CN113278545B - 一株链霉菌突变菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株链霉菌突变菌及应用。一株链霉菌突变菌，命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，株号891‑B6，保藏号为CGMCC No.21775。突变菌株891‑B6是以链霉菌891为原始菌株经过紫外诱变，通过形态筛选获得。本发明所述的突变菌株891‑B6发酵产物中金黄霉素A的含量比原始菌株发酵产物中金黄霉素A的含量高17.44％，本发明提供的突变菌株891‑B6生产的金黄霉素中活性成分金黄霉素A含量高，非活性成分金黄霉素B的含量显著降低，非活性成分金黄霉素C的含量稳定不变。同时本发明提供的突变菌株891‑B6遗传稳定性好，传至三代产金黄霉素A水平与第一代相当；能够应用于金黄霉素的工业化生产中。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一株链霉菌突变菌及应用。
背景技术
金黄霉素(chrysomycin)是一类具有苯并萘吡喃酮结构的苷类化合物，最早于1955年从链霉菌A-419株中发现，后来又从其他几株链霉菌中分离得到。生物实验表明，这些化合物具有显著的抗噬菌体、抗菌和抗肿瘤活性。
近年来，研究表明，金黄霉素A(结构式如式Ⅰ所示)对包括结核分枝杆菌在内的耐药病原体有较强的抑制作用而前期药理研究表明，金黄霉素A对耐药G+菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有显著的抗菌作用。因此，该先导化合物有很大潜力开发为治疗耐药病原体引起的感染性疾病的新型治疗药物。因此，作为药物先导物之一的金黄霉素A在制药工业中具有很大的应用潜力，越来越多的化学家、生物学家和药理学家等研究工作者开始关注金黄霉素类物质。但是在金黄霉素产生菌的发酵过程中存在效价低、组分多等问题为后期规模化制备造成了昂贵的成本和分离的难度。
公开号为CN112574185A的发明公开了一种金黄霉素A的规模化分离纯化方法。所述分离纯化方法是将金黄霉素发酵液板框过滤后烘干得到干菌渣，粉碎后用有机溶剂超声提取，提取液浓干后加入溶剂清洗水溶性杂质，再加入二氯甲烷萃取，二氯甲烷萃取液脱色后抽滤，滤液浓干得金黄霉素A粗品，将其加入溶剂溶解后上制备色谱分离得到金黄霉素A纯品。所述方法操作简单，有机溶剂用量很少，避免了因使用大孔树脂、硅胶或有机溶剂结晶而产生大量废水和有机溶剂，且最终金黄霉素A的收率达到95％以上，获得的金黄霉素A纯品中金黄霉素A的含量在96％以上，纯度在98％以上，更适合规模化生产，成本低，效益高。
该现有技术中使用链霉菌891发酵产金黄霉素，但是产生的金黄霉素是含有A、B、C三个组分的混合物，其对金黄色葡萄球菌起抑制作用的是金黄霉素A，因此要提高金黄霉素对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，必须提高金黄霉素A的含量。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题，如原始菌株组分多，后期分离成本高，金黄霉素A产量低等问题，提供一株链霉菌突变菌株及其应用，所述突变菌株能够生产发酵生产金黄霉素，且金黄霉素A含量高。
一株链霉菌突变菌，命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，株号891-B6，于2021年1月25日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21775。
本发明链霉菌突变菌株是由本实验室从中国南海红树林沉积物分离得到的链霉菌891为原始菌株经紫外线照射诱变筛选得到。
本发明又提供了所述的链霉菌突变菌在生产金黄霉素中的应用。
本发明还提供了一种生产金黄霉素的方法，使用所述链霉菌突变菌进行发酵培养，再经过纯化获得金黄霉素。
优选的，发酵培养过程包括以下步骤：
步骤1，将所述链霉菌突变菌接入ISP2琼脂培养基活化6～7d，然后接种到ISP2液体培养基种子培养后获得种子液；
步骤2，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。
优选的，步骤1中所述ISP2琼脂培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，20.0g/L琼脂粉，pH为7，121℃灭菌20min；
ISP2液体培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，pH为7.0，121℃灭菌20min。
优选的，步骤1种子培养的温度为28℃，种子培养的转速为200rpm，种子培养的时间为48～72h。
优选的，步骤2中种子液的接种量按体积比计为5～10％。
优选的，步骤2中所述的发酵培养基的组成为：5.0g/L淀粉，20.0g/L葡萄糖，10.0g/L大豆粉，2.0g/L碳酸钙，pH为7.0，121℃灭菌20min。
优选的，步骤2中所述的培养的温度为28℃，所述培养的转速为200rpm，所述培养的时间为168～192h。
本发明的有益效果：本发明提供了一株生产金黄霉素的链霉菌突变菌株891-B6，保藏编号为CGMCC No.21775；所述突变菌株891-B6是以链霉菌891为原始菌株经过紫外诱变，通过形态筛选获得。本发明所述的突变菌株891-B6发酵产物中金黄霉素A的含量比原始菌株发酵产物中金黄霉素A的含量高17.44％，本发明提供的突变菌株891-B6生产的金黄霉素中活性成分金黄霉素A含量高，非活性成分金黄霉素B的含量显著降低，非活性成分金黄霉素C的含量稳定不变。同时本发明提供的突变菌株891-B6遗传稳定性好，传至三代产金黄霉素A水平与第一代相当；能够应用于金黄霉素的工业化生产中。
附图说明
图1为紫外线照射时间对菌株的致死率关系曲线。
图2为原始菌株与突变菌株形态差异图。
图3为原始菌株链霉菌891发酵产物HPLC分析图谱。
图4为金黄霉素A高产菌株(链霉菌891-B6)发酵产物HPLC分析图谱。
具体实施方式
实施例1
本发明链霉菌突变菌株是由本实验室从中国南海红树林沉积物分离得到的链霉菌891为原始菌株，经紫外线照射诱变得到，诱变方法包括以下步骤：
步骤1，将原始链霉菌891接种于ISP2琼脂培养基28℃恒温培养；
步骤2，挑选步骤1培养好的孢子，加入生理盐水，用接种环刮下孢子，并用血球计数板调整孢子悬浮液的浓度为106/mL；
步骤3，将步骤2制备的孢子悬浮液经紫外分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、300s后稀释涂布于ISP2琼脂培养基中，暗处培养6～7d，根据分离平板单菌落生长情况，以空白为对照，计算紫外线不同照射时间对菌株的致死率。
步骤4，将步骤3中紫外照射不同时间后的菌株进行在28℃，200rpm条件下恒温振荡培养168-192h，计算在不同紫外照射时间下的正突变率。
步骤5，将步骤3中诱变后的菌株根据大小、形态差异等挑出有区别于原始菌株的菌落进行摇瓶发酵；
步骤6，将步骤5中挑选出的单菌落接种到发酵培养基中，并在28℃，200rpm条件下恒温振荡培养168-192h；
步骤6，对收集步骤6菌体，菌体经适量甲醇提取后进行HPLC分析检测，并与原始菌株比较，筛选高产金黄霉素A突变菌株。
步骤7，选取步骤6高产金黄霉素A突变菌株进行三代培养发酵，再进行HPLC分析，筛选稳定高产金黄霉素A突变菌株。
步骤1，3所述的ISP2琼脂培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，20.0g/L琼脂粉，pH为7，121℃灭菌20min。
步骤3所述致死率计算公式为：
存活率＝(诱变后存活的菌落数/诱变前存活的菌落数)*100％
致死率＝1-存活率
步骤4所述的正突变率计算公式为：
正突变率＝(诱变后正突变菌株数/诱变后全部菌株数)*100％
紫外线照射时间对菌株致死率以及菌株正突变关系曲线如图1所示。
步骤3所述紫外照射条件为紫外灯功率16～20W，照射距离约15cm，选取正突变率最高的120s作为照射时长。
步骤5所述的发酵培养基的组成为：5.0g/L淀粉，20.0g/L葡萄糖，10.0g/L大豆粉，2.0g/L碳酸钙，pH为7.0，121℃灭菌20min。
发酵产物金黄霉素A分析：
用HPLC(高效液相色谱)检测发酵产物中金黄霉素组分变化，通过峰形的增减与相对峰面积变化筛选与原始菌株891次级代谢组分有差异的菌株。
样品处理：取10mL发酵液4000rpm离心10min，摒弃上清液，沉淀加入40mL甲醇超声提取20min，离心10min，取上清液100μL进行HPLC分析。
HPLC条件：色谱柱采用Phenomenex(Luna,250×4.6mm)C18色谱柱。HPLC流动相为50％乙腈水溶液，检测波长为254nm，进样体积20μL。
结果筛选到一株生产金黄霉素的中国南海红树林沉积物来源链霉菌突变菌株，分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，株号891-B6，于2021年1月25日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21775。
图2为原始菌株与突变菌株的形态图，将原始菌株和突变菌株分别划线于ISP2琼脂培养基中，可以观察到原始菌株菌体呈白色，气生菌丝丰富，孢子生长旺盛：突变菌株菌体呈黄绿色，气生菌丝丰富，孢子生长旺盛。
图3为原始菌株链霉菌891发酵产物HPLC分析图谱。图4为筛选出的金黄霉素A高产菌株(链霉菌891-B6)发酵产物HPLC分析图谱。图4跟图3比较，其它组分所占比例减小，可见筛选出的菌株次级代谢产物发生了变化。
采用外标法进行金黄霉素A定量分析，金黄霉素A高产菌株(链霉菌891-B6)发酵产物中金黄霉素A占主要成分，部分其它组分降低到比较低的水平。检测结果为，对照品的金黄霉素A占总组分含量为62％(438±12.37mg/L)，而诱变后的菌株金黄霉素A占总组分的79.52％(486.20±15.68mg/L)，诱变菌株891-B1发酵生产的金黄霉素A组分含量明显增高。
实施例2
对突变菌株891-B6生产金黄霉素稳定性分析，包括以下步骤：
步骤1，将所述突变菌株891-B6接入ISP2琼脂培养基活化、种子培养后获得种子液；
步骤2，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。
步骤1中所述ISP2琼脂培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，20.0g/L琼脂粉，pH为7.0，121℃灭菌20min。
步骤1所述种子培养的温度为28℃，所述种子培养的转速为200rpm，所述种子培养的时间为48～72h。
步骤2中所述种子液的接种量为5％～10％(V/V)。
步骤2中所述的发酵培养基的组成为：5.0g/L淀粉，20.0g/L葡萄糖，10.0g/L大豆粉，2.0g/L碳酸钙，pH为7，121℃灭菌20min。
步骤2所述发酵培养的温度为28℃，所述发酵培养的转速为200rpm，所述发酵培养的时间为168～192h。
样品处理：取10mL发酵液4000rpm离心10min，摒弃上清液，沉淀加入40mL甲醇超声提取20min，离心10min，取上清液100μL进行HPLC分析，对三代891-B6的发酵产物进行分析，891-B6产金黄霉素稳定性结果见表1。
表1：891-B6菌株金黄霉素A含量情况
| 菌种编号 | 金黄霉素A(％) |
| 891-B6 | 79.52 |
| 891 | 62.08 |
由表1数据显示，891原始菌株生产的发酵产物中金黄霉素A含量平均为62.08％，891-B6菌株生产的发酵液中金黄霉素A含量平均为79.52％，891-B6菌株的金黄霉素A含量比891原始菌株提高了17.44％，且由表1可知突变菌株891-B6遗传稳定。
由上述实施例可知，本发明提供的突变菌株891-B6生产的金黄霉素中活性成分金黄霉素A含量高，非活性成分金黄霉素B的含量显著降低，非活性成分金黄霉素C的含量稳定不变，能够应用于金黄霉素的工业化生产中。
Claims (9)
1.一株链霉菌突变菌，命名为链霉菌(Streptomyces sp.)，株号891-B6，保藏号为CGMCC No.21775。
2.如权利要求1所述的链霉菌突变菌在生产金黄霉素中的应用。
3.一种生产金黄霉素的方法，其特征在于，使用权利要求1所述链霉菌突变菌进行发酵培养，再经过纯化获得金黄霉素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养过程包括以下步骤：
步骤1，将所述链霉菌突变菌接入ISP2琼脂培养基活化6～7d，然后接种到ISP2液体培养基种子培养后获得种子液；
步骤2，将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中所述ISP2琼脂培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，20.0g/L琼脂粉，pH为7，121℃灭菌20min；
ISP2液体培养基的组成为：4.0g/L葡萄糖，4.0g/L酵母提取物，10.0g/L麦芽提取物，pH为7.0，121℃灭菌20min。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1种子培养的温度为28℃，种子培养的转速为200rpm，种子培养的时间为48～72h。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中种子液的接种量按体积比计为5～10％。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的发酵培养基的组成为：5.0g/L淀粉，20.0g/L葡萄糖，10.0g/L大豆粉，2.0g/L碳酸钙，pH为7.0，121℃灭菌20min。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的培养的温度为28℃，所述培养的转速为200rpm，所述培养的时间为168～192h。
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