CN104357359A - 一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术 - Google Patents

一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术 Download PDF

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CN104357359A CN201410642107.6A CN201410642107A CN104357359A CN 104357359 A CN104357359 A CN 104357359A CN 201410642107 A CN201410642107 A CN 201410642107A CN 104357359 A CN104357359 A CN 104357359A
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刘慧�
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Abstract

本发明涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的制备方法，适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂的生产。本发明利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029，经活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明使用油菜籽蛋白胨全部替代了改良MRS培养基中的氮源，降低了生产成本，并通过优化生产发酵条件和冻干保护剂配方，使KL1-Liu菌株的活菌数量可达1010CFU/g以上，存活率达到85％以上。本发明制备的活菌制剂，价格低廉，活菌含量高，为优质的具有降血清胆固醇作用的益生活菌制剂/发酵剂。

Description

一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术
技术领域
本发明涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的生产技术，适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂、功能性食品、功能性发酵食品的生产。 
背景技术
本发明涉及的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu是从藏灵菇中分离筛选得到的一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇作用的乳酸菌。 
“藏灵菇”(Tibetan Kefir，TK)又称开菲尔粒，19世纪被人类发现。开菲尔粒起源于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和起泡性的保健饮料，即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的活菌对志贺氏菌、沙门氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用；其中的酵母菌对结核杆菌、大肠杆菌有较强抗菌活性。故开菲尔对肠道疾病、肺结核有很好疗效。此外，开菲尔中的乳酸菌产生的代谢产物，如胆盐水解酶、胞外多糖等能有效预防高血脂症和肿瘤的发生。 
在藏灵菇的黏多糖基质中微生物菌相主要以乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌为基础的小生态系。本发明所用副干酪乳杆菌KL1-Liu是从藏灵菇中分离筛选得到的一种益生乳酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明具有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于副干酪乳杆菌KL1-Liu代谢产生的胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)。BSH是肠道中的双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明，胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。 
早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。 
目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如江苏省微生物研究所有限责任公司唐宝英和朱晓慧申请的“酪酸菌活菌制剂及其制备方法”(CN101032527)是由酪酸菌制备的***两用活菌制剂；上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的“双歧三联活菌制剂及制备方法”(CN98110623.4)是由两 歧双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干燥活菌粉；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是球菌、酵母菌和芽孢杆菌分别液体扩大培养，然后按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂。但关于利用分离筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌KL1-Liu制备活菌制剂，利用自动发酵罐高密度发酵，以及利用油菜籽蛋白胨完全替代改良MRS培养基中氮源的方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。 
发明内容
本发明的目的是提供一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的生产技术。 
本发明是通过以下技术方案实现的： 
所述方法中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.7029(菌株KL1-Liu)，保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu菌株的菌落大小2～3mm，菌落有较高黏性，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，G+无芽孢杆菌。 
所述方法中，将脱脂乳试管保种的副干酪乳杆菌KL1-Liu菌株以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代后，冷藏备用。 
所述方法中，改良MRS培养配方组成：将MRS培养基中的10g蛋白胨以5g乳酪蛋白水解物和5g胰蛋白胨替代，其他成分不变，调节pH为6.5。 
所述方法中，采用单因素试验优化改良MRS培养基，优化的501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、蒸馏水1 000mL，调节pH为7.0(灭菌后pH降至6.5)。 
所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液以3％(V/V，体积分数)的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，采用四因素三水平正交试验优化小试发酵条件。将2L 501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基加入到5L全自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌***于115℃灭菌20min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将副干酪乳杆菌KL1-Liu菌株的扩大培养液按4％(V/V，体积分数)的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温***维持发酵温度为34℃，发酵过程中以流加10％(W/V，质量体积比浓度)的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH6.5，搅拌转速为90r/min，发酵16h，得到发酵液。 
上述方法中，5L发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为BIOF6005GBN。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离心机将2L发酵液于4℃条件下，4000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥。 
所述方法中，立式高速冷冻离心机由湘仪离心机仪器有限公司提供，型号为GL-21M。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥平均加入2只盛有100mL的冻干保护剂(14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉)的冻干瓶中，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。 
上述方法中，采用单因素多水平试验，确定副干酪乳杆菌KL1-Liu的冻干保护剂较优组合配方为(W/V，质量体积比浓度)：14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉(伊利牌高蛋白高钙脱脂奶粉)。 
所述方法中，将浓缩活菌制剂于-30℃低温冰箱中预冻13h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.13mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用50L发酵罐进行中试发酵试验，将25L 501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基加入到50L全自动发酵罐中，采用发酵罐灭菌***于115℃灭菌20min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将副干酪乳杆菌KL1-Liu菌株的扩大培养液按4％(V/V，体积分数)的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温***维持发酵温度为34℃，发酵过程中以流加20％(W/V，质量体积比浓度)的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH6.5，搅拌转速为140r/min，发酵16h，得到发酵液。 
上述方法中，50L发酵罐由上海国强生化工程装备有限公司提供，型号为BIOTECH。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用高速管式离心机将25L发酵液于3～6℃条件下，16000r/min离心10～20min，收集得到菌泥。 
上述方法中，管式离心机由上海市离心机械研究所有限公司提供，型号为GQ105G。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥加入2500mL的冻干保护剂(14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉)的冻干机中，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。 
所述方法中，利用四环真空冷冻干燥机将浓缩活菌制剂于-55℃预冻17h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。 
所述方法中，在上述试验结果基础上，利用四环真空冷冻干燥机将预冻活 菌制剂于冻干温度-66℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干72h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。 
上述方法中，四环真空冷冻干燥机由四环科学仪器厂有限公司提供，型号为LGJ-25C。 
所述方法中，采用小试和中试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的活菌数量均可达到1010CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。此种活菌制剂由于培养基采用油菜籽蛋白胨完全替代了改良MRS培养基中的氮源，使产品生产成本降低，活菌含量较高。 
上述方法得到的501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方和产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的小试与中试发酵生产技术及冻干工艺，以及专用生产菌株属于本发明保护范围。 
具体实施方式
下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。 
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。 
实施例1、产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的小试生产技术 
1、菌种的活化和扩大培养 
将MRS试管保种的副干酪乳杆菌KL1-Liu菌株以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代，冷藏备用；将活化好的菌液以3％的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液。 
2、发酵培养基的确定 
(1)不同质量品质的油菜籽蛋白胨替代改良MRS部分氮源试验 
分别用501油菜籽蛋白胨、502油菜籽蛋白胨和503油菜籽蛋白胨代替改良MRS培养基中的胰蛋白胨，将活化好的菌种按4％的接种量分别移种至上述培养基中，于34℃发酵16h后，采用MRS培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，确定较优油菜籽蛋白胨氮源替代品，结果见表1。 
(2)油菜籽蛋白胨替代改良MRS不同氮源试验 
在上述试验较优的油菜籽蛋白胨替代改良MRS培养基中胰蛋白胨的基础上，再分别替代牛肉膏、酵母浸粉、牛肉膏+酵母浸粉，以上述同样条件发酵、计数，分析比较用较优油菜籽蛋白胨分别替代改良MRS中不同氮源时的发酵液的活菌数量，结果见表2。 
(3)不同用量的油菜籽蛋白胨替代改良MRS全部氮源试验 
在上述试验结果基础上，以1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％的较优油菜籽蛋白胨分别替代改良MRS全部氮源，以上述同样条件发酵、计数，通过比较不同用量较优油菜籽蛋白胨替代改良MRS中全部氮源时发酵液的活菌数量，确定较 优油菜籽蛋白胨的用量，结果见表3。 
表1 不同油菜籽蛋白胨替代改良MRS部分氮源发酵培养基对副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌数量的影响 
由表1可知，以501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基发酵时，活菌数量较高，达1.53×109CFU/mL，采用502油菜籽蛋白胨改良MRS培养基时的活菌数量次之，为1.45×109CFU/mL，采用503油菜籽蛋白胨改良MRS培养基时的活菌数量为1.43×109CFU/mL，而采用改良MRS培养基的活菌数量最低，故确定较优油菜籽蛋白胨氮源替代品为501油菜籽蛋白胨。 
表2 501油菜籽蛋白胨替代改良MRS不同氮源对副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌数量的影响 
由表2可知，以501油菜籽蛋白胨替代牛肉膏和酵母浸粉改良MRS培养基发酵时，活菌数量较高，达5.61×109CFU/mL，替代牛肉膏改良MRS培养基时发酵的活菌数量次之，为5.13×109CFU/mL，替代酵母浸粉改良MRS培养基时发酵的活菌数量为4.21×109CFU/mL，故确定501油菜籽蛋白胨替代牛肉膏和酵母浸粉的改良MRS培养基为最优。 
表3 不同用量的油菜籽蛋白胨替代改良MRS全部氮源对副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌数量的影响 
由表3可知，采用2.5％501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基培养活菌数量较高，达5.51×109CFU/mL，采用3％501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基培养活菌数量次之，为5.03×109CFU/mL，采用2.0％501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基培养活菌数量为4.42×109CFU/mL，故确定2.5％501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基为 最优培养基。 
3、正交试验优化副干酪乳杆菌KL1-Liu小试发酵条件 
根据单因素多水平试验结果，选择发酵温度、发酵时间、发酵接种量、发酵pH为影响因素，设计四因素三水平[L9(34)]正交试验。在5L自动发酵罐中，以2L 501油菜籽蛋白胨改良MRS为发酵培养基，在分批发酵过程中以流加10％(W/V，质量体积比浓度)的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH6.5，搅拌转速为90r/min，采用MRS培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，结果见表4。 
表4 副干酪乳杆菌KL1-Liu发酵条件优化正交试验结果 
由表4极差分析可知，对发酵液的活菌数影响因素的顺序为：RB＞RA＞RC＞RD，即发酵时间影响最大，发酵温度次之，发酵接种量、发酵pH影响最小；由K值直观分析得出分批发酵条件的最优组合为A1B3C2D2，即优化发酵条件为：发酵温度为34℃，发酵时间为16h，接种量为4％，pH为6.5。 
4、高密度发酵 
将2L 501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基加入5L自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌***于115℃灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将KL1-Liu菌株的扩大培养液按4％的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐控温***维持发酵温度为34℃，发酵过程中以流加10％的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液的pH为6.5，搅拌转速为90r/min，发酵16h，得到活菌数在109CFU/mL以上的发酵液。 
5、离心浓缩与加入保护剂 
按上述离心前发酵液1/10体积的量，分别将表5中不同组合的冻干保护剂分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为100mL；取1L发酵液于4℃、4000r/min离心20min，弃上清液，收集菌泥，并与冻干保护剂混合均匀，得到浓缩活菌制剂。采用MRS培养基以倾注平板培养法检测冻干前的制剂活菌数量，每个稀释度设3次重复，结果见表5，以确定冻干保护剂较优组合配方。 
6、预冻和冻干 
将浓缩活菌制剂于-30℃预冻13h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制剂于-55℃、真空度0.13mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。采用MRS培养基以倾注平板培养法检测冻干后的制剂活菌数量，计算菌种存活率，每个稀释度设3次重复，结果见表5。 
表5 不同组合的冻干保护剂对副干酪乳杆菌KL1-Liu存活率的影响 
由表5可见，选取冻干保护剂组合为14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉，副干酪乳杆菌KL1-Liu存活率最高，为85.27％；5.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉为冻干保护剂时，菌种存活率次之，为78.00％；以11％脱脂奶粉为冻干保护剂时，菌种存活率最小为55.36％。故确定副干酪乳杆菌KL1-Liu的冻干保护剂较优组合配方为(W/V，质量体积比浓度)：14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉，其活菌数量可达1010CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。 
实施例2、产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的中试生产技术 
1、中试发酵验证试验 
根据正交试验优化结果进行中试发酵验证试验。在50L自动发酵罐中以25L501油菜籽蛋白胨改良MRS为发酵培养基，分批发酵过程中以流加20％的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH值，搅拌转速控制140r/min。以改良MRS培养基为发酵培养基，同时以不控制发酵液pH(自然)作为对照组。采用MRS培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，结果见表6。 
表6 中试发酵验证试验结果 
由表6可知，在优化条件下进行发酵，发酵液活菌数达8.50×109CFU/mL，为优化前(2.6×108CFU/mL)活菌数的32.69倍。 
2、离心浓缩与加入保护剂 
利用高速管式离心机将25L发酵液于3～6℃条件下，16000r/min离心10～20min，收集得到菌泥；将收集的菌泥加入2500mL的冻干保护剂(14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉)的冻干机中，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。 
3、预冻和冻干 
利用四环真空冷冻干燥机将浓缩活菌制剂于-55℃预冻17h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用四环真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于冻干温度-66℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干72h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。其活菌数量可达1010CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。 
综上所述，产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的小试生产技术：将副干酪乳杆菌KL1-Liu以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代；将活化好的菌液以3％的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液；501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7.0；将上述扩大培养液按4％的接种量移种至2L 501油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34℃，发酵液pH6.5，搅拌转速90r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于4℃、4000r/min离心20min，收集得到菌泥；在600mL灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量(200mL)，加入14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将每个冻干瓶装量为100mL的浓缩发酵剂于-30℃预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55℃、真空度0.13mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。 
产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu活菌制剂的中试生产技术：将副干酪乳杆菌KL1-Liu以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代；将活化好的菌液以3％的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液；501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠 5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、蒸馏水1 000mL，调节pH为7.0；将上述扩大培养液按4％的接种量移种至25L 501油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基中，利用50L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34℃，发酵液pH6.5，搅拌转速140r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于3～6℃条件下，16000r/min离心10～20min，收集得到菌泥；在冻干托盘中按离心前发酵液1/10体积的量(2500mL)，加入14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发酵剂于-55℃预冻17h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用北京四环真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于-66℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干72h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。 
采用上述小试和中试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的活菌数量均可达到1010CFU/g以上，菌种存活率可达85％以上。该活菌制剂生产工艺简单，原料价格低廉，成本较低，活菌数量较高，适于工业化生产。本发明得到的产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂，既可以作为生产益生菌酸奶的发酵剂，使产品不仅口感黏稠细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味，而且具有降低血清胆固醇的功效，又可以生产食用复合益生菌片，以及饲用复合微生态制剂等发酵产品。 
本专利所属项目1：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究” 
项目编号：5062006 
项目起止时间：2006.01-2008.12 
项目负责人：刘慧 
本专利所属项目2：科技部农业科技成果转化资金项目“利用藏灵菇源产胆盐水解酶乳酸菌生产功能性酸奶技术转化” 
项目编号：2013GB2A000006 
项目起止时间：2013.09-2015.08 
项目负责人：白永强 
本专利所属项目3：科技部国家科技重大专项“抗病转基因羊新品种培育”子课题“抗病转基因羊扩繁体系的建立/抗病转基因羊抗病、生产性能及安全评价” 
项目编号：2013ZX08008-005 
项目起止时间：2013.01-2013.12 
项目负责人：刘慧 。 

Claims (3)

1.副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029。
2.一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029菌株小试生产干粉活菌制剂的方法，其特征在于：将副干酪乳杆菌KL1-Liu以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代；将活化好的菌液以3％的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液；501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-80 1mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7.0；将上述扩大培养液按4％的接种量移种至2L 501油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34℃，发酵液pH6.5，搅拌转速90r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于4℃、4000r/min离心20min，收集得到菌泥；在600mL灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量(200mL)，加入14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将每个冻干瓶装量为100mL的浓缩发酵剂于-30℃预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55℃、真空度0.13mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。
3.一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029菌株中试生产干粉活菌制剂的方法，其特征在于：将副干酪乳杆菌KL1-Liu以改良MRS培养基于37℃培养16h，如此活化2～3代；将活化好的菌液以3％的接种量移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37℃培养16h，得到扩大培养液；501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g、吐温-801mL、蒸馏水1000mL，调节pH为7.0；将上述扩大培养液按4％的接种量移种至25L 501油菜籽蛋白胨改良MRS发酵培养基中，利用50L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34℃，发酵液pH6.5，搅拌转速140r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于3～6℃条件下，16000r/min离心10～20min，收集得到菌泥；在冻干托盘中按离心前发酵液1/10体积的量(2500mL)，加入14.5％麦芽糊精+5.5％脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将浓缩发酵剂于-55℃预冻17h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂；利用北京四环真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于-66℃、真空度0.08mBar的条件下，冻干72h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂。
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