CN113249257B - 一株变形假单胞菌j-t3及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一株变形假单胞菌J‑T3及其制备方法和应用。本发明提供了一株变形假单胞菌J‑T3，所述变形假单胞菌J‑T3的保藏编号为CGMCC No.22137。本发明提供的变形假单胞菌J‑T3具有耐高温的特性，在高温条件下仍能保持较高的糖酸转化率和2‑酮基葡萄糖酸生产强度。本发明提供的耐高温的变形假单胞菌J‑T3在30℃和40℃下的发酵结果无明显波动，菌体细胞浓度分别为9.99和9.58，糖酸转化率分别为0.8868g/g和0.8676g/g，在40℃的环境下2‑酮基葡萄糖酸发酵生产强度相对于常规的假单胞菌能够提高10％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一株变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)J-T3及其制备方法和应用。
背景技术
2-酮基葡萄糖酸(2-酮基-D-葡萄糖酸)是一种以葡萄糖为底物利用氧化细菌(通常利用假单胞菌属的细菌)大规模发酵生产的有机酸，其主要用途是作为抗氧化剂D-异抗坏血酸及其盐类合成的前体，同时也是一种多用途、高价值的化工原料。
假单胞菌是一类好氧性革兰氏阴性细菌，广泛存在于自然界的各种环境中，如土壤、水体、植物表面、动物和人体组织中。假单胞菌的菌体呈杆状，大小为(0.5～1.0)μm×(1.5～4.0)μm，具有单鞭毛或多鞭毛，无芽孢。假单胞菌的最适生长温度多为30℃左右，通常不会超过35℃。
根据生化反应发生在细胞结构中的位置，假单胞菌的葡萄糖代谢大致可分为两条途径：第一条途径为胞外氧化途径，该途径与2-酮基葡萄糖酸的合成相关，即葡萄糖在周质空间被膜结合葡萄糖脱氢酶催化氧化为葡萄糖酸，随后在膜结合葡萄糖酸脱氢酶的作用下被氧化为2-酮基葡萄糖酸；第二条途径为胞内磷酸化途径，即周质空间中的葡萄糖、葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸进入细胞质分别被相应的激酶(葡萄糖激酶、葡萄糖酸激酶和2-酮基葡萄糖酸激酶)磷酸化并转化为中心代谢产物6-磷酸葡萄糖酸，随后6-磷酸葡萄糖酸被进一步分解以维持细胞的生理代谢。
温度是影响假单胞菌葡萄糖代谢由胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转的主要因素之一。在适宜的发酵温度(30℃左右)下，培养基中90％左右的葡萄糖经胞外氧化途径被假单胞菌转化为2-酮基葡萄糖酸并积累于发酵液中，只有大约10％的葡萄糖进入胞内磷酸化途径而被细胞分解代谢。高温胁迫条件(38℃以上)下，假单胞菌的葡萄糖代谢从胞外氧化途径向胞内磷酸化途径偏转，2-酮基葡萄糖酸的产率明显下降。
而假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸发酵过程是一个典型的生物氧化反应过程，伴随着大量反应热的释放。为了维持适宜的发酵温度，需要消耗大量的能源对发酵体系进行持续的降温，以免高温对假单胞菌的生理代谢造成不利影响。现有技术并没有一种在2-酮基葡萄糖酸发酵中具有耐高温性能的生产菌株，发酵过程中的能源消耗问题仍不能克服。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)J-T3及其制备方法和应用。本发明提供的变形假单胞菌J-T3具有耐高温的特性，相较于常见的假单胞菌，本发明提供的变形假单胞菌J-T3能够在高达40℃的高温条件下保持高产2-酮基葡萄糖酸(2KGA)的状态，能够有效降低假单胞菌在生产2KGA时的能源消耗。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一株变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3，所述变形假单胞菌J-T3的保藏编号为CGMCC No.22137。
本发明还提供了上述变形假单胞菌J-T3的培养方法，包括以下步骤：
将上述变形假单胞菌J-T3置于种子培养基中进行种子培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养得到2-酮基葡萄糖酸。
优选的，所述种子培养基包括碳源、氮源和添加剂；
所述碳源包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液；所述氮源包括玉米浆和/或酵母膏和/或牛肉膏和/或尿素；所述添加剂包括磷酸二氢钾和/或七水硫酸镁和/或轻质碳酸钙。
优选的，当所述碳源为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述种子培养基中的添加量为10～50g/L；当所述氮源为玉米浆和尿素时，所述玉米浆和尿素在所述种子培养基中的添加量为：玉米浆干粉5.0g/L、尿素2.0g/L；当所述添加剂为磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙时，所述磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙在所述种子培养基中的添加量为：磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L和轻质碳酸钙1.0g/L；所述种子培养基的pH值为6.5～7.2。
优选的，所述种子培养过程中，温度为28℃～40℃，转速为200～300r/min，培养的时间为16～18h。
优选的，所述发酵培养基包括碳源、氮源和中和剂；
所述碳源包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液；所述氮源包括玉米浆干粉；所述中和剂包括轻质碳酸钙和/或氢氧化钠和/或氧化钙和/或碳酸钠。
优选的，当所述碳源为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述发酵培养基中的添加量为90～200g/L；当所述氮源为玉米浆干粉时，所述玉米浆干粉在所述发酵基中的添加量为：玉米浆干粉10.0g/L；当所述中和剂剂为轻质碳酸钙时，所述轻质碳酸钙在所述发酵培养基中的添加量为：45.0g/L；所述发酵培养基pH值为6.0～7.2。
优选的，所述发酵培养过程中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:(10～20)；所述培养的温度为28℃～40℃，培养的时间为52～64h。
本发明还提供了上述变形假单胞菌J-T3或上述培养方法培养得到的变形假单胞菌J-T3在高温胁迫条件下生产2-酮基葡萄糖酸中的应用。
优选的，所述高温胁迫条件为38℃～42℃。
本发明提供了一株变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3，所述变形假单胞菌J-T3的保藏编号为CGMCC No.22137。本发明提供的变形假单胞菌J-T3具有耐高温的特性，在高温条件下仍能保持较高的糖酸转化率和2KGA生产强度，同时，在实际生产中如选用本发明提供的菌株能够有效减少降温所需的能源消耗。由实施例可知，在30℃的培养环境下常规假单胞菌的菌体细胞浓度(OD650nm)和糖酸转化率分别为10.05和0.8863g/g，当温度升至40℃后，常规假单胞菌菌体细胞浓度和糖酸转化率明显降低，降至8.24和0.7888g/g。但是本发明提供的耐高温的变形假单胞菌J-T3在30℃和40℃下的发酵结果无明显波动，菌体细胞浓度分别为9.99和9.58，糖酸转化率分别为0.8868g/g和0.8676g/g，在40℃的环境下2KGA发酵生产强度相对于常规假单胞菌提高10％以上。
保藏说明
变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3，于2021年04月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22137。
附图说明
图1为变形假单胞菌耐高温突变株的初筛图片；
图2为变形假单胞菌J-T3的适应性进化过程图；
图3为变形假单胞菌J-T3和变形假单胞菌JSU01的菌体形态对比图；
图4为变形假单胞菌J-T3在不同温度下的生长曲线图；
图5为变形假单胞菌JSU01在不同温度下的生长曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一株变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3，所述变形假单胞菌J-T3的保藏编号为CGMCC No.22137。本发明提供的变形假单胞菌J-T3具有耐高温的特性，常规假单胞菌的最适生长温度为30℃～36℃，本发明提供的变形假单胞菌J-T3在40℃的环境下保持高产2-酮基葡萄糖，在42℃的环境下仍能够持续以较高的糖酸转化率产出2-酮基葡萄糖酸。在生产过程中，耐高温的变形假单胞菌J-T3能够减少生产过程中降温所需的能源，甚至不需要额外进行降温处理，能够有效降低能源消耗，缩短发酵的生产周期并提高生产效率，同时，耐高温的特性还有利于降低杂菌污染的几率。
本发明还提供了上述变形假单胞菌J-T3的培养方法，包括以下步骤：
将上述变形假单胞菌J-T3置于种子培养基中进行种子培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养得到2-酮基葡萄糖酸。本发明提供的培养方法有培养基配方简单、原料来源广、经济廉价的优势。
在本发明中，所述种子培养基优选包括碳源、氮源和添加剂；
所述碳源优选包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液，当所述碳源优选为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述种子培养基中的添加量优选为10～50g/L，进一步优选为20g/L；所述氮源优选包括玉米浆和/或酵母膏和/或牛肉膏和/或尿素，当所述氮源优选为括玉米和尿素时，所述玉米浆和尿素在所述种子培养基中的添加量优选为：玉米浆干粉5.0g/L、尿素2.0g/L；所述添加剂优选包括磷酸二氢钾和/或七水硫酸镁和/或轻质碳酸钙，当所述添加剂优选为磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙时，所述磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙在所述种子培养基中的添加量优选为：磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L和轻质碳酸钙1.0g/L，所述种子培养基的pH值优选为6.5～7.2，进一步优选为7.0。本发明提供的种子培养基方便易得，还能够有效促进菌株的生长繁殖。
在本发明中，所述种子培养过程中，培养的温度优选为28℃～40℃，进一步优选为30℃，转速优选为200～300r/min，进一步优选为265r/min，偏心距优选为25mm，培养的时间优选为16～18h，进一步优选为18h。本发明提供的培养条件培养得到的菌体细胞活性较高。
在本发明中，所述发酵培养基优选包括碳源、氮源和中和剂；
所述碳源优选包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液，当所述碳源优选为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述发酵培养基中的添加量优选为90～200g/L，进一步优选为180.0g/L；所述氮源优选包括玉米浆干粉，当所述氮源优选为玉米浆干粉时，所述玉米浆干粉在所述发酵基中的添加量优选为：玉米浆干粉10.0g/L；所述中和剂优选包括轻质碳酸钙和/或氢氧化钠和/或氧化钙和/或碳酸钠，当所述中和剂优选为轻质碳酸钙时，所述轻质碳酸钙在所述发酵培养基中的添加量优选为：45.0g/L，所述发酵培养基pH值优选为6.0～7.2，进一步优选为6.7。本发明提供的发酵培养基组成简单，成本低廉，能够有效促进菌的增殖和2-酮基葡萄糖酸的生产。
在本发明中，所述发酵培养过程中，接种量优选为上述制备方法制备得到的种子液与发酵培养基以1:(10～20)，进一步优选为1:10的体积比混合；所述培养的温度优选为28℃～40℃，进一步优选为38℃，转速优选为200～300r/min，进一步优选为265r/min，偏心距优选为25mm，培养的时间优选为52～64h，进一步优选为60h。本发明提供的培养条件能够有效提高糖酸转化率和2KGA的生产强度。
本发明还提供了上述变形假单胞菌J-T3或上述培养方法培养得到的变形假单胞菌J-T3在高温胁迫条件下生产2-酮基葡萄糖酸中的应用。本发明提供的变形假单胞菌J-T3在40℃的条件下不仅能够正常进行生长繁殖，还能够保持较高的糖酸转化率和2KGA生产强度。
本发明对上述材料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。
在本发明中，所述高温胁迫条件为38℃～42℃。常规假单胞菌的生长繁殖最适温度小于等于36℃，实际应用中的发酵温度为30℃～36℃，本发明提供的变形假单胞菌J-T3在高温胁迫条件下仍能够保持活性生产2KGA，在35℃～40℃的条件下能够保持旺盛的生长繁殖并维持高产状态，在42℃的条件下保持以较高的糖酸转化率持续产出2KGA的状态。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
获取变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)J-T3
1)对变形假单胞菌JSU01的诱变处理
种子培养基(g/L)：结晶葡萄糖20.0、玉米浆干粉5.0、尿素2.0、磷酸二氢钾(KH2PO4)2.0、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5和轻质碳酸钙(轻质CaCO3)1.0，pH 7.0。
菌悬液的制备：将变形假单胞菌JSU01斜面菌种接种于装有50mL种子培养基的500mL锥形瓶中，在265r/min、30℃的条件下摇床振荡培养16h左右。取10.0mL的种液置于无菌的50mL离心管中，5000r/min离心5min，弃上清；用无菌生理盐水洗涤菌体2次，使其重悬于10.0mL的无菌生理盐水中。取1.0mL的菌液，用无菌的生理盐水稀释100倍，然后制备得到菌体细胞浓度约为(0.5～2.5)×108CFU/mL的菌悬液。
常压室温等离子体(ARTP)诱变：利用ARTP-IIS型诱变育种仪(无锡源清天木生物科技有限公司)对变形假单胞菌JSU01进行诱变。将10μL的变形假单胞菌JSU01菌悬液均匀涂布于铜片表面，同时将铜片与等离子体发射器之间的距离调整为2mm，在输出功率120W、氦气流速10.0L/min的条件下诱变20秒。诱变结束后，将附着在铜片上的菌体洗脱到无菌生理盐水溶液中，得到诱变后的JSU01菌悬液。
2)对变形假单胞菌JSU01耐高温突变株的初筛
初筛培养基平板：结晶葡萄糖50.0g/L，酵母提取物6.0g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，轻质CaCO3 12.5 g/L，1.6％的溴甲酚绿乙醇溶液1.0mL/L，琼脂20.0g/L，pH 7.0。
将步骤1)得到的诱变后的JSU01菌悬液适当稀释并涂布到初筛培养基(结晶葡萄糖40～60.0g/L、酵母提取物5.0～7.0g/L、KH2PO4 1.0～3.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4～0.6g/L、轻质CaCO3 10.0～15.0g/L、1.6％的溴甲酚绿乙醇溶液0.8～2.0mL/L和琼脂15.0～25.0g/L，pH值为6.0～7.2)平板上，然后将其置于30℃下培养。待平板上长出小菌落后，将平板转移至恒温培养箱中40℃培养2d，根据平板上黄色变色圈的大小可以初步判断菌株的产酸能力(图1)，选取了6个黄色变色圈明显大于对照菌株JSU01变色圈的菌落作为耐高温突变株，并将其分别编号为J-1、J-2、J-3、J-4、J-5和J-6。
3)变形假单胞菌JSU01耐高温突变株的复筛
利用摇瓶发酵试验对初筛的耐高温突变株进行复筛，结果如表1所示。
种子培养基(g/L)：结晶葡萄糖20.0，玉米浆干粉5.0，尿素2.0，KH2PO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，轻质CaCO3 1.0，pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：结晶葡萄糖180.0，玉米浆干粉10.0，轻质CaCO3 45.0，pH 6.7。
种子培养：将初筛的耐高温突变株接入装有50mL的种子培养基的500mL锥形瓶中，在30℃、265r/min(偏心距25mm)的条件下振荡培养18h。
摇瓶发酵：将4mL的种子液接入装有40mL发酵培养基的500mL的锥形瓶中，在40℃、265r/min(偏心距25mm)的条件下振荡培养60h。
表1 变形假单胞菌JSU01耐高温突变株的复筛结果
4)耐高温突变株J-3的适应性进化
用接种环从耐高温突变株J-3的斜面上取一环菌苔，将耐高温突变株J-3的斜面菌种接种于装有50mL种子培养基的500mL锥形瓶中，在230～30r/min、30±0.5℃的条件下摇床振荡培养12h，然后以2％的接种量转接至新鲜的种子培养基中在相同的条件下进行循环培养。当突变株J-3适应该培养温度条件(即培养终点时种子液的菌体细胞浓度基本保持稳定)后，再将培养温度逐步提高至32±0.5℃、34±0.5℃、36±0.5℃和38±0.5℃(适应性进化过程见图2)。适应性进化至102代以后，每一次培养终点时的菌液OD650nm值保持基本稳定(11.00～11.20)，且与30℃下培养的菌液OD650nm值(≥11.20)接近，说明J-3的耐高温能力得到提高。
经平板分离，由J-3分离得到本发明提供的耐高温突变株J-T3(图3)。变形假单胞菌J-T3与JSU01的菌体形态没有明显差异，其菌体均呈杆状，大小均为(0.5～1.0)μm×(1.5～4.0)μm。
实施例2
耐高温突变株J-T3利用葡萄糖发酵生产2KGA
根据实施例1步骤3)提供的培养方法，比较耐高温突变株J-T3与亲株JSU01在30℃和40℃下的2KGA发酵结果。
表2 耐高温突变株J-T3与亲株JSU01的发酵结果比较
由表2可知，30℃下JSU01的菌体细胞浓度(OD650nm)和糖酸转化率分别高达10.05和0.8863g/g，而40℃下JSU01的菌体细胞浓度和糖酸转化率明显降低，分别仅为8.24和0.7888g/g。相对而言，变形假单胞菌J-T3在30℃和40℃下的发酵结果相差不大，其糖酸转化率分别为0.8868g/g和0.8676g/g，菌体细胞浓度(OD650nm)分别为9.99和9.58，且40℃下2KGA发酵生产强度相对提高了10％以上。
实施例3
耐高温突变株J-T3的生长曲线
在不同温度下将变形假单胞菌J-T3和JSU01在实施例1步骤3)提供的种子培养基中进行培养(其它培养条件与实施例1步骤3)均相同)，菌株J-T3与JUS01之间存在较明显的差异，具体见图4、图5、表3和表4。
表3 J-T3在不同温度下的菌体生长量(ODnm650)
表4 JSU01在不同温度下的菌体生长量(ODnm650)
由图4、图5和表3、表4可知，当培养温度为30℃～36℃时，菌株J-T3与亲株JUS01的生长趋势几乎完全相同，菌体生长量也没有明显变化；
当培养温度为38℃时，菌株J-T3的生长曲线与30℃时的生长曲线相同，而亲株JUS01的生长速率明显变缓，菌体生长量也有较明显的降低；
当培养温度为40℃时，菌株J-T3与亲株JUS01的生长速率和菌体生长量均有下降，但亲株JUS01的下降幅度明显大于J-T3菌株。
以上实施例说明本发明提供的变形假单胞菌J-T3不仅具有耐高温的特性，能够在高温条件下正常生长发育，还能够在高温条件下保持高产状态。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)J-T3，其特征在于，所述变形假单胞菌J-T3的保藏编号为CGMCC No.22137。
2.权利要求1所述的变形假单胞菌J-T3的培养方法，包括以下步骤：
将权利要求1所述的变形假单胞菌J-T3置于种子培养基中进行种子培养得到种子液，将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养得到2-酮基葡萄糖酸。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基包括碳源、氮源和添加剂；
所述碳源包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液；所述氮源包括玉米浆和/或酵母膏和/或牛肉膏和/或尿素；所述添加剂包括磷酸二氢钾和/或七水硫酸镁和/或轻质碳酸钙。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，当所述碳源为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述种子培养基中的添加量为10～50g/L；当所述氮源为玉米浆和尿素时，所述玉米浆和尿素在所述种子培养基中的添加量为：玉米浆干粉5.0g/L、尿素2.0g/L；当所述添加剂为磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙时，所述磷酸二氢钾、七水硫酸镁和轻质碳酸钙在所述种子培养基中的添加量为：磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L和轻质碳酸钙1.0g/L；所述种子培养基的pH值为6.5～7.2。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养过程中，温度为28℃～40℃，转速为200～300r/min，培养的时间为16～18h。
6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源、氮源和中和剂；
所述碳源包括结晶葡萄糖和/或葡萄糖水溶液；所述氮源包括玉米浆干粉；所述中和剂包括轻质碳酸钙和/或氢氧化钠和/或氧化钙和/或碳酸钠。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，当所述碳源为结晶葡萄糖时，所述结晶葡萄糖在所述发酵培养基中的添加量为90～200g/L；当所述氮源为玉米浆干粉时，所述玉米浆干粉在所述发酵基中的添加量为：玉米浆干粉10.0g/L；当所述中和剂为轻质碳酸钙时，所述轻质碳酸钙在所述发酵培养基中的添加量为：45.0g/L；所述发酵培养基pH值为6.0～7.2。
8.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养过程中，所述种子液与发酵培养基的体积比为1:(10～20)；所述培养的温度为28℃～40℃，培养的时间为52～64h。
9.权利要求1所述的变形假单胞菌J-T3或权利要求2～8任一项所述的培养方法培养得到的变形假单胞菌J-T3在高温胁迫条件下生产2-酮基葡萄糖酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高温胁迫条件为38℃～42℃。
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