CN113293159A - 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法，该核酸提取试剂盒包括磁性纳米颗粒溶液、螯合树脂悬浮液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱液，其中，所述磁性纳米颗粒经过有效的壳聚糖修饰和预处理，通过控制溶液适度pH值实现吸附、解吸核酸，所述螯合树脂用于机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能，所述洗涤液用于洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片，所述洗脱液用于使吸附于所述磁性纳米颗粒的核酸充分释放，以得到核酸溶液。使用本发明的核酸提取流程方便快捷，无需使用裂解液、高离液盐、有机溶剂等有毒有害试剂或扩增反应抑制剂，提取过程安全简便，提高提取核酸的纯度和浓度，获得的核酸溶液可以直接应用于后续PCR。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，特别是涉及一种核酸提取试剂盒及核 酸提取方法。
背景技术
核酸是所有生物分子中最基本的物质，对核酸的高质量提取也是分子 生物学中最关键的步骤之一。核酸提取可大致分为三个步骤：细胞裂解， 去除杂质和核酸纯化。
核酸提取的前提是将其从细胞或其他生物物质中释放出来，常用的细 胞裂解方法包括机械裂解、胍盐裂解、碱裂解、CTAB裂解、酚抽提等。其 中，胍盐裂解、碱裂解、CTAB裂解、酚抽提等都不可避免地会使用毒性的 有机溶剂且步骤繁琐，耗时长，提取效率低，而利用磁性纳米颗粒的破碎 作用机械裂解细胞操作简单，无毒无害。
核酸的分离和纯化对提取高纯度核酸至关重要，目前市面上常采用二 氧化硅基质、磁珠和阴离子交换等方法分离纯化核酸。二氧化硅基质提取 过程中依靠核酸与二氧化硅粒子之间的亲和力，在高盐的酸性条件下紧密 结合核酸，用乙醇、异丙醇等有机溶剂洗涤去其他杂质，再用低离子强度 的缓冲液洗脱结合的核酸分子。阴离子交换法则依靠树脂在低盐的碱性溶 液条件下结合核酸，洗涤蛋白质等杂质，再用高盐的酸性溶液洗脱结合在树脂上的核酸分子。这两种方法中，盐浓度和pH值的要求严格，且不可避 免的使用有机溶剂和有毒试剂，操作复杂，自动化操作水平低。利用磁性 纳米颗粒分选则可在磁性载体表面修饰特定功能基团，实现对核酸分子的 可逆吸附，无需昂贵的离心设备，但目前市面上的磁珠提取试剂盒大部分 依然需引入有机溶剂，不利于后续的PCR反应。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本申请的背 景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的 信息。
发明内容
本发明提供一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法，解决现有核酸提取 试剂盒步骤繁琐，耗时长，引入有毒有害和有机试剂等扩增反应抑制剂， 提取核酸的纯度和浓度偏低的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种核酸提取试剂盒，包括磁性纳米颗粒溶液、螯合树脂悬浮液、蛋 白酶K溶液、洗涤液以及洗脱液，其中，所述磁性纳米颗粒经过有效的壳 聚糖修饰和预处理，通过控制溶液适度pH值实现吸附、解吸核酸，所述螯 合树脂用于机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能，所述洗涤 液用于洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片，所述 洗脱液用于使吸附于所述磁性纳米颗粒的核酸充分释放，以得到核酸溶液。
进一步地：
所述磁性纳米颗粒为壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。
所述纳米微球基质为四氧化三铁，表面基团为环氧基团，粒径为 200-300nm。
所述壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球是以壳聚糖修饰液涡旋处 理四氧化三铁磁性纳米微球12-15小时得到的。
所述壳聚糖修饰液是将低分子量壳聚糖，脱乙酰度≥95％，溶解于1％ 的乙酸溶液中配制成1％的壳聚糖乙酸溶液，再用去离子水稀释壳聚糖乙酸 溶液至0.1％后，用1MNaOH调节溶液pH为9得到的。
采用如下配置中的任一种或多种：
所述磁性纳米颗粒溶液含有：浓度为5mg/mL的磁性纳米颗粒；浓度 10mM的Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为8.0；体积百分比浓度为0.1％ 的TritonX-100；
所述螯合树脂悬浮液中固体颗粒为Chelex-100弱阳离子螯合树脂，所 述Chelex-100基质为聚苯乙烯二乙烯基苯，还含有10mM的Tris-HCl(pH 为8.0)，质量体积浓度为20％；
所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述洗涤液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为7.4；
所述洗脱液含有浓度10mM Tris–HCl和浓度1mM EDTA，所述洗脱液 的pH为8.5。
还包括缓冲液。
所述缓冲液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为6.8。
一种核酸提取方法，使用所述的核酸提取试剂盒，所述方法包括如下 步骤：
加入样本和螯合树脂悬浮液混匀震荡并加热，利用螯合树脂机械裂解 细胞和特异性吸附非核酸杂质；
混合溶液离心后取上清液加入磁性纳米颗粒溶液和蛋白酶K溶液混匀 并震荡，利用蛋白酶K降解残余蛋白质，利用磁性纳米颗粒吸附核酸；
加入洗涤液，洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞 碎片；
加入洗脱液使吸附于磁性纳米颗粒的核酸充分释放，得到核酸溶液。
所述方法具体包括如下步骤：
(1)一个对细胞裂解和特异性吸附非核酸有机杂质的步骤：在1.5ml 离心管中加入200μL细胞样本和200μL螯合树脂悬浮液、充分颠倒混匀， 置于95℃裂解10分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证螯合树脂 对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异性吸附；
(2)一个有机杂质分离的步骤：将步骤(1)中混合液体以5000rpm 的转速离心2分钟，吸取上清液至另一新1.5ml离心管中；
(3)一个对核酸分子吸附并进一步去除组蛋白的步骤：向步骤(2) 中的离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液和250 μL缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡旋震 荡处理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；
(4)一个去除杂质的步骤：将步骤(3)中的离心管放置于磁力架上 静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入500μL洗涤液， 将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(5)一个对核酸分子洗脱的步骤：将步骤(4)中的离心管放置于磁 力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入200μL 洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(6)一个对提纯后核酸溶液收集的步骤：将步骤(5)中的离心管放 置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后，将提取完成的核 酸溶液转移到新的离心管中。
本发明相较于传统核酸提取试剂盒的有益效果在于：
(1)本发明的试剂盒采用热裂解结合螯合树脂的破碎作用机械裂解 细胞，裂解效率高，同时螯合树脂能够特异性吸附非核酸有机杂质，在裂 解过程中即可发挥初步除杂的功效，由此使得细胞中的核酸能够充分释放， 有利于提高后续提取核酸的纯度和浓度；同时不引入任何有毒危险试剂， 操作更加简便、安全、无污染。
(2)本发明的试剂盒中的磁性纳米颗粒溶液经过特定的壳聚糖修饰， 能够通过电荷吸附作用在特定pH值的溶液中结合或释放核酸，因此整个核 酸提取过程中不需要使用高离液盐、有机溶剂等有毒有害物质和扩增抑制 剂，操作十分便捷，提取获得核酸纯度高。
(3)本发明的试剂盒洗脱获得的核酸溶液中不含任何有机溶剂，杂 质极少，和后续PCR所需的pH值十分接近，提取获得的核酸溶液可直接应 用于PCR及其他扩增反应中，无需其他处理步骤，大大简化了实验步骤， 缩短了时间成本。
(4)本发明的试剂盒提取方法简便，耗时短，成本低；既可以手工 操作，也适用于自动化平台；所有提取试剂无毒无害，安全可靠；所有试 剂均可常温保存运输，节约了生产应用成本。
综上所述，本发明提供一种基于磁性纳米颗粒和螯合树脂的核酸提 取试剂盒及核酸提取方法，和传统的磁珠法核酸提取试剂盒相比，本发明 整个提取流程更加方便快捷；无需使用裂解液、高离液盐、有机溶剂等有 毒有害试剂或扩增反应抑制剂，提取过程安全简便，获得的核酸溶液可以 直接应用于后续PCR。针对疫情等突发紧急情况，医院及疾控机构临床样 本激增，对核酸提取效率和通量的需求和对核酸提取质量的要求也随之提高，研发毒性低、操作简便、样本通量高、核酸提取效果佳的核酸提取新 方法意义重大。本发明提供的核酸提取试剂盒既能够实现手工操作，还可 整合至各种自动化核酸提取设备和微流控***中，只需要加入样品即可全 自动实现核酸提取，在最大程度上简化实验操作步骤并保证实验人员的安 全，整个操作过程简便、快捷、安全、无污染，成本低廉经济效益高，具 有广泛的应用前景。
附图说明
图1A至图1F为使用本发明提供的实施例所述试剂盒与竞品试剂盒对 海拉细胞悬液进行核酸提取后进行紫外-可见分光光度法检测得到的图像。
图2A至图2F是使用本发明提供的实施例所述试剂盒与竞品试剂盒对 人脐静脉内皮细胞悬液进行核酸提取后进行紫外-可见分光光度法检测得 到的图像。
图3A至图3B是使用本发明提供的实施例所述试剂盒与竞品试剂盒对 海拉细胞悬液进行核酸提取后进行qPCR检测得到的曲线图。
图4A至图4B是使用本发明提供的实施例所述试剂盒与竞品试剂盒对 人脐静脉内皮细胞悬液进行核酸提取后进行qPCR检测得到的曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅 是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
在一种实施例中，一种基于磁性纳米颗粒和螯合树脂的核酸提取试剂 盒，其含有磁性纳米颗粒溶液、螯合树脂悬浮液、蛋白酶K溶液、洗涤液、 洗脱液，其中，所述磁性纳米颗粒经过有效的壳聚糖修饰和预处理，通过 控制溶液适度pH值可以实现吸附、解吸核酸；螯合树脂能够起到机械裂解 细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能，热裂解结合螯合树脂的破碎作 用机械裂解细胞，裂解效率高，同时螯合树脂能够特异性吸附非核酸有机杂质，在裂解过程中即可发挥初步除杂的功效，由此使得细胞中的核酸能 够充分释放，有利于后续提取核酸的纯度和浓度；所述洗涤液用于洗涤磁 性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片等杂质；所述洗脱液 用于使吸附于所述磁性纳米颗粒的核酸充分释放，以得到核酸溶液。
在另一种实施例中，上述核酸提取试剂盒的使用过程包括：
首先加入样本和螯合树脂悬浮液混匀震荡并加热，螯合树脂能够起到 机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能；混合溶液离心后取上 清液加入磁性纳米颗粒溶液和蛋白酶K溶液混匀并震荡，其中利用蛋白酶 K降解残余蛋白质，利用磁性纳米颗粒吸附核酸；随后加入洗涤液，洗涤 磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片等杂质；最后加入 洗脱液使吸附于磁性纳米颗粒的核酸充分释放，得到浓度高纯度高的核酸溶液。
和传统的磁珠法核酸提取试剂盒相比，本发明整个提取流程更加方便 快捷；无需使用裂解液、高离液盐、有机溶剂等有毒有害试剂或扩增反应 抑制剂，提取过程安全简便，获得的核酸溶液可以直接应用于后续的聚合 酶链式反应。
作为优选，所述磁性纳米颗粒溶液含有：浓度为5mg/mL的磁性纳米 颗粒；浓度10mM的Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为8.0；体积百分比 浓度为0.1％TritonX-100。
作为优选，所述磁性纳米颗粒为壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微 球。
作为优选，所述纳米微球基质为四氧化三铁，表面基团为环氧基团， 粒径为200-300nm。
作为优选，所述壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球是以壳聚糖修 饰液涡旋处理四氧化三铁磁性纳米微球12-15小时。
作为优选，所述壳聚糖修饰液是将低分子量壳聚糖，脱乙酰度≥95％， 溶解于1％的乙酸溶液中配制成1％的壳聚糖乙酸溶液，再用去离子水稀释壳 聚糖乙酸溶液至0.1％后，用1M NaOH调节溶液pH为9。
其中，所述磁性纳米微粒在pH小于壳聚糖pKa值的溶液环境中，能 够通过电荷特异性的吸附带负电的核酸分子，而在pH大于壳聚糖pKa值的 溶液环境中，能够解吸核酸分子，从而实现核酸的纯化；所述壳聚糖修饰 液能够与四氧化三铁磁性纳米微球表面的环氧基团反应，从而将壳聚糖结 合到磁性纳米颗粒表面；所述Tris–HCl能够维持磁性纳米颗粒的结构和 性质，能够维持样品细胞裂解后释放出核酸的稳定性，避免核酸的降解； 所述TritonX-100为即聚乙二醇辛基苯基醚100，作为非离子表面活性剂 可以维持磁性纳米颗粒的结构和性质，同时溶解脂质增加细胞膜的通透性。
作为优选，所述螯合树脂悬浮液中固体颗粒为Chelex-100弱阳离子 螯合树脂，溶液部分为10mM的Tris-HCl(pH为8.0)，质量体积浓度为20％。
其中，所述Chelex-100基质为聚苯乙烯二乙烯基苯，能够特异性吸 附非核酸有机杂质，同时在热裂解细胞的同时可通过震荡发挥机械裂解细 胞的作用。
作为优选，所述蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
其中，所述蛋白酶K作为强力蛋白溶解酶，能够酶解与核酸结合的组 蛋白，使核酸游离在溶液中，从而被磁性纳米颗粒吸附。
作为优选，所述洗涤液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的 pH为7.4。
作为优选，所述洗脱液含有浓度10mM Tris–HCl和浓度1mM EDTA， 所述洗脱液的pH为8.5。
作为优选，所述缓冲液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的 pH为6.8。
其中，所述洗涤液和缓冲液能够创造并维持磁性纳米颗粒能够吸附核 酸分子的溶液环境，所述洗脱液则能够保证核酸分子与磁性纳米颗粒解吸 的溶液环境，获得的核酸溶液中不含有毒有机溶剂，能够直接应用于后续 的PCR反应。
以下进一步描述本发明的一些具体实施例。
在一些实施例中，上述核酸提取试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)一个对细胞裂解和特异性吸附非核酸有机杂质的步骤：在1.5ml 离心管中加入200μL细胞样本和200μL螯合树脂悬浮液、充分颠倒混匀， 置于95℃裂解10分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证螯合树脂 对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异性吸附；
(2)一个有机杂质分离的步骤：将步骤1中混合液体以5000rpm的 转速离心2分钟，吸取上清液至另一新1.5ml离心管中；
(3)一个对核酸分子吸附并进一步去除组蛋白的步骤：向步骤2中 的离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液和250μL 缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处 理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；
(4)一个去除杂质的步骤：将步骤(3)中的离心管放置于磁力架上 静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入500μL洗涤液， 将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(5)一个对核酸分子洗脱的步骤：将步骤(4)中的离心管放置于磁 力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入200μL 洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(6)一个对提纯后核酸溶液收集的步骤：将步骤(5)中的离心管放 置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后，将提取完成的核 酸溶液转移到新的离心管中。
实施例1
本实施例以海拉细胞悬液为样本，提取样本中的核酸。本实施例的核 酸提取过程如下：
(1)在1.5ml离心管中加入200μL的海拉细胞悬液和200μL螯合 树脂悬浮液、充分颠倒混匀，置于95℃裂解10分钟，期间多次将混合溶 液涡旋震荡处理保证螯合树脂对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异性吸附；
(2)将混合液体以5000rpm的转速离心2分钟，吸取上清液至另一 新1.5ml离心管中；
(3)向离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液 和250μL缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡 旋震荡处理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；
(4)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后吸去液体，加入500μL洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡 混匀3分钟；
(5)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后吸去液体，加入200μL洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡 混匀3分钟；
(6)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后，将提取完成的核酸溶液转移到新的离心管中，并处于适当条件保存。
(7)取提取完成的核酸溶液进行紫外-可见分光光度法检测核酸浓度 和纯度，实验结果见表1和图1A至图1F所示；取提取完成的核酸溶液直 接作为模板进行qPCR，实验结果见表2和图3A至图3B所示。结果表明本 实施例试剂盒提取所获核酸浓度和纯度均优于竞品，且能够直接应用于 PCR及其他扩增反应中效果优良。
表1提取所获核酸浓度和纯度结果
表2提取所获核酸作为模板进行qPCR所获Ct值
图1A至图1F示出海拉细胞核酸提取液紫外-可见分光光度法检测图 像，其中图1A至图1C为本实施例试剂盒，图1D至图1F为竞品试剂盒。 图3A至图3B示出海拉细胞核酸提取液qPCR曲线图，其中图3A为本实施 例试剂盒，图3B为竞品试剂盒。
实施例2
本实施例以人脐静脉内皮细胞悬液为样本，提取样本中的核酸。本实 施例的核酸提取过程如下：
(1)在1.5ml离心管中加入200μL的人脐静脉内皮细胞悬液和200 μL螯合树脂悬浮液、充分颠倒混匀，置于95℃裂解10分钟，期间多次将 混合溶液涡旋震荡处理保证螯合树脂对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异 性吸附；
(2)将混合液体以5000rpm的转速离心2分钟，吸取上清液至另一 新1.5ml离心管中；
(3)向离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液 和250μL缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡 旋震荡处理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；
(4)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后吸去液体，加入500μL洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡 混匀3分钟；
(5)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后吸去液体，加入200μL洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡 混匀3分钟；
(6)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸 附后，将提取完成的核酸溶液转移到新的离心管中，并处于适当条件保存。
(7)取提取完成的核酸溶液进行紫外-可见分光光度法检测核酸浓度 和纯度，实验结果见表3和图2A至图2F所示；取提取完成的核酸溶液直 接作为模板进行qPCR，实验结果见表4和图4A至图4B所示。结果表明本 实施例试剂盒提取所获核酸浓度和纯度均优于竞品，且能够直接应用于 PCR及其他扩增反应中效果优良。
图2A至图2F示出人脐静脉内皮细胞核酸提取液紫外-可见分光光度 法检测图像，其中图2A至图2C为本实施例试剂盒，图2D至图2F为竞品 试剂盒。图4A至图4B示出人脐静脉内皮细胞核酸提取液qPCR曲线图，其 中图4A为本实施例试剂盒，图4B为竞品试剂盒。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而 不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请 人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说 明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这 些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当 视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施 例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点 包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的 示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、 结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结 合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的 不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已 经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请 的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
Claims (10)
1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括磁性纳米颗粒溶液、螯合树脂悬浮液、蛋白酶K溶液、洗涤液以及洗脱液，其中，所述磁性纳米颗粒经过有效的壳聚糖修饰和预处理，通过控制溶液适度pH值实现吸附、解吸核酸，所述螯合树脂用于机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质的双重功能，所述洗涤液用于洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片，所述洗脱液用于使吸附于所述磁性纳米颗粒的核酸充分释放，以得到核酸溶液。
2.如权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球。
3.如权利要求2所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述纳米微球基质为四氧化三铁，表面基团为环氧基团，粒径为200-300nm。
4.如权利要求2或3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述壳聚糖修饰的四氧化三铁磁性纳米微球是以壳聚糖修饰液涡旋处理四氧化三铁磁性纳米微球12-15小时得到的。
5.如权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述壳聚糖修饰液是将低分子量壳聚糖，脱乙酰度≥95％，溶解于1％的乙酸溶液中配制成1％的壳聚糖乙酸溶液，再用去离子水稀释壳聚糖乙酸溶液至0.1％后，用1M NaOH调节溶液pH为9得到的。
6.如权利要求1至5任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，采用如下配置中的任一种或多种：
所述磁性纳米颗粒溶液含有：浓度为5mg/mL的磁性纳米颗粒；浓度10mM的Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为8.0；体积百分比浓度为0.1％的TritonX-100；
所述螯合树脂悬浮液中固体颗粒为Chelex-100弱阳离子螯合树脂，所述Chelex-100基质为聚苯乙烯二乙烯基苯，还含有10mM的Tris-HCl(pH为8.0)，质量体积浓度为20％；
所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述洗涤液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为7.4；
所述洗脱液含有浓度10mM Tris–HCl和浓度1mM EDTA，所述洗脱液的pH为8.5。
7.如权利要求1至5任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液。
8.如权利要求7所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为浓度为10mM Tris–HCl，所述Tris–HCl的pH为6.8。
9.一种核酸提取方法，其特征在于，使用如权利要求1至8任一项所述的核酸提取试剂盒，所述方法包括如下步骤：
加入样本和螯合树脂悬浮液混匀震荡并加热，利用螯合树脂机械裂解细胞和特异性吸附非核酸杂质；
混合溶液离心后取上清液加入磁性纳米颗粒溶液和蛋白酶K溶液混匀并震荡，利用蛋白酶K降解残余蛋白质，利用磁性纳米颗粒吸附核酸；
加入洗涤液，洗涤磁性纳米颗粒并吸弃溶液中的蛋白质、脂质、细胞碎片；
加入洗脱液使吸附于磁性纳米颗粒的核酸充分释放，得到核酸溶液。
10.如权利要求9所述的核酸提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)一个对细胞裂解和特异性吸附非核酸有机杂质的步骤：在1.5ml离心管中加入200μL细胞样本和200μL螯合树脂悬浮液、充分颠倒混匀，置于95℃裂解10分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证螯合树脂对细胞的裂解和对非核酸杂质的特异性吸附；
(2)一个有机杂质分离的步骤：将步骤(1)中混合液体以5000rpm的转速离心2分钟，吸取上清液至另一新1.5ml离心管中；
(3)一个对核酸分子吸附并进一步去除组蛋白的步骤：向步骤(2)中的离心管中加入50μL磁性纳米颗粒溶液、20μL蛋白酶K溶液和250μL缓冲液颠倒混匀，置于室温孵育5分钟，期间多次将混合溶液涡旋震荡处理保证磁性纳米颗粒对核酸的充分吸附；
(4)一个去除杂质的步骤：将步骤(3)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入500μL洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(5)一个对核酸分子洗脱的步骤：将步骤(4)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后吸去液体，加入200μL洗脱液，将离心管从磁力架上取下，充分震荡混匀3分钟；
(6)一个对提纯后核酸溶液收集的步骤：将步骤(5)中的离心管放置于磁力架上静置1分钟，待磁性纳米颗粒完全吸附后，将提取完成的核酸溶液转移到新的离心管中。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210824 |
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