CN113267390B - 一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物试剂的技术领域，具体公开了一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用。一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液包括缓冲体系、内源性碱性磷酸酶抑制剂和非离子型表面活性剂。本申请的洗脱液可用于新生儿疾病筛查试剂，进一步的，可用于洗脱采集有新生儿足跟血的Whatman 903滤纸片上的筛查检测标志物，其具有高洗脱效率、高广谱性和高兼容性的优点。

Description

一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用

技术领域

本申请涉及生物试剂的技术领域，更具体地说，它涉及一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用。

背景技术

新生儿筛查是指用快速、敏感的实验室方法对新生儿的先天性内分泌异常、遗传代谢病以及某些危害严重的遗传性疾病进行筛查，以期对患病新生儿进行早期诊断、早期治疗，防止其机体组织器官发生不可逆的损伤，从而避免新生儿出现精神发育不可逆损害、智力低下、言语障碍甚至死亡的情况。目前我国新生儿筛查的基本项目包括甲状腺功能低下症和苯丙酮尿症，对应检测的标志物为促甲状腺激素(TSH)和苯丙酮。

随着新生儿疾病筛查技术的发展，目前可进行筛查的病种也越来越多，部分地区相继开展了葡萄糖磷酸脱氢酶缺乏症(检测标志物为G-6-PD酶，即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、先天性肾上腺皮质增生症(检测标志物为17-α羟基孕酮)、半乳糖血症(检测标志物为半乳糖)、氨基酸代谢病(检测标志物为酪氨酸)和假肥大型肌营养不良(包括杜氏肌营养不良DMD和贝克肌营养不良BMD，检测标志物均为CKMM，即肌酸激酶同工酶)等疾病的筛查工作。上述检测标志物均可通过进行血液样本采集获得，然后通过使用现有的化学发光、时间分辨荧光、酶联免疫、放免以及液相质谱法等多种用于新生儿疾病筛查的方法，对采集得到的血液样本中存在的检测标志物分别进行检测，即可得到新生儿疾病筛查的结果。

但是，新生儿或低龄儿并不适合采用静脉采血的方式进行检测样本取样，因此目前通常使用滤血片对新生儿或低龄儿进行采血。滤血片是一种非常有效的血样采集方式，并且具备良好的稳定性。通常新生儿疾病筛查都是采集足跟血第二滴血，将血液样本滴到Whatman 903滤纸上并在室温干燥后进行保存和运输。在对滤血片上的标志物进行检测前，需要先使用特定的洗脱剂将标志物溶解，并从滤血片上洗脱下来，最后才进行相关分析。

其中，TSH、G-6-PD酶和CKMM等蛋白质类的检测标志物对有机溶剂、强酸和强碱比较敏感，在洗脱过程中容易发生变性和失活的情况，而苯丙酮、17-α羟基孕酮、半乳糖和酪氨酸等有机小分子类的检测标志物具有较强的疏水性，往往需要有机溶剂的参与以帮助其溶解。因此，当需要对同一滤血片样本上的含有的蛋白质类检测标志物和有机小分子类检测标志物进行洗脱时，往往需要将滤血片样本分为多份后，对每一份滤血片样本采用对应的洗脱剂进行洗脱以得到对应的检测标志物。显然，这种操作不仅繁琐复杂，严重降低了检测效率，且容易污染滤血片，导致检测准确度下降。此外，若滤血片上的血斑数量不足，采用该方法显然无法满足检测所有标志物的需求，从而导致检测失败。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提供一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液及其应用，其具有高广谱性、高兼容性和高洗脱效率的优点，能同时高效地洗脱蛋白质类检测标志物和有机小分子类检测标志物，并能兼容多种标志物检测方法。

第一方面，本申请提供一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液，采用如下的技术方案：

一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液，包含缓冲体系、内源性碱性磷酸酶抑制剂和高分子非离子型表面活性剂。

缓冲体系一方面作为特异性阻断剂和洗脱剂的溶剂，另一方面用于维持溶液体系的pH平衡和盐平衡，防止溶液体系内的蛋白质发生变性、失活。缓冲体系可以是PBS、PB和Tris-HCl溶液等在生物化学领域中常用的缓冲溶液，但凡具有缓冲溶液体系pH平衡或盐平衡功能的溶液，应视为落入本发明所申请的保护范围内。

高分子非离子型表面活性剂同时具有亲水基团和疏水基团，从而具有良好的增溶效果。当使用高分子非离子型表面活性剂作为洗脱剂时，其可同时提高滤血片上亲水性的蛋白质和疏水性的有机小分子的溶出率，从而获得较高含量的蛋白质类检测标志物和有机小分子类检测标志物。同时，高分子非离子型表面活性剂具有较小的刺激性，能降低对蛋白质活性的损伤。高分子非离子型表面活性剂可以是聚氧乙烯型表面活性剂，当然也可以是聚醚型表面活性剂，但凡具有表面活性作用的高分子物质应视为落入本发明所申请的保护范围内。

当采用上述技术方案对滤血片进行洗脱时，高分子非离子型表面活性剂能将滤血片上存在的蛋白质类检测标志物和蛋白质类非标志物同时进行洗脱，因此滤血片上含有的内源性碱性磷酸酶也常常被洗脱进入洗脱液中。当使用碱性磷酸酶-化学发光试剂对从滤血片上洗脱得到的检测标志物进行检测时，内源性碱性磷酸酶会对检测结果产生干扰，如造成假阳性等现象，导致检测精度下降。本申请公开添加的内源性碱性磷酸酶抑制剂可抑制滤血片中含有的血清碱性磷酸酶(即ALP)同工酶的活性，从而降低ALP同工酶对检测结果的干扰，提高检测精度，使得本申请公开的技术方案能适用于碱性磷酸酶-化学发光试剂法。内源性碱性磷酸酶抑制剂可以是正钒酸钠，也可以是左旋咪唑等，但凡具有抑制内源性碱性磷酸酶活性的物质，应视为落入本发明所申请的保护范围内。

优选的，所述内源性碱性磷酸酶抑制剂为左旋咪唑，其工作浓度为0.01mM-5mM；所述高分子非离子型表面活性剂为Pluronic F68，其在洗脱液中的质量分数为0.01％-5％。

左旋咪唑是一种无金属离子去除能力的内源性碱性磷酸酶抑制剂，可以抑制除来源于肠和胎盘外所有的ALP同工酶。由于金属离子对碱性磷酸酶的活性具有重要作用，如果采用如乙二胺四乙酸二钠等具有金属离子去除能力的特异性阻断剂，将极大降低后续采用碱性磷酸酶-化学发光试剂法进行标志物检测的灵敏度与精度。因此相比于选用其他具有去除金属离子能力的内源性碱性磷酸酶抑制剂，选用左旋咪唑能使得洗脱液对后续的检测方法具有更高的兼容性。

Pluronic F68是一种聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，是一类新型的高分子非离子型表面活性剂。在药剂学中，Pluronic F68常用作乳膏或乳悬液用的乳化剂和稳定剂，也用作部分药物的增溶剂，或是用作缓释制剂的粘合剂或衣材；而在细胞培养应用中，Pluronic F68常用作细胞膜的稳定制剂，用以防止细胞膜剪切。在使用Pluronic F68作为洗脱剂时，发明人意外地发现Pluronic F68还能减少滤血片上的红细胞在洗脱过程中的脱落，从而减少洗脱液中含有的干扰物质的量，提高检测精度。特别的一点是，Pluronic F68的HLB值非常低，其具有消泡的作用，因此使用Pluronic F68进行洗脱能减少洗脱液中泡沫的形成，从而降低泡沫对蛋白的活性造成损伤的风险。

优选的，左旋咪唑的工作浓度为0.05mM-2mM，Pluronic F68在洗脱液中的质量分数为0.1％-2％。

更优选的，左旋咪唑的工作浓度为2mM，Pluronic F68在洗脱液中的质量分数为1％。

该比例为发明人通过多次平行实验与对比实验后得到的较佳比例，其洗脱效率能达到95％以上。

优选的，还包含可增加疏水性物质溶解度的辅助洗脱剂。

通过采用上述技术方案，有机小分子类检测标志物的溶出率得到了提高，从而提高了使用本申请洗脱液进行洗脱的洗脱效率。辅助洗脱剂可以是甲醇、乙醇等可与水互溶的有机溶剂，也可以是***、丙醚等微溶于水的有机溶剂，但凡能溶于水并具有可溶解疏水性物质的有机溶剂，均应视为落入本发明所申请的保护范围内。

优选的，所述辅助洗脱剂为甲醇，其在洗脱液中的质量分数为1％-20％。

甲醇是一种能与水互溶的有机溶剂，其有助于滤血片上的有机小分子物质的溶解，从而提高洗脱效率。特别的，发明人意外地发现甲醇对于检测标志物17-α羟基孕酮具有较高的溶解度，当使用甲醇作为辅助洗脱剂时，能显著提高17-α羟基孕酮的溶出率，从而提高后续检测方法对17-α羟基孕酮进行检测时的灵敏度。

优选的，甲醇在洗脱液中的质量分数为5％-10％。

更优选的，甲醇在洗脱液中的质量分数为10％。

甲醇具有一定的蛋白质毒性，若甲醇的添加量过多容易使得蛋白质发生变形、失活，而添加量过少则难以提高有机小分子检测标志物的溶出率。因此发明人在经过多次的平行实验与对比实验后，得到了甲醇较佳的添加量。

优选的，还包含具有抗氧化作用的保护剂和防腐剂。

更优选的，所述保护剂为亚硫酸钠，其在洗脱液中的质量分数为0.01％-2％；所述防腐剂为Procline 300，其在洗脱液中的体积分数为0.01％-0.1％。

更优选的，亚硫酸钠在洗脱液中的质量分数为0.2％，Procline 300在洗脱液中的体积分数为0.05％。

具有抗氧化作用的保护剂能有效减少待检标志物因氧化而产生变性、失活等情况的发生。而亚硫酸钠在中性和弱碱性的洗脱液中比较稳定，且其对有机小分子和蛋白质不敏感，不易破坏待测标志物的空间结构。防腐剂能根除洗脱液中存在的微生物，从而延长产品的储存时间。其中，Procline 300是一种用于诊断试剂的理想高效的防腐剂，其具有广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性。Procline 300可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，其水溶性也确保了其在本申请公开的洗脱液中的溶解度；同时，Procline300对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，显现出对后续使用的检测方法优越的兼容性。因此亚硫酸钠与Procline 300联用能有效提高本申请公开的洗脱液的兼容性，并延长洗脱液对产品的储存时间。

优选的，所述缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，其工作浓度为20mM-200mM，pH为7.0-9.0。

更优选的，Tris-HCl缓冲液的工作浓度为50mM-100mM。

更优选的，Tris-HCl缓冲液的工作浓度为50mM，pH为8.0。

Tris-HCl缓冲液是一种化学性质非常稳定、成本低的中性偏碱性缓冲溶液，常用于蛋白复性，其能帮助从滤血片中洗脱的蛋白质类检测标志物重新折叠并恢复活性，因此相比于PBS和PB，Tris-HCl缓冲液能更好地保存洗脱蛋白的活性。

第二方面，本申请提供一种上述洗脱液的应用方法，采用如下的技术方案：

一种检测标志物洗脱液的应用方法，应用于新生儿疾病筛查试剂。

优选的，用于洗脱采集有新生儿足跟血的Whatman 903滤纸片上的筛查检测标志物。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用Pluronic F68作为洗脱剂，实现了将蛋白质类检测标志物和有机小分子类检测标志物同时进行洗脱的效果，使得洗脱液对待洗脱的检测标志物的种类显现出了高广谱性。

2、本申请使用左旋咪唑来抑制从滤血片上洗脱下的ALP同工酶的活性，排除了ALP同工酶对碱性磷酸酶-化学发光试剂法检测结果的干扰，使得洗脱液对多种标志物检测方法显现出了高兼容性，尤其适用于碱性磷酸酶-化学发光法和荧光免疫层析法。

3、本申请采用甲醇作为辅助洗脱剂，实现了提高有机小分子类检测标志物溶出率与溶解速率的效果，使得洗脱液对标志物显现出了高洗脱效率的优点，能洗脱大于90％的目标检测标志物。

4、本申请联用Procline 300和亚硫酸钠，在兼顾了洗脱液的高兼容性的同时有效延长了洗脱液保存标志物的时间。

5、本申请采用Tris-HCl缓冲液作为缓冲体系，有效地保存了洗脱下的蛋白质类标志物的活性，从而提高了后续检测的精度。

具体实施方式

提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本发明。

本文中的“PBS”为phosphate buffer saline的缩写，是指磷酸缓冲盐溶液。

本文中的“Tris-HCl缓冲液”是指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液。

本文中的“Tris”是指三羟甲基氨基甲烷，购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的左旋咪唑购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的Procline 300购自sigma公司。

本申请使用的Pluronic F68购自sigma公司。

本申请使用的NP40购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的Dynal beads M270 COOH磁珠购自赛默飞生物科技有限公司。

本文中的“MES”是指2-吗啉乙磺酸，购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的抗CKMM包被抗体购自北京德奥平生物技术有限公司。

本文中的“EDC”是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本文中的“TBST”是指浓度为20mM的Tris，质量分数为0.9％的Nacl和0.1％的TW-20，且pH7.4的溶液。

本申请使用的抗CKMM标记抗体购自北京德奥平生物技术有限公司。

本申请使用的APS-5发光液购自赛默飞生物科技有限公司。

本申请使用的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液是指购自赛默飞生物科技有限公司。

本文中的“NHS”是指N-羟基琥珀酰亚胺，购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的抗CKMM单克隆标记抗体购自北京德奥平生物技术有限公司。

本文中的“BSA”是指牛血清白蛋白，购自北京德奥平生物技术有限公司。

本申请使用的羊抗鼠抗抗体购自北京德奥平生物技术有限公司。

本申请使用的样品吸收垫、玻璃纤维垫和吸水垫均购自上海金标生物科技有限公司。

本申请使用的硝酸纤维素膜购自赛多利斯。

本申请使用的商品化CKMM纯品购自Lee biosolution。

本申请使用的商品化17-α羟基孕酮纯品购自上海阿拉丁化学试剂有限公司。

本申请使用的商品化TSH纯品购自Lee biosolution。

以下结合实施例1-2和对比例1-2对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液,通过以下步骤制得：

取适量去离子水、Tris、左旋咪唑、Procline 300、Pluronic F68和亚硫酸钠，混合后搅拌均匀，并使用盐酸(HCl)调节pH至8.0，得到洗脱液。其中，洗脱液的参数应如下：Tris-HCl的工作浓度：50mM；

左旋咪唑的工作浓度：2mM；

Procline 300的体积分数：0.05％；

Pluronic F68的质量分数：1％；

亚硫酸钠的质量分数：0.2％。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，洗脱液中还混合有甲醇，甲醇的在洗脱液中的质量分数为10％。

对比例

对比例1

一种洗脱液，由1L去离子水、0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g氯化钾混合并充分溶解得到，其pH为7.4.。

对比例2

一种洗脱液，通过以下步骤制得：

取部分对比例1中的洗脱液，加入适量NP40和适量Procline 300，混合搅拌均匀后得到洗脱液，洗脱液中NP40的质量分数为1％，Procline 300的质量分数为0.05％。

性能检测试验

一、磁微粒化学发光法CKMM检测方法的建立

S1、将50mg Dynal beads M270 COOH磁珠稀释在2mL 50mM MES pH6.0缓冲液中，加入1mg抗CKMM包被抗体，混匀后，加入2mg EDC，室温震荡反应2h。

S2、磁吸去除上清，加入TBST室温反应2h。

S3、磁吸去除上清，加入TBST，稀释到0.4mg/mL，得到磁微粒工作液，2-8℃保存待用。

S4、1mg ALP溶解在1mL PBS中，加入0.5mg抗CKMM标记抗体，混合均匀，加入10μl5％的戊二醛液体，室温混匀2h，透析到PBS。用TBST稀释到1μg/mL，得到酶标工作液。

S5、取20μl样本、40ul磁微粒液工作液和50μl酶标工作液进行混合，37℃孵育反应5min，清洗，加入200μl APS-5发光液显色。其中，样本为实施例1-2或对比例1-2中的洗脱液对对应滤血片进行洗脱后得到的含有检测标志物的溶液。

二、荧光免疫层析法CKMM检测方法的建立

S1、活化：取内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于400μL活化缓冲液中(50mmol/L MES pH6.0)，加入0.5mg EDC和0.5mg NHS，混匀后室温震荡活化15min，得到活化微球混悬液。

S2、偶联：将活化微球混悬液于4℃，10000r/min离心10min后弃上清，重悬于活化缓冲液中，加入20μg抗CKMM单克隆标记抗体，混匀后室温震荡偶联120min，得到抗CKMM偶联混悬液。

S3、封闭：将抗CKMM偶联混悬液加入10％的BSA溶液100μl，混匀后室温震荡封闭过夜，得到初级标记液。

S4、贮存：将初级标记液于4℃，10000r/min离心10min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中(0.01％NaN3、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存，得到标记工作液。

S5、将标记工作液以贮存缓冲液稀释至10μg/mL后，用金标点膜喷金仪喷金，喷涂量为3μL/cm，37℃干燥15h，取出密封保存。

S6、用0.05mol/L、pH 7.2的PB缓冲液将抗CKMM包被抗体稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.2μL/cm；用0.05mol/L、pH7.2的PB缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(C)，喷膜量为1.2μL/cm；37℃干燥5h，备用。

S7、将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH 7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h，备用。

S8、将样品吸收垫、玻璃纤维垫、NC膜、吸水垫依次搭接粘贴固定于底板上，样品吸收垫的末端与玻璃纤维垫始端相连，玻璃纤维垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸条。

S9、准确吸取10μL样本加入到190μL PB缓冲液中，充分混匀。用微量移液器准确吸取80μL待检样品溶液于试纸条加样孔中，室温(20～25℃)作用15min；将试纸卡***荧光检测仪的承载器中，通过触摸显示屏选择待检项目，按下“开始检测”按键，荧光检测仪将自动对试纸卡进行扫描测试；通过仪器的显示屏幕上读取或打印检测结果。其中，样本为含不同浓度CKMM滤纸干血片的提取液，样本稀释液为含1％TW20的PBS缓冲液。

S10、测试完成后，仪器获得试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值，基于预先内置的试纸卡上检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值与CKMM浓度的关系曲线，获得待测样品中CKMM的含量，最后经换算即得待测样品中CKMM的含量。

三、滤血片洗脱CKMM效率的评价

选择阴性CKMM全血样本(CKMM浓度＜5ng/mL)，添加商品化CKMM纯品分别配置成以下浓度的样本：20ng/mL、100ng/mL、2000ng/mL。用打孔器制备3mm直径的Whatman 903空白滤纸片，分别滴加5μl上述配置的不同浓度样本，室温干燥24h。将对应的一个干血片加入200μl实施例1-2或对比例1-2中的洗脱液，室温500rpm震荡5min后，同时采用磁微粒化学发光法和荧光免疫层析法进行测定，计算结果按照稀释比例换算成对应的血斑浓度。结果如表1所示。

四、滤纸干血片洗脱促甲状腺素效率的评价

选择阴性促甲状腺素全血样本(TSH浓度＜0.5μIU/mL)，添加商品化TSH纯品分别配置成以下浓度的样本：2μIU/mL、10μIU/mL、30μIU/mL。用打孔器制备3mm直径的Whatman903空白滤纸片，分别滴加5μL上述配置的不同浓度样本，室温干燥24h。将对应的一个干血片加入200μL实施例1-2或对比例1-2中的洗脱液中，室温500rpm震荡5min后，同时采用磁微粒化学发光法和荧光免疫层析法进行测定，计算结果按照稀释比例换算成对应的血斑浓度。结果如表2所示。

五、滤血片洗脱17-α羟基孕酮效率的评价

选择阴性17-α羟基孕酮全血样本(17-α羟基孕酮浓度＜0.2ng/mL)，添加商品化17-α羟基孕酮纯品分别配置成以下浓度的样本：0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。用打孔器制备3mm直径的Whatman 903空白滤纸片，分别滴加5μL上述配置的不同浓度样本，室温干燥24h。将对应的一个干血片加入200μL实施例1-2或对比例1-2中的洗脱液，室温500rpm震荡5min后，同时采用磁微粒化学发光法和荧光免疫层析法进行测定，计算结果按照稀释比例换算成对应的血斑浓度。结果如表3所示。

表1滤血片洗脱CKMM效率的评价

表2滤纸干血片洗脱TSH效率的评价

表3滤血片洗脱17-α羟基孕酮效率的评价

结合实施例1-2和对比例1-2并结合表1-2可以得知，实施例1-2和对比例1-2均能洗脱CKMM和TSH，CKMM和TSH均为蛋白质类检测标志物的其中一种，能洗脱CKMM和TSH说明实施例1-2和对比例1-2同样能将其他种类的蛋白质类检测标志物进行洗脱。然而，对比例1洗脱CKMM和TSH的效率并不高，对比例1对不同浓度的CKMM的洗脱效率为5.5％-26.0％，对不同浓度的TSH的洗脱效率为40.0％-53.3％；对比例2对不同浓度的CKMM的洗脱效率为64.2％-79.4％，对不同浓度的TSH的洗脱效率为70％-90％；而实施例1-2对不同浓度的CKMM的洗脱效率均达到95％以上，对不同浓度的TSH的洗脱效率均达到95％以上，相比于对比例1-2均具有显著的进步。

17-α羟基孕酮为有机小分子检测标志物的其中一种，检测17-α羟基孕酮的洗脱效率可间接预测其他有机小分子检测标志物的洗脱效率。结合实施例1-2和对比例1-2并结合表2可以得知，对比例1几乎无法有效洗脱17-α羟基孕酮，对比例2也仅能洗脱部分17-α羟基孕酮，其洗脱效率不高于24％，因此对比例1和对比例2均无法用于洗脱有机小分子类检测标志物。本申请实施例1和实施例2均能有效洗脱17-α羟基孕酮，说明本申请实施例1和实施例2能有效洗脱有机小分子类检测标志物。特别的，实施例2加入10％(W/V)甲醇后，其洗脱17-α羟基孕酮的效率达到了95％以上，显著优于其他洗脱剂配方。

综上所述，本申请公开的洗脱剂能同时洗脱95％以上的蛋白质类检测标志物和有机小分子类检测标志物，具有高洗脱效率以及高广谱性。同时本申请实施例1和实施例2中的洗脱液可同时使用磁微粒化学发光法和时间分辨荧光免疫层析法进行标志物测定，具有对检测方法的高兼容性。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (3)

1.一种用于滤纸干血片的检测标志物洗脱液，其特征在于，包含缓冲体系、内源性碱性磷酸酶抑制剂、辅助洗脱剂、保护剂、防腐剂和非离子型表面活性剂；

所述缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，其工作浓度为50mM，pH为8.0；

所述内源性碱性磷酸酶抑制剂为左旋咪唑，其工作浓度为2mM；

所述辅助洗脱剂为甲醇，甲醇的在洗脱液中的质量分数为10％；

所述保护剂为亚硫酸钠，所述亚硫酸钠在洗脱液中的质量分数为0.2%；

所述防腐剂为Procline 300，所述Procline 300在洗脱液中的体积分数为0.05%；

所述非离子型表面活性剂为Pluronic F68，所述Pluronic F68在洗脱液中的质量分数为1%。

2.一种应用权利要求1所述洗脱液的方法，其特征在于，应用于新生儿疾病筛查试剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于洗脱采集有新生儿足跟血的Whatman903滤纸片上的筛查检测标志物。