CN113248513B - 具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其制备方法 - Google Patents

具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其制备方法，属于生物医学技术领域。该方法首先将金黄壳囊胞菌发酵培养；然后采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到的粗浸膏梯度洗脱得到六个组分段，将第四个组分段再次梯度洗脱，得到四个亚组分段；分别对第二个亚组分段和第四个亚组分段采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化，得到两个新型细胞松弛素；这两个新型细胞松弛素对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌四种临床耐药性细菌有很强的拮抗作用，有望开发成新型抗临床耐药性细菌的药物。

Description

具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其 制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其制备方法。
背景技术
耐药性细菌是指那些对传统抗菌药物具有耐受性的细菌，这是细菌自身生存过程中的一种特殊变现形式，当长期使用抗生素，大多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高，一旦耐药性产生，药物的治疗作用就明显下降甚至于完全失去治疗作用。近些年来，由于抗生素的滥用，全世界范围内产生了大量的耐药性细菌，早在2014年世界卫生组织就曾发布报告称，抗生素耐药性细菌正在全球蔓延，在这些耐药性细菌里面，比较出名的就包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌等等。
细胞松弛素是一种由真菌产生的的生物碱类次级代谢产物。此类化合物在细胞内同微丝的正端结合，并引起F-肌动蛋白解聚，阻断亚基的进一步聚合，当将细胞松弛素加入到活细胞后，肌动蛋白纤维骨架消失，使动物细胞的各种活动瘫痪，包括细胞的移动、吞噬作用、胞质***等，因此取名为细胞松弛素。但是它对微管没有作用，也不抑制肌收缩。
为了防止出现的耐药性细菌不断威胁人们身体健康，有大量的研究者在不断的去挖掘新型抗生素或者能够应对抗临床耐药性细菌的新型分子。这里面就包括著名的Teixobactin抗生素，它是由美国西北大学，吉姆·里维斯团队发现的新型抗生素分子，它对MRSA细菌等具有非常强的拮抗作用，而且可以治疗肺结核、败血病等多种常见的感染。近些年来，虽然不断有能够拮抗临床耐药性细菌的新型分子被报道，但是很少有学者报道了细胞松弛素类化合物对临床抗耐药性细菌的拮抗作用。
发明内容
近些年来由于抗生素滥用，全世界范围内出现了多种临床耐药性细菌，这些耐药性细菌正在一步步威胁人们的身体健康，为了解决这一世界性公共卫生难题，各国研究者都在不停的开发能够拮抗耐药性细菌的新型分子。在本发明中，我们首次发现了从真菌次级代谢产物中发现的新型细胞松弛素化合物(cytochrysins A，cytochrysins B)，并研究了它们对多株临床耐药性细菌的拮抗作用，最终我们发现cytochrysins A，cytochrysinsB两个新型细胞松弛素化合物对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌四种临床耐药性细菌有很强的拮抗作用(MIC，25μg/mL)，继续下一步深入研究，有望开发成新型抗临床耐药性细菌的药物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物及其制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure BDA0003014489750000021
化合物1的结构式为：
Figure BDA0003014489750000031
进一步，优选的是，步骤(1)具体方法如下：
(1.1)将金黄壳囊胞菌在PDA平板上活化；
(1.2)已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养，制备该菌种种子液；
(1.3)将菌种种子液倒入固体培养基中恒温发酵培养；
所述的固体培养基是将MEB溶液和大米按照体积质量比1：1mL/g的比例配制而成。
进一步，优选的是，(1.1)中，活化时间为3天；(1.2)中，恒温振荡培养的条件为28℃，160rpm，3天；(1.3)中，恒温发酵培养的条件为28℃，30天。
进一步，优选的是，步骤(2)中，减压浓缩的压力为-0.1Mpa，温度为-20℃。
进一步，优选的是，步骤(3)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为100：1、80：1、50：1、30：1、10：1和1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
进一步，优选的是，步骤(4)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为50：1、20：1、10：1、1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
进一步，优选的是，步骤(5)中，高效液相色谱分离纯化条件为：以体积浓度为70％的乙腈水溶液为流动相，采用安捷伦C18反向色谱柱，规格为：4.6mmx250nm，5um；柱温：30℃；柱流量：1ml/min；每次进样量：20ul；采用紫外检测器，检测波长为210nm。收集tR＝12.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；
步骤(6)中，静置时间为不少于5d。
本发明还提供具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物，该细胞松弛素化合物为化合物1，其结构式为：
Figure BDA0003014489750000041
本发明同时提供具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物，该细胞松弛素化合物为化合物2，其结构式为：
Figure BDA0003014489750000042
本发明另外提供具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物在制备抗临床耐药性细菌剂的应用。
本发明中，金黄壳囊胞菌HYQZ-931(Cytospora chrysosperma HYQZ-931)，已于2021年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2021279，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明所涉及的植物内生真菌为金黄壳囊孢菌，是Cytospora属的微生物，具有白色丝状菌丝，分生孢子器呈黑褐色，不规则形，多室，埋生于子座内，有一共同的孔伸出子座外，并突出寄主表皮外露，分生孢子形状与子囊孢子相似，无色，单胞。该菌在4～35℃范围内均可生长，但以25℃生长最适宜。菌丝生长最适宜的酸碱度为pH4，分生孢子与子囊孢子萌发的适温均为25～30℃。
本发明首次发现了从真菌次级代谢产物中发现的新型细胞松弛素化合物(cytochrysins A，cytochrysins B)，并研究了它们对多株临床耐药性细菌的拮抗作用，最终我们发现cytochrysins A，cytochrysins B两个新型细胞松弛素化合物对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌四种临床耐药性细菌有很强的拮抗作用(MIC，25μg/mL)，继续下一步深入研究，有望开发成新型抗临床耐药性细菌的药物。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1.本发明中报道的两个细胞松弛素类化合物(cytochrysins A，cytochrysins B)系首次发现的新化合物(化合物结构请参见附图1)。
2.本发明同时也首次报道了这两个化合物对四种临床耐药性细菌(耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌)的抑制活性(活性结果见附表3)，继续下一步深入研究，有望开发成新型抗临床耐药性细菌的药物。
附图说明
图1为化合物1的结构式；
图2为化合物2的结构式；
图3为化合物1的1H核磁光谱图(氘代甲醇，600MHz)；
图4为化合物1的13C以及DEPT核磁光谱图(氘代甲醇，150MHz)；
图5为化合物1的高分辨质谱图；
图6为化合物1的紫外吸收光谱图；
图7为化合物2的1H核磁光谱图(氘代甲醇，600MHz)；
图8为化合物2的13C以及DEPT核磁光谱图(氘代甲醇，150MHz)；
图9为化合物2的高分辨质谱图；
图10为化合物2的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表质量百分数。
实施例1
具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure BDA0003014489750000061
化合物1的结构式为：
Figure BDA0003014489750000062
实施例2
具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure BDA0003014489750000071
化合物1的结构式为：
Figure BDA0003014489750000072
步骤(1)具体方法如下：
(1.1)将金黄壳囊胞菌在PDA平板上活化；
(1.2)已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养，制备该菌种种子液；
(1.3)将菌种种子液倒入固体培养基中恒温发酵培养；
所述的固体培养基是将MEB溶液和大米按照体积质量比1：1mL/g的比例配制而成。
实施例3
具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure BDA0003014489750000081
化合物1的结构式为：
Figure BDA0003014489750000082
步骤(1)具体方法如下：
(1.1)将金黄壳囊胞菌在PDA平板上活化；
(1.2)已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养，制备该菌种种子液；
(1.3)将菌种种子液倒入固体培养基中恒温发酵培养；
所述的固体培养基是将MEB溶液和大米按照体积质量比1：1mL/g的比例配制而成。
步骤(2)中，减压浓缩的压力为-0.1Mpa，温度为-20℃。
步骤(3)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为100：1、80：1、50：1、30：1、10：1和1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
步骤(4)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为50：1、20：1、10：1、1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
步骤(5)中，高效液相色谱分离纯化条件为：以体积浓度为70％的乙腈水溶液为流动相，采用安捷伦C18反向色谱柱，规格为：4.6mmx250nm，5u m；柱温：30℃；柱流量：1ml/min；每次进样量：20ul；采用紫外检测器，检测波长为210nm。收集tR＝12.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；
步骤(6)中，静置时间为不少于5d。
实施例4
具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure BDA0003014489750000101
化合物1的结构式为：
Figure BDA0003014489750000102
步骤(1)具体方法如下：
(1.1)将金黄壳囊胞菌在PDA平板上活化；
(1.2)已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养，制备该菌种种子液；
(1.3)将菌种种子液倒入固体培养基中恒温发酵培养；
所述的固体培养基是将MEB溶液和大米按照体积质量比1：1mL/g的比例配制而成。
(1.1)中，活化时间为3天；(1.2)中，恒温振荡培养的条件为28℃，160rpm，3天；(1.3)中，恒温发酵培养的条件为28℃，30天。
步骤(2)中，减压浓缩的压力为-0.1Mpa，温度为-20℃。
步骤(3)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为100：1、80：1、50：1、30：1、10：1和1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
步骤(4)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为50：1、20：1、10：1、1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
步骤(5)中，高效液相色谱分离纯化条件为：以体积浓度为70％的乙腈水溶液为流动相，采用安捷伦C18反向色谱柱，规格为：4.6mmx250nm，5um；柱温：30℃；柱流量：1ml/min；每次进样量：20ul；采用紫外检测器，检测波长为210nm。收集tR＝12.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；
步骤(6)中，静置时间为不少于5d。
应用实例
本发明中公开的两个细胞松弛素分子均是在植物内生真菌-金黄壳囊胞菌HYQZ-931(Cytospora chrysosperma HYQZ-931)的次级代谢产物中分离纯化得到的。该植物内生真菌是从沙漠植物-沙棘(Hippophae rhamnoides)中分离得到，最终鉴定为金黄壳囊胞菌(Cytospora chrysosperma，Genbank编号为KU143710.1。
本实验的大致步骤为，先将植物内生真菌-金黄壳囊胞菌在大米+MEB(麦芽提取物)的固体培养基中恒温发酵培养30天，再用甲醇提取其次级代谢产物，然后用乙酸乙酯对甲醇提取的次级代谢产物进行萃取，减压浓缩得到粗浸膏，此粗浸膏再经过硅胶柱层析、凝胶色谱分析、高效液相制备这些分离纯化手段，得到两个新型细胞松弛素化合物(cytochrysins A，cytochrysins B，化合物分子结构见图1)，最后再对得到的两个新型细胞松弛素化合物测试抗临床耐药性细菌的活性实验(抑菌活性实验结果见表3)。下面我将详细阐述整个实验过程。
1.植物内生真菌-金黄壳囊胞菌的发酵培养
1.1将金黄壳囊胞菌取出，在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上活化3天。
PDA平板制作：取38g PDA粉末(北京奥博星公司)，加入1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌20min，趁热将PDA溶液倒入无菌培养皿中(倒入量约为培养皿二分之一的体积)，放冷即可得到PDA平板。(北京奥博星公司生产的PDA粉末已含琼脂，无需另加，该平板对pH无特殊要求，中性即可)
1.2配制PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)培养基并高温高压灭菌30分钟(121℃，30min)，然后挑出少许已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养3天(28℃，160rpm)，制备该菌种种子液。
PDB培养基配制：取38g PDB粉末(北京奥博星公司)，加入1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌20min，即可得到PDB培养基。
1.3配制MEB(麦芽提取物)溶液，然后按照MEB：大米＝1：1的比例配制发酵所需的固体培养基，其具体步骤为每瓶固体培养基中含100g大米和100ml MEB溶液，总计配制200瓶上述固体培养基，并高温高压灭菌(121℃，0.3Mpa)30分钟，最后将少许制备好的菌种种子液倒入已灭好菌的固体培养基中恒温发酵培养30天(28℃)。
MEB溶液配制：麦芽提取物2％(2％是指每100ml蒸馏水里面加入2g麦芽提取物)，蔗糖2％，蛋白胨0.1％。
2.粗浸膏的制备
发酵培养30天后，用甲醇(40L/次，3次)提取金黄壳囊胞菌的次级代谢产物。减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩蒸发掉溶剂得到粗浸膏(109g)。
3.化合物的分离纯化
粗浸膏用少量乙酸乙酯溶解后，用80目的硅胶拌样，湿法上样，通过硅胶柱层析法(装柱硅胶为200-300目)，选用二氯甲烷-甲醇(CH2Cl2-MeOH)梯度洗脱(100∶1-1∶1)对粗浸膏进行梯度洗脱(采用TLC跟踪)，得到六个组分段(Fr.A-F)，其中Fr.A组分段通过100：1的梯度洗脱得到，Fr.B-Fr.F分别通过80：1、50：1、30：1、10：1、1：1的梯度洗脱得到。
Fr.D(8g)，用80目的硅胶拌样，湿法上样，再通过硅胶柱层析法(装柱硅胶为200-300目)，选用CH2Cl2-MeOH梯度洗脱(50∶1-1∶1)对Fr.D组分段再次梯度洗脱(采用TLC跟踪)，得到四个亚组分段(Fr.D1-D4，50：1、20：1、10：1、1：1)。
其中Fr.D2(324mg)亚组分段再依次通过葡聚糖凝胶色谱分析，采用自动馏分收集器接样，每管接样体积3ml，TLC点板合并相同组分，收集第14-25管，然后高效液相色谱分离纯化，得到化合物2(cytochrysins B，12mg)；其高效液相色谱分离纯化条件为：以体积浓度为70％的乙腈水溶液为流动相，采用安捷伦C18反向色谱柱，规格为：4.6mmx250nm，5um；柱温：30℃；柱流量：1ml/min；每次进样量：20ul；采用紫外检测器，检测波长为210nm。收集tR＝12.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；
Fr.D4(190mg)亚组分段采用葡聚糖凝胶色谱分析，自动馏分收集器接样，每管接样体积3ml，第10-21管点板合并静置7d，在瓶内析出晶体，然后用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即化合物1(cytochrysins A，6mg)；
4.两个化合物的理化性质以及结构解析
4.1化合物1(cytochrysins A)的理化性质及结构解析
化合物1为无色晶体，熔点为241.2-243.7℃，在1mg/ml的甲醇溶液中其旋光度为+72℃，在紫外光谱中可以看到其最大紫外吸收波长为205nm(图6)，高分辨质谱测得其分子离子峰m/z 416.2794[M+H]+(图5)，分子式为C25H37NO4。化合物1结构解析所需的核磁数据请参见(图3-图4、表1及表2)。除此之外化合物1在甲醇+水((0.1％)的体系中成功析出了晶体，然后通过X-单晶衍射的方法确定了化合物1的绝对构型，其CCDC(剑桥晶体数据中心)编号为：2053963。
4.2化合物2(cytochrysins B)的理化性质及结构解析
化合物3为白色粉末，在1mg/ml的甲醇溶液中其旋光度为+122℃，在紫外光谱中可以看到其最大紫外吸收波长为210nm(图10)，高分辨质谱测得其分子离子峰m/z 448.3057[M+H]+(图9)，分子式为C26H41NO5。化合物2结构解析所需的全部核磁数据请参见(图7-8、表1及表2)。
表1化合物1和2的1H核磁数据(氘代甲醇，600MHz)
Figure BDA0003014489750000131
Figure BDA0003014489750000141
表2.化合物1和2的13C NMR核磁数据(氘代甲醇，150MHz)
Figure BDA0003014489750000142
Figure BDA0003014489750000151
5.两个化合物的抗临床耐药性细菌活性实验。
5.1将两个目标化合物以及环丙沙星(阳性对照)配制成1mg/ml的浓度。
5.2将目标耐药性细菌(耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌)在LB(溶菌肉汤)培养基中活化8h，活化好后取50ul菌液加入到50ml LB培养基中得到稀释菌液。
LB培养基配制：取25g LB粉末(北京酷来搏公司)，加入1000ml蒸馏水，121℃高压灭菌20min。(该培养基对pH无特殊要求，中性即可)
5.3以环丙沙星为阳性对照，取2ul目标化合物加入到198ul的目标菌液里面，采用二倍稀释法测试两个化合物对以上四种临床耐药性细菌的拮抗活性。
(活性结果见表3)
表3：化合物1和2四种临床耐药性细菌的抑制活性(以环丙沙星为阳性对照)
Figure BDA0003014489750000152
6.结论
实验结果表明，本次实验中发现的两个细胞松弛素类化合物(cytochrysins A，cytochrysins B)系首次发现的新化合物，并且该化合物对耐碳青霉烯铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多耐药性粪肠球菌、多耐药性屎肠球菌四种临床耐药性细菌有很好的拮抗活性(MIC，25μg/mL)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，将金黄壳囊胞菌HYQZ-931的发酵培养；
步骤(2)，采用甲醇提取金黄壳囊胞菌发酵培养得到的次级代谢产物，减压浓缩蒸发掉溶剂后水洗，然后用乙酸乙酯萃取，最后再减压浓缩，得到粗浸膏；
步骤(3)，粗浸膏湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为100∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到六个组分段Fr.A-Fr.F；
步骤(4)，将第四个组分段Fr.D湿法上样至硅胶柱，通过硅胶柱层析法，以体积比为50∶1-1∶1的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂进行梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到四个亚组分段Fr.D1-Fr.D4；
步骤(5)，对第二个亚组分段Fr.D2依次经葡聚糖凝胶色谱分离纯化及高效液相色谱分离纯化得到化合物2；
步骤(6)，对第四个亚组分段Fr.D4采用葡聚糖凝胶色谱分离纯化，收集分离纯化液体后静置，待晶体析出后，用二氯甲烷清洗晶体表面杂质，最后得到纯的晶体化合物，即为化合物1；
其中，化合物2的结构式为：
Figure FDA0003705768560000011
化合物1的结构式为：
Figure FDA0003705768560000012
2.根据权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体方法如下：
(1.1)将金黄壳囊胞菌在PDA平板上活化；
(1.2)已活化的金黄壳囊胞菌菌丝体加入到PDB培养基中，在摇床上恒温振荡培养，制备该菌种种子液；
(1.3)将菌种种子液倒入固体培养基中恒温发酵培养；
所述的固体培养基是将MEB溶液和大米按照体积质量比1：1mL/g的比例配制而成。
3.根据权利要求2所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，(1.1)中，活化时间为3天；(1.2)中，恒温振荡培养的条件为28℃，160rpm，3天；(1.3)中，恒温发酵培养的条件为28℃，30天。
4.根据权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，减压浓缩的压力为-0.1Mpa，温度为-20℃。
5.根据权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为100：1、80：1、50：1、30：1、10：1和1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度；
步骤(4)中，梯度洗脱时，所使用的二氯甲烷和甲醇混合有机溶剂的体积比依次为50：1、20：1、10：1、1：1；每个梯度洗脱到TLC点板无明显主点后即可更换下一个浓度梯度。
6.根据权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，高效液相色谱分离纯化条件为：以体积浓度为70％的乙腈水溶液为流动相，采用安捷伦C18反向色谱柱，规格为：4.6mmx250nm，5um；柱温：30℃；柱流量：1ml/min；每次进样量：20ul；采用紫外检测器，检测波长为210nm， 收集tR＝12.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；
步骤(6)中，静置时间为不少于5d。
7.权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物，其特征在于，该细胞松弛素化合物为化合物1，其结构式为：
Figure FDA0003705768560000031
8.权利要求1所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物，其特征在于，该细胞松弛素化合物为化合物2，其结构式为：
Figure FDA0003705768560000032
9.权利要求7或8所述的具有拮抗临床耐药性细菌功能的新型细胞松弛素化合物在制备抗临床耐药性细菌剂的应用。
10.金黄壳囊胞菌HYQZ-931(Cytospora chrysosperma HYQZ-931)，保藏编号CCTCC M2021279。
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