CN110779787B - 一种环孢霉素全血样本的前处理剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环孢霉素全血样本的前处理剂，属于免疫抑制剂治疗药物浓度检测技术领域，所述前处理剂以磷酸盐缓冲液为溶剂，包括：质量体积分数为0.1～1％的脱氧胆酸钠、质量体积分数为1～5％的5‑磺基水杨酸和质量体积分数为0.1～1％的邻甲氧基苯甲酸；所述前处理剂的pH值为6～8。本发明提供的前处理剂无挥发性，对抗体和酶的活性影响小。

Description

一种环孢霉素全血样本的前处理剂及其使用方法

技术领域

本发明属于免疫抑制剂治疗药物浓度检测技术领域，尤其涉及一种环孢霉素全血样本的前处理剂及其使用方法。

背景技术

环孢霉素(cyclosporine，CsA)是一种高效的免疫抑制剂，环孢霉素能够选择性地和可逆性地抑制T-辅助细胞产生生长因子，因而对免疫***显示相对较高的治疗效能。近年来它被越来越多的用于心、肺、肝、肾、胰及骨髓等器官的移植，并明显提高了移植器官的存活率。然而，CsA具有一些值得重视的副作用，如肾毒性、肝毒性以及增加产生淋巴瘤的危险等。此外，肾毒性在大多数病人呈现剂量相关性。由于不同病人的疾病状态、器官移植类型及年龄不同，因此对所给出的剂量在药物的吸收和代谢速率上存在很大的个体差异。

因此为使环孢霉素产生最佳的免疫抑制作用，减小毒副作用，对器官移植后接受环孢霉素治疗的病人进行药物监测及药物动力学研究是很有意义的。

目前，国内外监测环孢霉素药物浓度的方法，主要有微粒子化学发光法(雅培)，均相酶免法(西门子)，电化学发光法(罗氏)，质谱法。人体内，环孢霉素与多种血浆蛋白结合，且有一部分存在与红细胞内，因此，环孢霉素的检测必须采用全血样本。上述的这些检测方法都需要进行样本的前处理。其中质谱法的前处理，往往采用高浓度的有机溶剂，如甲醇，乙腈等，配合高浓度的硫酸锌去沉淀全血蛋白，但是该前处理剂因含有大量有机溶剂和高浓度硫酸锌，会严重损伤抗体和酶的活性，因此不能适用于环孢霉素免疫测定试剂。雅培的微粒子化学发光法采用表面活性剂进行溶血，再甲醇和硫酸锌的混合液沉淀蛋白，再用EDTA中和多余的硫酸锌，均需要多步处理，且处理后不能完全中和的金属离子对抗体和酶依然存在一定的活性损伤。另外，甲醇存在挥发性，对人体有害，且长期使用甲醇的挥发会导致试剂效果下降。因此，市场上急需简单快速，兼容免疫检测试剂的环孢霉素样本前处理剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种环孢霉素全血样本的前处理剂及其使用方法，本发明提供的前处理剂无挥发性，对抗体和酶的活性影响小。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种环孢霉素全血样本的前处理剂，所述前处理剂以磷酸盐缓冲液为溶剂，包括：质量体积分数为0.1～1％的脱氧胆酸钠、质量体积分数为1～5％的5-磺基水杨酸和质量体积分数为0.1～1％的邻甲氧基苯甲酸；

所述前处理剂的pH值为6～8。

优选的，包括质量体积分数为0.3～0.5％的脱氧胆酸钠。

优选的，包括质量体积分数为2～4％的5-磺基水杨酸。

优选的，包括质量体积分数为0.2～0.5％的邻甲氧基苯甲酸。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～1mol/L。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.2～0.5mol/L。

优选的，所述前处理剂的pH值为6.5～7.5。

本发明还提供了上述技术方案所述的前处理剂的使用方法，包括：将所述前处理剂与全血样本混合后，将得到的混合物离心，得到的清液为环孢霉素提取清液。

优选的，所述全血样本与前处理剂的体积比为1:0.5～2。

优选的，所述离心的条件包括：所述离心的离心力为9000～11000g，所述离心的时间为5～10min。

本发明提供了一种环孢霉素全血样本的前处理剂，所述前处理剂以磷酸盐缓冲液为溶剂，包括：质量体积分数为0.1～1％的脱氧胆酸钠、质量体积分数为1～5％的5-磺基水杨酸和质量体积分数为0.1～1％的邻甲氧基苯甲酸；所述前处理剂的pH值为6～8。

本发明通过将脱氧胆酸盐、磷酸盐、5-磺基水杨酸、邻甲氧基苯甲酸按照一定的配比组合形成前处理剂，其中5-磺基水杨酸同血浆蛋白通过电荷相互结合发生沉淀，邻甲氧基苯甲酸通过疏水竞争将环孢霉素从血浆蛋白上解离下来，脱氧胆酸盐作为表面活性剂可有效溶解环孢霉素，前处理离心后的上清中，含有极少量的5-磺基水杨酸对抗体和碱性磷酸酶等几乎无影响，脱氧胆酸盐和邻甲氧基苯甲酸本身并无沉淀和蛋白变性作用，因此也是对抗体和酶无害的。而现有技术中的需要高浓度的甲醇和金属离子，在沉淀蛋白后，甲醇的浓度并没有发生变化，高浓度的甲醇会沉淀抗体和酶，需要对处理液进行稀释才能进行测定，降低了灵敏度，增加了操作步骤。虽然金属离子也会同蛋白共沉淀一部分，但是抗体和酶对金属离子的含量非常敏感，如2mM的Zn²⁺可使碱性磷酸酶活性降低到6％。因此本发明使用5-磺基水杨酸替代甲醇及金属用于血浆蛋白沉淀，可高效、快速的提取全血样本中的环孢霉素，中性条件下进行反应，对后续反应影响小。

附图说明

图1为环孢霉素全血样本前处理剂配合荧光免疫试剂同液相-质谱法测定临床样本的相关性；

图2为环孢霉素全血样本前处理剂配合磁微粒化学发光试剂同液相-质谱法测定临床样本的相关性。

具体实施方式

本发明提供了一种环孢霉素全血样本的前处理剂，所述前处理剂以磷酸盐缓冲液为溶剂，包括：质量体积分数为0.1～1％的脱氧胆酸钠、质量体积分数为1～5％的5-磺基水杨酸和质量体积分数为0.1～1％的邻甲氧基苯甲酸；所述前处理剂的pH值为6～8。

在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.1～1mol/L，更优选为0.2～0.5mol/L。

在本发明中，所述脱氧胆酸钠的质量体积分数为0.1～1％，优选为0.3～0.5％。在本发明中，所述5-磺基水杨酸的质量体积分数为1～5％，优选为2～4％。在本发明中，所述邻甲氧基苯甲酸的质量体积分数为0.1～1％的，优选为0.2～0.5％。在本发明中，所述前处理剂的pH值为6～8，优选为6.5～7.5。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

本发明对所述前处理剂的制备方法没有特殊限定，将各组分混合即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的前处理剂的使用方法，包括：将所述前处理剂与全血样本混合后，将得到的混合物离心，得到的清液为环孢霉素提取清液。

在本发明中，所述全血样本与前处理剂的体积比为1:0.5～2。本发明对所述全血样本的来源没有特殊限定，采用常规来源即可。在本发明中，所述混合优选通过漩涡混合均匀，所述漩涡的时间优选为10～60s。在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的离心力优选为9000～11000g，更优选为10000g；所述离心的时间为5～10min。

在本发明中，所述处理好的环孢霉素提取清液通过配套基于抗环孢霉素特异性抗体建立的免疫学测定方法用于环孢霉素含量的测定，所述方法优选包括：放射免疫法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法、侧向层析法或免疫比浊法。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

环孢霉素全血样本前处理剂的制备：

环孢霉素全血样本前处理剂的配置按照表1所示，配置完成后，常温放置即可。

表1前处理剂的组分

实施例2

实施例1得到的环孢霉素全血前处理剂对酶活性的影响

测试环孢霉素全血前处理提取上清对化学发光试剂中常用的牛碱性磷酸酶的活性的影响。

具体实施步骤如下：

(1)准确吸取200μl全血样本，加入200μl环孢霉素全血样本前处理剂，立即涡旋混匀20s。

(2)混合液11000rpm离心10min，小心吸取上清。

(3)吸取5μl(2)中的离心上清加入到5μl不同浓度的碱性磷酸酶中，混合孵育5min，加入到反应杯中，补充200μl的发光液，37度5min后，读取发光值。结果如表2所示：

表2环孢霉素全血前处理剂对酶活性的影响

由表2可以得出，因为发光值同碱性磷酸酶的活性成正比，本实施例中，随着碱性磷酸酶的浓度升高，环孢霉素前处理液的对酶活性影响越小。对于浓度低至0.1ng/mL的酶溶液，活性降低率也只有2.28％，表明本发明提出的环孢霉素全血样本前处理剂对碱性磷酸酶的活性影响很小，可以适用于多种酶试剂。

实施例3

实施例1得到的环孢霉素全血前处理剂对抗体活性的影响

测试环孢霉素全血前处理提取上清对免疫试剂中用到的环孢霉素抗体活性的影响。

具体实施步骤如下：

(1)采用PBS缓冲液稀释CSA-BSA抗原到2μg/mL，按照每孔100μl加入到96孔板，4℃包被过夜；

(2)次日，用PBST清洗4次，加入质量体积分数1％BSA，37℃孵育2h，用PBST清洗4次。

(3)96孔中分别加入50μl环孢霉素前处理清液、PBS。

(4)再加入50μl 1μg/mL的环孢霉素抗体，37℃孵育1h。

(5)用PBST清洗4次，加入100μl 1μg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠，37℃孵育30min。

(6)用PBST清洗4次，加入发光液，结果如表3所示：

表3环孢霉素全血前处理剂对抗体活性的影响

由表3可以得出，因为发光值同抗性活性成比例，本实施例中，环孢霉素前处理液相比于PBS溶液的对抗体活性影响很小，信号值降低率也只有2.75％，表明本发明提出的环孢霉素全血样本前处理剂对抗体的活性影响很小，可以适用于多种基于抗原抗体反应的免疫试剂。

实施例4

环孢霉素全血前处理剂应用于环孢霉素荧光免疫层析试剂

采用实施例1中的环孢霉素全血前处理剂进行样本前处理，并配套荧光免疫层析试剂进行环孢霉素浓度的测定，结果同液相-质谱法进行相关性对比。

具体实施步骤如下：

1、环孢霉素荧光免疫层析试纸条的制备：

(1)活化：取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于400μL活化缓冲液中(50mM MES pH6.0)，加入0.5mg EDC和0.5mg NHS，混匀后室温震荡活化15min；

(2)偶联：将(1)所述混悬液于4℃10000rpm离心10min后弃上清，重悬于活化缓

冲液中，加入3μg抗环孢霉素单克隆抗体溶液，混匀后室温震荡偶联30min；

(3)封闭：将(2)所述混悬液加入10％的酪蛋白溶液100μl，混匀后室温震荡封闭过夜；

(4)贮存：将(3)所述混悬液于4℃10000rpm离心10min后弃上清，重悬于贮存缓；

冲液中(0.01％NaN₃、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。

(5)玻璃纤维垫的制备：将贮存的荧光微球标记的环孢霉素单克隆抗体以贮存缓冲液稀释后，用金标点膜喷金仪喷金，37℃干燥15h，取出密封保存。

(6)硝酸纤维素(NC)膜的制备：用0.05mol/L、pH 7.2的PB缓冲液将环孢霉素半抗原-OVA偶联物稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.2μL/cm；用0.05mol/L、pH7.2的PB缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用金标点膜喷金仪将其喷涂于NC膜上的检测区(C)，喷膜量为1.2μL/cm；37℃干燥5h，备用。

(7)样品吸收垫的制备：将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、1％Tw20、pH 7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h，备用。

(8)试纸条的组装：将样品吸收垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与玻璃纤维垫始段相连，玻璃纤维垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成3.96mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。

2、环孢霉素样本前处理及测定

(1)准确吸取200μl全血样本，加入200μl环孢霉素全血样本前处理剂，立即涡旋混匀20s。

(2)混合液12000rpm离心10min，小心吸取上清。

(3)吸取80μl(2)中的离心上清加入到上述环孢霉素荧光免疫层析试纸条的加样孔中，静止反应15min。

(4)环孢霉素荧光免疫层析试纸条***荧光免疫分析仪中，读取对应的T/C的荧光强度比值(T为测试线的信号值，C为质控线的信号值)，根据已建立的标准曲线计算出样本中的环孢霉素含量。

(5)标准曲线的建立，收集未接受环孢霉素用药的EDTA抗凝人全血，添加不同浓度的环孢霉素，配置得到6个不同浓度的标准样本(0,100,200,400,800,1600ng/mL)。按照上述(1)-(4)的测试方法进行测试，得到6个样本的T/C的比值。对样本浓度和T/C的值进行四参数拟合，得到样本浓度和T/C之间的函数公式，即为标准曲线：

y＝(6.03421-0.40046)/[1+(x/193.36503)^2.10464]+0.40046

其中y为T/C比值，x为样本浓度。

(6)待测样本按照上述测定方法获得一个T/C值，带入(6)中的标准曲线公式计算出待测样本的浓度，如表3所示。

表4待测样本的浓度的结果

3、液相-质谱法测定环孢霉素样本浓度

将上述2中测定过的环孢霉素样本，采用高效液相-质谱法进行测定。人环孢霉素全血样品用乙腈沉淀蛋白后，上清液用叔丁基甲醚提取后选用ZORBAX SB C18(2.1×100mm,3.5cm)色谱柱，以甲醇-10mM乙酸铵溶液(均含0.1％甲酸)为流动相梯度洗脱，采用电喷雾离子化源，正离子方式，多反应监测(MRM)扫描方式进行测定。

4.检测结果的相关性分析

收集临床50例环孢霉素人全血样本，分别采用的本发明的环孢霉素全血样本前处理剂配套荧光免疫层析试纸条和高效液相-质谱法进行检测。采用线性回归方程进行两种测定结果的相关性分析，结果如图1所示：两种方法学相关系数R2＝0.982，相关性良好，表明本发明提出的环孢霉素样本前处理剂配套荧光层析试纸条的有效性。

实施例5

环孢霉素全血前处理剂应用于环孢霉素磁微粒化学发光试剂

采用实施例1中的环孢霉素全血前处理剂对实施例4中的人环孢霉素全血样本前处理，并配套磁微粒化学发光试剂进行环孢霉素浓度的测定，结果同液相-质谱法进行相关性对比。

1、试剂1的制备(磁珠组分)

(1)活化：取市售的表面含有羧基的磁珠5mg混悬于1000μL活化缓冲液中(15mMMES pH6.5)，加入2mg EDC和2mg NHS，混匀后室温震荡活化60min；

(2)偶联：将(1)所述混悬液于磁吸后弃上清，重悬于活化缓冲液中，加入15ug抗环孢霉素单克隆抗体溶液，混匀后室温震荡偶联120min；

(3)封闭：将(2)所述混悬液加入10％的酪蛋白溶液100μl，混匀后室温震荡封闭过夜；

(4)贮存：将(3)所述混悬液于磁吸后弃上清，重悬于贮存缓冲液中(0.01％NaN₃、0.1％BSA的pH 7.4的PB缓冲液)，以此法洗涤磁珠3次，稀释到磁珠浓度到0.2mg/mL4度保存，作为试剂1组分。

2、试剂2的制备(环孢霉素-碱性磷酸酶偶联物组分)

(1)取2mg环孢霉素羧基衍生物溶于1mL二甲基亚砜，加入1mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应15min。

(2)10mg小牛肠碱性磷酸酶溶于2mL PBS，再加入(1)中活化的环孢霉素，室温震荡反应2h。

(3)反应产物，对PBS透析4次，收集。

(4)用含0.1％BSA的PBS溶液稀释(3)中的透析产物到20μg/mL的浓度，即为试剂2组分。

3、样本稀释液的制备

PBS溶液中加入0.1％的BSA即为样本稀释液。

4、环孢霉素样本前处理

(1)准确吸取200μl全血样本，加入200μl环孢霉素全血样本前处理剂，立即涡旋混匀20s。

(2)混合液11000rpm离心10min，小心吸取上清，即为处理完成的样品。

5、测定方法

测定过程在全自动化学发光仪上进行，测定程序如下：

a.吸取30μl步骤4中制备的前处理后样品，加入50μl步骤3中制备的样本稀释液，再加入50μl步骤1中制备的试剂1(磁珠标记的环孢霉素抗体)，混合后反应10min。

b.加入50μl步骤2中制备的试剂2(环孢霉素-碱性磷酸酶)，混合反应5min。

c.反应磁珠复合物清洗4次。

d.加入200μl碱性磷酸酶底物，37℃孵育5min后，读取发光值。

e.标准曲线的建立：收集未接受环孢霉素用药的EDTA抗凝人全血，添加不同浓度的环孢霉素，配置得到6个不同浓度的标准样本(0,100,200,400,800,1600ng/mL)。按照上述(a)-(d)的测试方法进行测试，得到6个样本的发光值。对样本浓度和发光值进行Hill参数拟合，得到样本浓度和发光值之间的函数公式，即为标准曲线：

y＝ymax*xⁿ/(kⁿ+xⁿ)

其中ymax＝1050000，k＝122.96558，n＝-1.62062；

y为发光信号值，x为样本浓度。

f.根据已建立的标准曲线，计算对应的样本浓度，如表4所示。

表5样本浓度的结果

6、相关性分析

将磁微粒化学发光检测结果同实施例4中的高效液相-质谱法的测定结果采用线性回归方程进行相关性分析，结果如图2所示：两种方法学相关系数R2＝0.984，相关性良好，表明本发明提出的环孢霉素样本前处理剂配套磁微粒化学发光试剂的有效性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种环孢霉素全血样本的前处理剂，其特征在于，所述前处理剂以磷酸盐缓冲液为溶剂，包括：质量体积分数为0.1～1％的脱氧胆酸钠、质量体积分数为1～5％的5-磺基水杨酸和质量体积分数为0.1～1％的邻甲氧基苯甲酸；

所述前处理剂的pH值为6～8。

2.根据权利要求1所述的前处理剂，其特征在于，包括质量体积分数为0.3～0.5％的脱氧胆酸钠。

3.根据权利要求1所述的前处理剂，其特征在于，包括质量体积分数为2～4％的5-磺基水杨酸。

4.根据权利要求1所述的前处理剂，其特征在于，包括质量体积分数为0.2～0.5％的邻甲氧基苯甲酸。

5.根据权利要求1所述的前处理剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～1mol/L。

6.根据权利要求1或5所述的前处理剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.2～0.5mol/L。

7.根据权利要求1所述的前处理剂，其特征在于，所述前处理剂的pH值为6.5～7.5。

8.权利要求1～7任一项所述的前处理剂的使用方法，包括：将所述前处理剂与全血样本混合后，将得到的混合物离心，得到的清液为环孢霉素提取清液。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述全血样本与前处理剂的体积比为1:0.5～2。

10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述离心的条件包括：所述离心的离心力为9000～11000g，所述离心的时间为5～10min。

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