CN106167494B

CN106167494B - 卤化ii型聚酮类抗生素化合物、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN106167494B
Application number: CN201610390757.5A
Authority: CN
Inventors: 岳昌武; 邵美云; 钱声艳; 吕玉红; 保玉心; 王苗
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2018-08-31
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: CN106167494A

Abstract

本发明公开了一种卤化II型聚酮类抗生素化合物，其特征在于，结构为：本发明要解决的技术问题是提供一种较强的抗耐药金黄色葡萄球菌的卤化II型聚酮类抗生素化合物。

Description

卤化II型聚酮类抗生素化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种卤化II型聚酮类抗生素化合物、制备方法及其应用。

背景技术

抗生素在治疗微生物感染和肿瘤等疾病方面发挥了至关重要的作用，但是由于抗生素的滥用等诸多原因，临床上发现的病原菌耐药性问题越来越严重。例如，近年来世界各地出现多种“超级细菌”，它们对大多数抗生素都产生耐药性，给临床上病原菌感染等疾病的治疗带来巨大的挑战。目前，细菌耐药、二次感染、不良反应、过敏反应等严重威胁着人类健康，如果不尽快采取行动，这可能会给人类带来灾难性后果。因此，鉴于当前日益严峻的抗菌形势，加大抗生素研发力度，探索和研发新抗生素成为当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种较强的抗耐药金黄色葡萄球菌的卤化II型聚酮类抗生素化合物。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:卤化II型聚酮类抗生素化合物，结构为：

该化合物具有Anthrabenzoxocinones型的结构骨架类型。该化合物通过对链霉菌Streptomyces sp菌株(菌株保藏号：CGMCC 4.7321)发酵并分离得到，对***如金黄色葡萄球菌及其耐药菌具有很高的抑制活性，有望成为抗耐药金黄色葡萄球菌药物及其先导化合物而具有良好的药用开发前景。

本发明提供的另一技术方案，卤化II型聚酮类抗生素化合物的制备方法，包括有CGMCC登记号码为CGMCC 4.7321的链霉菌。

本发明提供的另一技术方案，卤化II型聚酮类抗生素化合物的应用，用作抗耐药金黄色葡萄球菌。

附图说明

图1为本发明化合物的红外光谱图；

图2为本发明化合物的高分辨质谱图；

图3为本发明化合物在MeOH-d4中的¹H-NMR谱图；

图4为本发明化合物在MeOH-d4中的¹³C-NMR谱图；

图5为本发明化合物在MeOH-d4中的DEPT谱图；

图6为本发明化合物在MeOH-d4中的HSQC谱图；

图7为本发明化合物在MeOH-d4中的HMBC谱图；

图8为本发明化合物在MeOH-d4中的H-H COSY谱图；

图9为本发明化合物在MeOH-d4中的ROESY谱图；

图10为本发明化合物在MeOH-d4中的CD谱；

图11为化合物的抗耐药金黄色葡萄球菌活性实物图。

所用链霉菌的保藏单位：北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏编号：CGMCC 4.7321；

保藏时间：2016年06月02日。

具体实施方式

卤化天然产物具有结构新颖的特点，使卤化产物成药潜力增大，已经发现已经有6000余种具有结构多样的卤化天然产物。它们中很大一部分具有抗生素的活性。由于卤化产物在对抗耐药菌感染方面有较大的临床应用潜力，如临床上抗感染的万古霉素，替考拉宁以及2014年美国FDA批准上市的抗耐药菌感染抗生素新药达巴万星，奥利万星及泰地唑胺，它们都属于卤化天然产物。

本发明人从一株链霉菌Streptomyces sp.(此链霉菌保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，登记号为：CGMCC 4.7321)次级代谢产物中分离一个Anthrabenzoxocinones类抗生素，经紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱、圆二色谱及核磁共振等波谱数据仔细分析，确定为Anthrabenzoxocinones类的新氯化产物。

CGMCC 4.7321链霉菌：

1)、生物学命名、分类依据：

经16S rRNA保守引物(27f/1492r)扩增，测序并在线比对分析和参考菌株Streptomyces sparsogenes strain NBRC 13086的同源性为99％，初步分类为链霉菌。

命名为：链霉菌Streptomyces sp.

2)、保藏单位：北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

3)、保藏编号：CGMCC 4.7321；

4)、保藏时间：2016年06月02日；

5)、保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号：中国科学院微生物研究所；

6)、特征：

i.气生菌丝发达，米黄色菌落，边缘粗糙，有皱褶；孢子数目偏少；mol％G+C＝73％。

分离培养基：

ii.固体GYM(ISP2)：葡萄糖4g，麦芽抽提物4g，酵母粉10g，碳酸钙2g，琼脂粉18g，加水至1000毫升，灭菌。

iii.建议培养条件：

固体GYM培养基：最适培养温度28℃，建议培养时间：4天。

iv.16s RNA序列为：

TGCAGTCGAACGATGAAGCCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCTTACTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGtGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAaGgAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACATCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGAGGGAGTC。

7)、分离地点：

贵州省梵净山自然保护区(海拔高度800m，东经108°47′50″，北纬27°56′32″)。以下为本发明抗生素化合物的具体制备方法、化合物的确认及其应用的确定。

以下为本发明抗生素化合物的具体制备方法、化合物的确认及其应用的确定。

一、本发明的抗生素化合物的制备方法为：

1、发酵培养

将生长斜面的链霉菌Streptomyces sp菌株接种于种子培养基，种子培养基为GYM固体培养基，(GYM固体培养基的制备方法为：用葡萄糖4g、麦芽抽提物4g、酵母粉10g、碳酸钙2g、微量元素预混液0.5mL和1.8％琼脂粉(w/v)，加入去离子水定容到1.0L，121℃高压灭菌30min制成)，28℃培养48小时，然后接种到发酵培养基(配方与种子培养基相同)，在28℃培养17天。

2、提取分离

将上述的发酵培养基连同菌体捣碎，加入乙酸乙酯在旋转摇床(160rpm)提取24小时，连续提取三次，利用旋转蒸发仪在45℃回收乙酸乙酯溶剂，得到发酵物粗提物32g。

发酵物粗提物32g，正相硅胶柱层(硅胶100-200目，1.5Kg硅胶颗粒)，洗脱溶剂氯仿：丙酮(100％、95％、90％、80％、67％、50％、33％、0％)依次洗脱，将氯仿-丙酮为80％(v/v)的洗脱部分再经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析，100％甲醇洗脱得到的组分Ⅰ再经过硅胶柱层析(100-200目)，石油醚：乙酸乙酯(v/v)洗脱，依次按以上顺序洗脱，石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝10：1的洗脱部分再经过HPLC 95％甲醇等度洗脱制备得化合物。

二、化合物的结构鉴定

为浅黄色粉末，易溶于甲醇，二甲亚砜等有机溶剂，如图1所示，化合物的红外光谱显示，其红外吸收3385cm^-1和1609cm^-1表明该化合物有羟基及羰基基团存在，此外红外吸收峰1421^-1cm及1384cm^-1，该化合物还含有苯环结构；

如图2所示，化合物的高分辨质谱显示，其高分辨负离子峰荷质比527.0658和529.0652，暗示该化合物有分子式为C₂₇H₂₂Cl₂O₇，不饱和度为16。

如图4、图5、图6所示，在¹³C NMR和DEPT谱以及HSQC谱中显示，该化合物具有三个苯环，其碳质子吸收信号分别为160.6，157.7，152.6，151.8，150.7，150.7，150.4，141.2，133.4，122.5，117.2，115.7，113.6，113.6，111.2，107.2，106.3和101.7；此外该化合物还含有一个羰基基团，其信号在189.7；一个亚甲基(δ_C：39.4)；四级碳原子(δ_C：38.1，98.4)；如图3所示，结合¹³H NMR核磁谱中化合物具有三个苯环单峰氢质子信号[δ_H：6.82(1H,s),6.57(1H,s),6.17(1H,s)]；四个甲基峰信号[2.41(3H,s),1.51(3H,s),1.45(3H,s),1.36(3H,s)]；结合文献调研表明该化合物具有ABX聚型骨架。该化合物与ABX骨架不同在于，它苯环上的两个氢质子被氯原子取代。

如图7、图8所示，HMBC谱和H-H COSY谱图上，氢信号6.82(1H,s)与碳信号111.2和122.5相关，证明该质子连接在ABX骨架的C-8位；δ_H 6.57(1H,s)与δ_C 106.3相关。

如图9所示，在ROSEY谱图上，δ_H 6.57(1H,s)和两个甲基氢质子信号1.36和1.45相关可以确定该氢质子是连接在C-10位；δ_H 6.17(1H,s)与δ_C 113.6，115.7，133.4，150.7和152.6相关，证明了质子6.17(1H,s)连接在C-4位上；最后质子信号6.10(1H,s)有一个关键相关信号，它与碳信号98.4相关确定该质子连接在C-16位上。综合以上信息，可以确定氯原子在苯环上取代位置，2个氯原子分别取代了4以及12位上的氢原子，得到了该化合物的平面结构。

如图10所示，通过CD谱图可以确定化合物的绝对构型，CD谱图显示在239nm及283nm具有明显的正科顿效应，根据陈海燕等人的报道，表明该化合物C-16及C-6构型为S，由此确定该化合物的结构为：和化合物在MeOH-d4中的NMR数据如表1所示。***命名该化合物为：(6s,16s)-4,12-dichloroanthrabenzoxocinone，由于此化合物为本发明人的首次发现，因此，发明人将次化合物命名为zunyimycin B。其二维立体表示为：

表1

三、化合物的应用确定

采用纸片法对命名为zunyimycin B的该化合物进行抗菌活性测试，以耐药鲍曼不动杆菌、耐药大肠杆菌、耐药肺炎克雷伯杆菌、耐药金黄色葡萄球菌为测活菌，甲醇和丙酮为阴性对照。结果如图11所示，2为本发明的化合物，1、3为其他两种化合物；4为丙酮；5为甲醇，表明，本发明的化合物均对耐药金黄色葡萄球菌具有抑制作用，抑菌圈直径为1.3mm。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims

1.卤化II型聚酮类抗生素化合物，其特征在于，结构为：

2.根据权利要求1所述的卤化II型聚酮类抗生素化合物在制备抗耐药金黄色葡萄球菌的药物中的应用。