CN104209087B - 一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法，所述纳米磁性材料的化学结构表示为Fe₃O₄SiO₂-AEAPS，所述纳米磁性材料是兼具靶向运输、单分散和特异结合能力的核壳型多功能磁性纳米材料，在进行现场传染病疫情诊断时能够快速、高效地富集病原微生物，进一步地，可用于对所获得的病原进行核酸提取，本发明所述材料是纳米技术、分子生物学技术和生物医学技术结合的高科技产品。

Description

一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米生物医学材料领域，涉及一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法。

背景技术

通常传染病病原的介质为土壤、血液、尿液等混合体系，需要经过不断的离心、萃取、稀释等冗繁的前处理步骤才能使采集来的样本用于后续生物学检测，这个过程耗费的时间，大大地制约了病原体快速检测技术的发展，使得在众多的生物快检手段中，样品的前期处理成为决定检测效率与鉴定结果的关键。近年兴起的免疫磁分离技术，利用抗体或基因探针修饰的磁性材料识别目标物，在外加磁场作用下将目标病原从复杂的样本介质中富集分离出来，大大提高了前处理的效率。

一般地，目标病原被分离富集出来后，经过简单的处理，待测病原被释放出来，最先开展的也是最基础的分子生物学技术便是病原DNA提取技术，而提取出来的DNA，其一级结构的完整性，直接决定了接下来开展的一系列基因工程研究的成败。传统的DNA提取技术如异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、碱抽提法、溴化十六烷基三甲铵抽提法等等，操作步骤复杂、耗时长、易交叉污染，残留在DNA溶液中的有机物质对DNA聚合酶有抑制作用，另外，酚、氯仿等有机试剂易造成环境污染，有损操作者健康，基于以上不足，传统的DNA提取技术在应用上受到了极大的限制。近年来兴起的磁珠法核酸提取技术，不需要任何有毒溶剂，不需要反复离心，仅仅是以核酸结合磁珠为基础，便能达到提取基因组DNA的目的。

然而目前常用的磁珠法核酸提取技术采用的是磁珠，大都为多分散磁珠，由于存在不均一的尺寸和形状，因此在液体环境中多分散磁珠的分散能力较差，这一劣势使得它们的沉降时间延长，与溶液作用不充分，从而导致磁珠使用效率的降低。

针对目前传染病病原现场检测中存在的样本前处理要求较高、传统的多分散磁珠核酸提取方法应用受限、市售的磁珠大都为多分散磁珠等诸多问题，本发明欲通过纳米技术、分子生物学技术和生物医学技术结合的高科技产品，提供能够应用于免疫磁分离和核酸提取的单分散纳米磁珠。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠，化学结构表示为Fe₃O₄SiO₂-AEAPS。

一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：

（1）溶剂热法制备单分散的四氧化三铁纳米球；

（2）采用改进的St?ber法，在四氧化三铁纳米球外包覆二氧化硅，得到单分散的Fe₃O₄SiO₂纳米球，具体为：称取0.1g步骤（1）制备得到的四氧化三铁纳米球，向其中依次加入20ml去离子水、80ml无水乙醇和1ml质量分数为28%的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯，室温（20°C）下机械搅拌6小时；反应完毕后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄SiO₂纳米球），将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；

（3）使用硅烷偶联剂氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷对步骤（2）获得的Fe3O₄SiO₂进行硅烷化处理，得到Fe₃O₄SiO₂-AEAPS；具体为：称取0.1g步骤（2）得到的Fe₃O₄SiO₂纳米球，加入到20ml二甲基甲酰胺中，超声分散后得到溶液A；将10ml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均匀后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值维持在3.9~4.1，60°C下机械搅拌3小时，得到溶液B；将溶液A、B混合后加入20ml去离子水，在60°C下继续机械搅拌5小时后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄SiO₂-AEAPS）。

一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠的应用，该应用为将所述单分散纳米磁珠用于病原微生物免疫磁分离及现场传染病诊断进行核酸提取。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开的用于免疫磁分离和核酸提取的单分散纳米磁性材料，具有单分散性、超顺磁性和特异亲和性，具体而言，本发明的磁性微粒的具有较均一的尺寸及形状，比表面积大，便于高效地与目标产物偶联；单分散磁珠在自制的缓冲液中沉降速度慢，便于磁珠与核酸充分接触，增大提取效率；纳米四氧化三铁具有超顺磁性，在外加磁场的作用下分离十分简单，使其非常便于分离；外层的纳米二氧化硅具有无毒性，良好的水溶性、良好的生物相容性，经硅烷化修饰后其表面富含大量功能基团，便于偶联生物分子，尤其是在一定条件下对核酸具有特异亲和能力，当外界条件发生改变时，纳米磁珠又可释放吸附在其表面的核酸，提取出来的核酸片段大、纯度高、质量稳定可靠，本发明所述纳米磁珠制备步骤简单、方法绿色环保、***格低廉，适合大规模生产。

附图说明

图1用于免疫磁分离和核酸提取的单分散纳米磁珠结构表征图；

图2用于免疫磁分离的单分散纳米磁珠分离病原样品的实时荧光定量PCR结果图；

图3用于核酸提取的单分散纳米磁珠提取病原样品DNA的实时荧光定量PCR结果图。

具体实施方式

单分散纳米磁珠具有较均一的尺寸及形状、在一定介质中具有良好的分散能力、具有较大的比表面积，可以有效缩短磁材料的沉降时间，以上优势正是使用磁珠法进行核酸提取工作所需要的。

基于以上原理，本发明提供一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠，该单分散纳米磁珠的化学结构表示为Fe₃O₄SiO₂-AEAPS。

实施例1，单分散纳米磁珠的制备。

（1）采用溶剂热法制备单分散的四氧化三铁纳米球，具体制备过程如下：分别称取2.0g醋酸钠和0.25g三氯化铁六水合物，加入到50ml乙二醇溶液中，磁力搅拌1小时后将体系转移到反应釜中，100°C下反应10小时。反应完毕后，将所得黑色溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄），将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；单分散的四氧化三铁纳米球扫描电镜表征结果如图1a所示，由图可看出所制备的磁性纳米材料为纳米球结构，表面粗糙（由小粒子堆积而成），具有纳米单分散性，有利于材料在溶液中均匀分散，粒径在300nm左右，没有发现团聚现象，这也证明了制备的磁性纳米球具有超顺磁性，即很好的磁分离能力；

（2）采用改进的St?ber法制备单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球，具体制备过程如下：称取0.1g步骤（1）制备得到的四氧化三铁纳米球，向其中依次加入20ml去离子水、80ml无水乙醇和1ml质量分数为28%的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯，室温下机械搅拌6小时。反应完毕后，将所得黑色溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄SiO₂），将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球扫描电镜表征结果如图1b所示，由图可看出硅基质层均匀地包覆在磁性纳米球的表面，形成核壳结构的复合材料，表面光滑，分散性很好，粒径在320nm左右，说明包覆的硅基质层壳层约为20nm左右；使用硅烷偶联剂氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷对二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球进行硅烷化处理后材料形貌未发生变化。

（3）称取0.1g步骤（2）得到的Fe₃O₄SiO₂纳米球，加入到20ml二甲基甲酰胺中，超声分散后得到溶液A；将10ml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均匀后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值维持在3.9~4.1，60°C下机械搅拌3小时，得到溶液B；将溶液A、B混合后加入20ml去离子水，在60°C下继续机械搅拌5小时后，将所得黑色溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球（Fe₃O₄SiO₂-AEAPS），将所得产物在60°C烘箱中干燥。

实施例2，将实施例1制备得到的单分散纳米磁珠应用于病原微生物免疫磁分离，包括以下步骤：

（1）配制模拟病原样本溶液、复杂介质稀释液。

模拟病原样本溶液：将20ul肠道病毒EV71（10MOI）加入到20mlPBS缓冲液中，混合均匀；

复杂介质稀释液：在生物安全柜中取正常人粪便样本（固体如豌豆大小），溶于20mlPBS缓冲液中，用涡旋振荡器剧烈震荡使混合均匀；

（2）用抗体包覆Fe₃O₄SiO₂-AEAPS单分散纳米磁珠：取40μl(100μg/ml)EV71结构蛋白VP1的单克隆抗体与0.1g单分散纳米磁珠在室温下过夜孵育，为了消除磁珠表面对EV71的非特异性吸附，将孵育好的磁珠与BSA（牛血清白蛋白）在4°环境下过夜孵育；Fe₃O₄SiO₂-AEAPS单分散纳米磁珠经抗体包覆后，可以特异识别目标病原微生物。

（3）取100ml小烧杯，将步骤（1）制备的两种溶液混合后与步骤（2）制备的抗体包覆Fe₃O₄SiO₂-AEAPS单分散纳米磁珠混合均匀，在室温下共同孵育0.5小时，使复杂介质稀释液中病原与磁珠表面抗病原的单克隆抗体充分结合，而后在磁场作用下将烧杯中的磁珠全部分离出来，至此完成一个从复杂介质中分离富集病原微生物样品的免疫磁分离过程。将结合有抗原的Fe₃O₄SiO₂-AEAPS单分散纳米磁珠转移至100ml酸性缓冲液中，释放表面抗原，最后通过商品化的核酸提取（DNA/RNA）试剂盒提取病原核酸来考察免疫磁分离效果。

实施例3，单分散纳米磁珠应用于病原微生物免疫磁分离的实时荧光定量PCR结果如图2所示，纳米磁珠经特异性抗体修饰后可与目标抗原特异性结合，经富集分离后获得的抗原抗体免疫复合物，可用荧光定量PCR检测。为了尽可能的避免误差，我们做了三个平行样本和一个阴性对照，由图可知，曲线4为阴性对照，其CT值为26.62，曲线1、2、3为三个平行样本，其CT值分别为14.21、14.64、15.02，说明通过免疫磁分离捕获到的抗原浓度较高，分离效果理想。

实施例3，将实施例1制备得到的单分散纳米磁珠可应用于现场传染病诊断进行核酸提取。

具体实施步骤如下：

（1）取新鲜志贺菌培养液1mL置于1.5mLEP管中，12000rpm1min离心，收集菌体，加入200μL菌体重悬液，抽打混匀或振荡混匀，使菌体重悬；

（2）向步骤（1）EP管中加入220μL裂解液，56°C水浴，孵育10min；

（3）向步骤（2）孵育后的EP管中加入200μL核酸沉淀液，抽打混匀或振荡混匀，室温静置3min；

（4）向步骤（3）静置后的EP管中加入30ul磁珠悬浮液（10mg单分散纳米磁珠超声分散在1ml超纯水中），抽打混匀，将步骤（3）静置后的EP管置于磁力架上，静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体；

（5）将步骤（4）EP管从磁力架上取下，加入500μL洗涤液1，抽打混匀或振荡混匀后将EP管置于磁力架上，静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体，再将EP管从磁力架上取下，加入1000μL洗涤液2，抽打混匀或振荡混匀后将EP管置于磁力架上，静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体，室温静置10min；

（6）将步骤（5）EP管从磁力架上取下，加入50μL洗脱液，抽打混匀或振荡混匀后将EP管置于56°C水浴，孵育5min，取出后将EP管置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集管中，置于-20°C保存备用。

单分散纳米磁珠可应用于现场传染病诊断进行核酸提取的实时荧光定量PCR结果如图3所示。为了尽可能的避免误差，我们做了三个平行样本和一个阴性对照，由图可知，曲线4为阴性对照，其CT值为26.28，曲线1、2、3为三个平行样本，其CT值分别为6.22、6.72、6.92，样本CT值越小说明模板DNA浓度越大，这样小的CT值是多分散磁珠很难达到的。RT-PCR结果表明：第一用于核酸提取的单分散纳米磁珠提取效率非常高，第二提取出来的样本DNA纯度高，对荧光定量不存在抑制。

Claims (2)

1.一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠的制备方法，所述单分散纳米磁珠的化学结构表示为Fe₃O₄SiO₂-AEAPS，所述样本快速前处理为病原微生物免疫磁分离或传染病诊断进行核酸提取；其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）溶剂热法制备单分散的四氧化三铁纳米球；

（2）采用改进的St?ber法，在四氧化三铁纳米球外包覆二氧化硅，得到单分散的Fe₃O₄SiO₂纳米球，具体为：称取0.1g步骤（1）制备得到的四氧化三铁纳米球，向其中依次加入20mL去离子水、80mL无水乙醇和1mL质量分数为28%的氨水，超声混合均匀后向混合液中加入1mL正硅酸乙酯，室温下机械搅拌6小时；反应完毕后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球，将所得产物在60°C烘箱中干燥待用；

（3）使用硅烷偶联剂氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷对步骤（2）获得的Fe₃O₄SiO₂进行硅烷化处理，得到Fe₃O₄SiO₂-AEAPS；具体为：称取0.1g步骤（2）得到的Fe₃O₄SiO₂纳米球，加入到20mL二甲基甲酰胺中，超声分散后得到溶液A；将10mL的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20mL的二甲基甲酰胺混合均匀后，加入丁二酸酐调节混合溶液pH值至3.9~4.1，60°C下机械搅拌3小时，得到溶液B；将溶液A、B混合后加入20mL去离子水，在60°C下继续机械搅拌5小时后，将所得溶液离心，并依次用去离子水和乙醇清洗3次，制得单分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三铁纳米球。

2.一种权利要求1所述方法制备的单分散纳米磁珠的应用，其特征在于，该应用为将所述单分散纳米磁珠用于病原微生物免疫磁分离及现场传染病诊断进行核酸提取。