg 46

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gttgctgatg tttggtcagc agtagtagat ggatgg 36

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctgaccaaa catcagcaac accaactttg c 31

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagcggttta aacttaagct tgaacttcac caataggaca gctca 45

Claims

1.一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10μM H1引物对、10μM N1引物对、10μM H1探针、10μM N1探针、5×TaqMan探针荧光定量PCR反应预混液、50×Rox dye、超纯水、2.5mM dNTP Mix、5×RT Buffer、RNase-Fre e Water、SuperRT(200U/μl)、阳性对照模板、阴性对照，所述的阳性对照模板为含有H1、N1序列的线性质粒，所述的阴性对照为PBS，所述的H1引物对上游引物序列为：GACAAGCTCATGGCCCAATT，下游引物序列为：TCCAGCGTGAGGACATGCT，H1探针序列为：ACTCGAACAAAGGTGTAACG，N1引物对上游引物序列为：ACCAACT TTGCTGCTGGACAGT，下游引物序列为：AACAGGGCAGAGAGAGGAATTG，N1探针序列为：TTTCCGTGAAATTAGC。

2.根据权利要求1所述的一种H1N1禽流感病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

①提取样品RNA；

②将RNA反转录成cDNA；

③配制荧光定量PCR反应体系，体系如下：TaqMan探针荧光定量PCR反应预混液(5×)4μl、Rox dye(50×)0.4μl、H1、N1上游引物(10μM)0.5μl、H1、N1下游引物(10μM)0.5μl、H1探针(10μM)0.5μl、N1探针(10μM)0.5μl、超纯水13.6μl；

RT-PCR反应程序为95℃10min，(95℃15s，60℃35s，72℃45s)40个循环，72℃10min；

④制作标准曲线

用10倍梯度稀释含有H1、N1序列的线性质粒作为标准品，进行实时荧光定量PC R，反应体系和反应程序同上，根据Ct值与模板浓度的Log值构建标准曲线；

⑤将待检样品的实时荧光定量PCR检测结果与标准曲线对照，得出检测结果。