CN113234641A - 一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌s77及其应用 - Google Patents

一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌s77及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用。本发明的芽孢杆菌S77，拉丁文名称为：Bacillus S77，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021528。本发明的菌株具有很好的耐低温、耐酸、耐胆碱、耐胃液、耐肠液能力；具有很好粘附能力；对抗生素敏感的特性，无耐药性，保证其安全；还具产蛋白酶的能力和耐低温的能力，有望作为益生菌应用到生物发酵饲料生产中。

Description

一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用。
背景技术
益生菌也称益生素，是能够对动物产生有益作用的微生物制剂。益生菌作为动物饲料的添加剂使用，具有促生长、抗病治病、提高饲料消化率等功能。理想的益生菌应当具有如下功效：(1)对酸、胆盐有抵抗力，经过胃、小肠时能保持自身的活性，即能够耐酸、耐胆盐、耐肠液、耐胃液的能力。(2)能够附植于肠道的黏膜上皮细胞，产生的黏液有利于其在胃肠道的定植。即具有一定的粘附能力。(3)对抗生素敏感，无耐药性，不可能将其携带的耐药基因水平传达给肠道中的致病类菌，导致肠道中的致病类菌获得耐药性，保证其安全性。但是现有技术并未发现这样一株同时具有以上功效的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株同时具有耐酸、耐胆盐、耐肠液、耐胃液，具有粘附能力，抗药能力的菌株来满足现有技术的不足。具体为一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株芽孢杆菌S77，拉丁文名称为：Bacillus S77，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021528。
作为优选，所述芽孢杆菌S77的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备耐低温产品方面的应用
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备耐酸产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备耐胆碱产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备耐胃液产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备耐肠液产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备具有粘附性能的产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备无耐药性产品方面的应用。
本发明还提供了所述的芽孢杆菌S77在制备产蛋白酶产品方面的应用。
本发明提供了一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用，本发明的芽孢杆菌S77具有如下优点：
(1)本申请的芽孢杆菌S77具有很好的耐低温、耐酸、耐胆碱、耐胃液、耐肠液能力，经过胃、小肠时能保持自身的活性；
(2)本申请的芽孢杆菌S77还具有很好粘附能力，能够附植于肠道的黏膜上皮细胞，产生的黏液有利于其在胃肠道的定植；
(3)本申请的芽孢杆菌S77还具有对抗生素敏感的特性，无耐药性，不可能将其携带的耐药基因水平传达给肠道中的致病类菌，导致肠道中的致病类菌获得耐药性，保证其安全性；
(4)本申请的芽孢杆菌S77还具产蛋白酶的能力；
(5)本申请的芽孢杆菌S77还具耐低温的能力；
(6)本发明的芽孢杆菌S77更适宜作为益生菌应用到生物发酵饲料生产中。
附图说明
图1为菌落形态图。
图2为菌株革兰氏染色结果图。
图3为菌株16S rDNA基因扩增图。
图4为菌株***发育树。
图5为菌株耐10℃低温培养24h结果图。
图6为菌株耐酸柱状图。
图7为菌株耐胆盐柱状图。
图8为菌株耐胃液柱状图。
图9为菌株耐肠液柱状图。
图10为菌株对抗生素敏感结果图。
保藏说明
芽孢杆菌S77，拉丁文名称为：Bacillus S77，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCCNO：M2021528。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1菌株的分离、鉴定
称取5g来自河北省承德市围场满族蒙古族自治县番茄杆，加入到装有50ml无菌水的试管中，作为稀释度为10-1的样品稀释液，再逐次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6次，每个稀释度各取100μl，涂布于LB固体培养基上37℃恒温培养48h。挑取菌落，连续划线分离纯化，最后选择单菌落，菌落形态如图1所示。镜检确认为纯种后，接种到斜面培养基培养24h后，置4℃冰箱保存备用。
将鉴定为纯种的菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定，革兰氏染色结果如图2，生理生化结果如表1所示。
表1 S77生理生化鉴定结果
Figure BDA0003125121230000031
提取菌株DNA，并进行16S rDNA扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。将扩增得到的16S rDNA送至大连美仑生物技术有限公司进行测序，测序结果如SEQID NO.1所示。
然后对测序结果进行比对，构建***发育树，鉴定菌株的种属关系。***发育树结果如图4所示。
所述LB固体培养基包括如下浓度的组分：蛋白胨1g/L，酵母粉0.5g/L，氯化钠0.5g/L，琼脂15g/L。
所述LB固体培养基的pH值为7.3。
图1所示的菌落为乳白色，直径5mm，表面光滑，边缘呈不规则状，中央稍稍突起。
镜检形态为短杆状，(1～1.3)μm×(1～1.6)μm，单个、成对、短链排列，将分纯菌株命名为S77。
图2显示，革兰氏染色为阳性，好氧。
图4显示，S77菌株与芽孢杆菌(Bacillus)的同源性为99.43％。
最终将本申请分离到的菌株鉴定为芽孢杆菌S77。
实施例2菌株耐低温实验
将菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按1％的接种量分别接种于10mlLB液体培养基，于10℃、15℃、25℃、30℃、37℃、44℃恒温培养24h后，分别在600nm波长下测定其吸光值，做3个平行求平均值。结果如表2所示，10℃培养24h，菌体生长情况如图5所示。
表2芽孢杆菌耐低温试验结果
Figure BDA0003125121230000041
结果表明：菌株在低温10℃可以生长，15℃时菌体生长良好，最适温度为25℃，菌株S77是一株低温芽孢杆菌，用于低温环境中，能更好的发挥作用。
实施例3菌株耐酸实验
将菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入pH值分别为1、2、3的LB液体培养基内，37℃静置培养，分别于0、1、2和3h从中吸取菌悬液，进行梯度稀释，涂布至对应的固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养48h，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。得到菌株对酸的耐受力，结果见图6。
图6显示，菌株具有较好的耐酸性，在pH3.0的条件菌体出现生长现象，pH2.0、pH1.0时，随着培养时间的延长，菌株的存活率有所下降。
实施例4菌株耐胆盐实验
将菌株活化后制成菌体浓度为108cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量分别接入胆盐浓度为0.3、1.5、3g/L的LB液体培养基中，37℃静置培养，分别于0、3h从中吸取菌悬液，进行梯度稀释，涂布至对应的固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养48h，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。计算菌株对胆盐的耐受能力，耐受结果见图7。
所述菌株对胆盐的耐受力的计算公式为：胆盐耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：3h含胆盐培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h含胆盐培养基的活菌数(cfu/ml)。
图7显示：菌株S77在低浓度胆盐中出现了菌体生长的情况，菌株耐受能力可达138.75％，随着胆盐浓度的增加，菌株耐受能力略有下降，3h时仍为89.11％，具有较好的耐胆盐能力。
实施例5菌株耐人工胃液实验
菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入人工胃液中，分别于0、2、4h从中吸取菌悬液，进行10倍梯度稀释，涂布至LB固体培养基上，37℃倒置培养，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值。计算菌株对人工胃液的耐受力。耐受结果见图8。
菌株对人工胃液的耐受力的计算公式为：人工胃液耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：各时间段培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h培养基的活菌数(cfu/ml)。
所述人工胃液的配置方法为：取20％盐酸16.4mL，pH值调至3.0。然后加入胃蛋白酶(颗粒)，使其浓度为0.01g/mL，待其充分溶解后，用0.22μm规格的微孔膜过滤除菌，即得。
图8显示：菌株随着培养时间的增加，存活率出现了一定程度的下降，在4h时，存活率为71.16％，表明菌株具有良好的耐胃液能力。
实施例6菌株耐人工肠液实验
菌株活化后制成菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，按4％的接种量接入人工肠液中，分别于0、4、8h从中吸取菌悬液，进行10倍梯度稀释，涂布至LB固体培养基上，37℃倒置培养，选取菌落数30～300之间的平板进行计数，3个平行求平均值，计算菌株对人工肠液的耐受力。耐受结果见图9。
菌株对人工肠液的耐受力的计算公式为：人工肠液耐受力(％)＝Nt/N0×100％。
式中:Nt：各时间段培养基活菌数(cfu/ml)；
N0：0h培养基的活菌数(cfu/ml)。
所述人工肠液的配置方法为：加入胰蛋白酶(颗粒)，使其的浓度为0.01g/mL，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.22μm规格的微孔膜过滤除菌，即得。
图9显示：菌株在人工肠液中出现了菌体生长现象，随着培养时间的延长，存活率出现了先降后升的情况，但存活率一直保持90％以上，在8h时，存活率可达93.34％，表明菌株具有优秀的耐肠液能力。
实施例7菌株粘附性能实验
采用碳烃化合物法(MATH)。分别取2mL活化后菌体浓度为107cfu/ml的菌悬液，8000r/min离心10min，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤菌体3次后，将菌重悬，调整菌悬液的OD600为0.8。在试管内加入4mL菌悬液、1mL正己烷，对照组不加正己烷，封口，用旋涡振荡仪剧烈振荡60s，静置15min至液体分层。吸取下相水溶液3.0mL，用PBS缓冲液对分光光度计进行调零矫正后，600nm波长下测定其吸光值，细菌细胞表面疏水性(cell-surfacehydrophobicity,CSH)按公式计算：
Figure BDA0003125121230000061
式中：A0为对照组OD值；AS为实验组OD值。
结果见表3。表3显示，S77有很好的表面聚集性，能较好黏附到肠道上皮细胞和黏膜表面上，得以发挥其益生功效。
表3芽孢杆菌的表面疏水性和表面凝集性
菌株(strain) 疏水性(hydrophobic)％ 聚集性(clustering)％
S77 60.89±1.01 72.27±0.52
实施例9菌株耐抗生素实验
采用K-B(药敏纸片琼脂扩散法)进行药敏试验来评价菌株的抗生素耐药性。取菌体浓度为108cfu/ml的芽孢杆菌S77的种子液100μL，接种于40℃的LB固体培养基中，混匀倒平皿。待培养基冷却凝固后，将药敏纸片均匀平贴于LB固体培养基表面。将贴好药敏纸片的平板分别放置于37℃培养箱中培养48h，用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径(D)大小。抗药结果见图10和表4。
所用的药敏纸片中各抗生素的含量为：阿米卡星(30μg)、CTR(30μg)、TE四环素(30μg)、CFP头孢哌酮(75μg)、DX多西环素(30μg)、N新霉素(30μg)、P青霉素(10μg)、GM庆大霉素(10μg)、CZ头孢噻肟(30μg)、美满霉素(30μg)、氧氟沙星(5μg)、E红霉素(15μg)。
表4芽孢杆菌抗药性结果
Figure BDA0003125121230000071
表中所述的S表示敏感，I表示中介，R表示耐药。
结果表明：菌株S77对常用抗生素青霉素表现为耐药，对庆大霉素表现为相对耐药，对其余抗生素均表现出敏感，敏感率、抗药率和中介率分别为83.33％、8.33％、8.33％。由此可知，菌株作为益生菌添加入动物饲料是安全的，菌株S77无耐药基因，不可能将其携带的耐药基因水平传达给肠道中的致病类菌，导致此类菌获得耐药性。
实施例10菌株产蛋白酶活性测定
从S77菌种斜面中挑取菌体接种于10ml LB肉汤培养基中培养24h作为菌种液。将菌种液点种在酪蛋白选择培养基上37℃培养72h，最后测定平板上水解圈直径D(mm)，每组处理3个重复。菌液酶活性参照SB/T 10317-1999“蛋白酶活力测定法”进行测定。结果见表5。
表5菌株S77产蛋白酶活力测定
菌株名称 水解圈直径(mm) 蛋白酶活力(u/g)
S77 24.2 767.27
由以上实施例可知，本发明提供了一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用，本发明的芽孢杆菌S77具有如下优点：
(1)本申请的芽孢杆菌S77具有很好的耐低温、耐酸、耐胆碱、耐胃液、耐肠液能力；
(2)本申请的芽孢杆菌S77还具有很好粘附能力，有利于其在胃肠道的定植；
(3)本申请的芽孢杆菌S77还具有对抗生素敏感的特性，无耐药性，保证其安全性；
(4)本申请的芽孢杆菌S77还具产蛋白酶的能力；
(5)本申请的芽孢杆菌S77还具耐低温的能力；
(6)本发明的芽孢杆菌S77更适宜作为益生菌应用到生物发酵饲料生产中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北民族大学
<120> 一株耐低温、产蛋白酶的芽孢杆菌S77及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggattgagaa gcttgctctc aagaagttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 60
ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata acattttgaa 120
ctgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc 180
attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 240
gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactac tacgggaggc agcagtaggg 300
aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc 360
gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg 420
acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg 540
atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag 600
aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca 660
gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt 780
ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggccgca 840
aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgaaaaccc tagagatagg 960
gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca tcattaagtt 1080
gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1140
tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa agagctgcaa 1200
gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact 1260
cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgaggaag tttgtaaaca cccggagagt 1380
cggtggggta aacctttatg 1400

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌S77，其特征在于，拉丁文名称为：Bacillus S77，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2021年5月13日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021528。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌S77，其特征在于，所述芽孢杆菌S77的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备耐低温产品方面的应用。
4.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备耐酸产品方面的应用。
5.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备耐胆碱产品方面的应用。
6.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备耐胃液产品方面的应用。
7.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备耐肠液产品方面的应用。
8.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备具有粘附性能的产品方面的应用。
9.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备无耐药性产品方面的应用。
10.权利要求1或2所述的芽孢杆菌S77在制备产蛋白酶产品方面的应用。
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