CN113234625B - 一株皮特不动杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株皮特不动杆菌及其应用，本发明涉及一株皮特不动杆菌及其应用。本发明的目的是为了提供一株降解2,2’,4,4’‑四溴联苯醚的皮特不动杆菌，本发明一株皮特不动杆菌为皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)GB‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2021年1月19日，保藏编号为CCTCCNo.M2021107。本发明筛选的菌株皮特不动杆菌GB‑2可用于被BDE‑47污染的水体和土壤的生物修复，具有较高的应用价值。本发明应用于环境微生物技术领域。

Description

一株皮特不动杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株皮特不动杆菌及其应用。
背景技术
多溴联苯醚(PBDEs)是持久性有机污染物的一种，作为一种重要的添加型阻燃剂被广泛应用于各种行业，如塑料、电子电器、家具、室内装饰、交通、石油和采矿等领域，并且在各种环境介质中被检出。PBDEs共有209种同系物，2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)虽不是环境中含量最多的PBDEs同系物，但却是分布最广、在生物体中含量最高、对人体和动物毒性最强的PBDEs之一。BDE-47不仅具有高度亲脂性、持久性、生物蓄积性、可迁移性，还可随着食物链在生物体和人体内富集，对生物具有毒害作用。因此，研究BDE-47的生物降解可加快降解，对于保护环境健康和降低人类安全风险具有重要意义。
由于BDE-47的长期使用，以及近年来含BDE-47的各种电子垃圾的非法拆解，导致其通过挥发、沉降等方式随降水、地表径流渗入土壤。目前，国内外对于降解BDE-47主要采用的方法有光降解法、植物降解法、生物降解法及零价铁还原法，在诸多的降解技术方法研究过程中，微生物降解因具有效果显著、技术成本低且无二次污染等特点，被认为是当前最具有前景的手段之一。
微生物降解是指在微生物作用下，大分子有机物转变成小分子化合物、有机物彻底分解转化为二氧化碳和水，被认为是环境中去除持久性有机污染物的主要途径。目前所获得的微生物中，能够降解BDE-47的微生物并不多且降解效果不显著，针对于此，筛选BDE-47的高效降解菌是对BDE-47污染进行环境治理和修复研究的热点问题，从而为降低和消除BDE-47污染土壤问题奠定基础。
发明内容
本发明的目的是为了提供一株降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的皮特不动杆菌。
本发明一株皮特不动杆菌为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2021年1月19日，保藏编号为CCTCC No.M 2021107。
本发明一株皮特不动杆菌在降解环境污染物中的应用，其中环境污染物为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。
本发明采用浙江省台州市路桥区峰江镇电子拆解工业园区被BDE-47污染的土壤，取新鲜土壤(取样深度为0-20cm)，在采集过程中除掉样品中杂质，置于无菌袋当中，放入冰盒带回实验室，于4℃冰箱进行保存保存，用于传统微生物培养。BDE-47好氧降解菌株的驯化、分离及筛选：
①将从电子垃圾拆解场地采集的土壤过筛，称取10g，放置于带有玻璃珠的锥形瓶中，加入以BDE-47为唯一碳源的菌株筛选培养基，于35℃，150rpm的振荡培养箱中培养，使细菌呈单细胞状态分散于液体中，与营养物质充分接触；
②从锥形瓶内的菌悬液中吸取10mL，转接至90mL新配置的BDE-47菌株筛选培养基中，在相同条件下进行传代培养，重复上述步骤，进行几个周期的培养；
③采用污染物浓度梯度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系中BDE-47的浓度按10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L依次增加，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期；
④再采用最大污染物浓度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系BDE-47浓度为100μg/L，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期，得到可以以BDE-47为唯一碳源的生长的菌群；
⑤吸取最后一个周期降解菌株筛选培养基中菌液1mL，按10倍稀释法将所取菌液稀释为10-1-10-6梯度的液体，取100μL液体涂布于LB固体培养基上，用灭菌涂布棒涂抹均匀，放于37℃的恒温培养箱中进行培养；
⑥长出独立的菌落之后，观察各菌落形态特征进行筛选，使用接种环挑取筛选后的菌落，在牛肉膏固体培养基上划线分离，进行反复划线纯化直至筛选单一菌落得到纯菌；
⑦在初筛的基础上进一步在35℃的条件下，以菌株是否具有较高BDE-47降解率为依据，复筛选出降解效能较好的菌株，命名为GB-2并进行菌株鉴定。在无菌操作的条件下，用无菌水对菌悬液进行稀释，取100μL菌液于LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂布均匀，倒置于37℃的恒温培养箱中进行培养至单菌落长出，菌落形态为乳白色，圆形，表面光滑、湿润，无褶皱，边缘整齐，易挑起；细胞形态为短杆状；革兰氏染色阴性；其生理生化特征在于接触酶反应阳性、氧化酶反应阴性、柠檬酸利用阳性、淀粉水解阳性、甲基红试验反应阴性、硝酸盐还原反应阴性、伏普试验反应阴性、产吲哚试验阳性。对细菌DNA进行提取，将所得细菌基因组DNA用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，电泳后割胶回收PCR产物，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行16S rDNA测序，将测序结果用BLAST软件与Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，发现本实施方式筛选得到的菌株GB-2与皮特不动杆菌属(Acinetobacter pittii)同源性达100％，将序列提交GenBank数据库，获得登录号为MT150630。根据16S rDNA测序结果，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA7.0等相关软件在GenBank数据库中找到了同源序列，并建立了***发育树，菌株与皮特不动杆菌的同源性最高，达100％，最终命名为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2。
本发明筛选的菌株皮特不动杆菌GB-2在pH为7.0、温度为35℃，150rpm振荡培养7天，对初始浓度为100μg/L的BDE-47降解率可达70％以上，同时降低了对环境的二次污染，该菌可用于被BDE-47污染的水体和土壤的生物修复，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为皮特不动杆菌GB-2平板菌落形态图；
图2为GB-2菌株***发育树。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一株皮特不动杆菌为皮特不动杆菌(Acinetobacterpittii)GB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2021年1月19日，保藏编号为CCTCC No.M 2021107。
本实施方式采用浙江省台州市路桥区峰江镇电子拆解工业园区被BDE-47污染的土壤，取(0-20cm)新鲜土壤，在采集过程中除掉样品中杂质，置于无菌袋当中，放入冰盒带回实验室，于4℃冰箱进行保存保存，用于传统微生物培养。BDE-47好氧降解菌株的驯化、分离及筛选：
①将从电子垃圾拆解场地采集的土壤过筛，称取10g，放置于带有玻璃珠的锥形瓶中，加入以BDE-47为唯一碳源的菌株筛选培养基，于35℃，150rpm的振荡培养箱中培养，使细菌呈单细胞状态分散于液体中，与营养物质充分接触；
②从锥形瓶内的菌悬液中吸取10mL，转接至90mL新配置的BDE-47菌株筛选培养基中，在相同条件下进行传代培养，重复上述步骤，7d为一个周期，进行4个周期的培养；
③采用污染物浓度梯度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系中BDE-47的浓度按10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L依次增加，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期；
④再采用最大污染物浓度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系BDE-47浓度为100μg/L，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期，得到可以以BDE-47为唯一碳源的生长的菌群；
⑤吸取最后一个周期降解菌株筛选培养基中菌液1mL，按10倍稀释法将所取菌液稀释为10-1-10-6梯度的液体，取100μL液体涂布于LB固体培养基上，用灭菌涂布棒涂抹均匀，放于37℃的恒温培养箱中进行培养；
⑥长出独立的菌落之后，观察各菌落形态特征进行筛选，使用接种环挑取筛选后的菌落，在牛肉膏固体培养基上划线分离，进行反复划线纯化直至筛选单一菌落得到纯菌；
⑦在初筛的基础上进一步在35℃的条件下，以菌株是否具有较高BDE-47降解率为依据，复筛选出降解效能较好的菌株，命名为GB-2并进行菌株鉴定。在无菌操作的条件下，用无菌水对菌悬液进行稀释，取100μL菌液于酵母膏固体培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂布均匀，倒置于37℃的恒温培养箱中进行培养至单菌落长出，菌落形态为乳白色，圆形，表面光滑、湿润，无褶皱，边缘整齐，易挑起；细胞形态为短杆状；革兰氏染色阴性；其生理生化特征在于接触酶反应阳性、氧化酶反应阴性、柠檬酸利用阳性、淀粉水解阳性、甲基红试验反应阴性、硝酸盐还原反应阴性、伏普试验反应阴性、产吲哚试验阳性。对细菌DNA进行提取，将所得细菌基因组DNA用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，电泳后割胶回收PCR产物，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行16S rDNA测序，将测序结果用BLAST软件与Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，发现本实施方式筛选得到的菌株GB-2与皮特不动杆菌属(Acinetobacter pittii)同源性达100％，将序列提交GenBank数据库，获得登录号为MT150630。根据16S rDNA测序结果，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA7.0等相关软件在GenBank数据库中找到了同源序列，并建立了***发育树，菌株与皮特不动杆菌的同源性最高，达100％，最终命名为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2。
具体实施方式二：本实施方式一株皮特不动杆菌在降解环境污染物中的应用，其中环境污染物为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。
本实施方式筛选的菌株皮特不动杆菌GB-2在pH为7.0、温度为35℃，150rpm振荡培养7天，对初始浓度为100μg/L的BDE-47降解率可达70％以上，同时降低了对环境的二次污染，该菌可用于被BDE-47污染的水体和土壤的生物修复，具有较高的应用价值。
具体实施方式三：本实施方式皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2的筛选方法为：采用浙江省台州市路桥区峰江镇电子拆解工业园区被BDE-47污染的土壤，取(0-20cm)新鲜土壤，在采集过程中除掉样品中杂质，置于无菌袋当中，放入冰盒带回实验室，于4℃冰箱进行保存保存，用于传统微生物培养。BDE-47好氧降解菌株的驯化、分离及筛选：
①将从电子垃圾拆解场地采集的土壤过筛，称取10g，放置于带有玻璃珠的锥形瓶中，加入以BDE-47为唯一碳源的菌株筛选培养基，于35℃，150rpm的振荡培养箱中培养，使细菌呈单细胞状态分散于液体中，与营养物质充分接触；
②从锥形瓶内的菌悬液中吸取10mL，转接至90mL新配置的BDE-47菌株筛选培养基中，在相同条件下进行传代培养，重复上述步骤，进行4个周期的培养；
③采用污染物浓度梯度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系中BDE-47的浓度按10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L依次增加，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期；
④再采用最大污染物浓度驯化法进行菌株驯化：细菌驯化体系BDE-47浓度为100μg/L，7d为一个驯化周期，驯化共四个周期，得到可以以BDE-47为唯一碳源的生长的菌群；
⑤吸取最后一个周期降解菌株筛选培养基中菌液1mL，按10倍稀释法将所取菌液稀释为10-1-10-6梯度的液体，取100μL液体涂布于LB固体培养基上，用灭菌涂布棒涂抹均匀，放于37℃的恒温培养箱中进行培养；
⑥长出独立的菌落之后，观察各菌落形态特征进行筛选，使用接种环挑取筛选后的菌落，在牛肉膏固体培养基上划线分离，进行反复划线纯化直至筛选单一菌落得到纯菌；
⑦在初筛的基础上进一步在35℃的条件下，以菌株是否具有较高BDE-47降解率为依据，复筛选出降解效能较好的菌株，命名为GB-2并进行菌株鉴定。
其中主要实验试剂包括：BDE-47标样(>99％)，正己烷(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，酵母膏，Na2HPO4·2H2O，Ca(NO3)2·4H2O，(NH4)2SO4，MgCl2·6H2O，K2HPO4等。
菌株筛选培养基为无机盐液体培养基：Na2HPO4·2H2O，3.5g；K2HPO4，1g；(NH4)2SO4，0.5g；MgCl2·6H2O，0.1g；Ca(NO3)2·4H2O，0.05g。121℃高温蒸汽下灭菌30min。
LB液体/固体培养基：酵母膏，5g；蛋白胨，10g；NaCL，10g；蒸馏水，1000mL。pH值调至7.0-7.2，121℃高温蒸汽下灭菌20min，固体培养基在液体培养基的基础上加入15-20g琼脂，培养基倒入锥形瓶中，121℃高温蒸汽下灭菌20min。
牛肉膏固体培养基：牛肉膏，3g；NaCL，5g；蛋白胨，10g；琼脂，15-20g；蒸馏水，1000mL。pH值调至7.0-7.2，121℃高温蒸汽下灭菌20min。
具体实施方式四：本实施方式皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2的鉴定：
1、菌株形态鉴定
在无菌操作的条件下，用无菌水对菌悬液进行稀释，取100μL菌液于LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布棒涂布均匀，倒置于37℃的恒温培养箱中进行培养至单菌落长出，观察菌落的形态、大小、色泽、透明度及边缘等特征，菌落平板形态图如图1所示，观察结果如表1所示。
表1菌株GB-2形态学观察结果
Figure BDA0003055995950000061
2、菌株生理生化鉴定
对菌株GB-2进行生理生化实验，结果分析根据《伯杰细菌鉴定手册》进行，实验结果如表2所示，其中，“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。
表2菌株GB-2生理生化实验结果
Figure BDA0003055995950000062
3、菌株16S rDNA鉴定
对细菌DNA进行提取，将所得细菌基因组DNA用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR扩增体系(总体积50μL)及反应条件如表3和表4所示，电泳后割胶回收PCR产物，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行16S rDNA测序，16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
表3 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003055995950000063
表4 PCR扩增条件
Figure BDA0003055995950000071
将测序结果用BLAST软件与Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，发现本实施方式筛选得到的菌株GB-2与皮特不动杆菌属(Acinetobacter pittii)同源性达100％，将序列提交GenBank数据库，获得登录号为MT150630。根据16S rDNA测序结果，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA7.0等相关软件在GenBank数据库中找到了同源序列，并建立了***发育树，如图2所示。由图2可知，菌株与皮特不动杆菌的同源性最高，达100％，最终命名为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2。
对本实施方式的皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2在降解BDE-47上的功能性验证：
试验1：菌株对BDE-47降解能力的测定
在50mL锥形瓶中加入20mg/L的BDE-47正己烷储备液100μL，待正己烷挥发后，添加无机盐培养基20mL，使反应体系中BDE-47的最终浓度为100μg/L。将菌株GB-2接种于降解体系中，接种量为1％，于35℃，150rpm的恒温振荡培养箱中培养7d后，上HPLC分析，测定培养液中BDE-47的剩余量，计算菌株GB-2对BDE-47的降解率。
本试验在100μg/L BDE-47浓度以下，培养7d，BDE-47降解率达到70.17％。实验证明BDE-47降解菌GB-2具有修复BDE-47污染土壤的功能，而且无需添加其它化学制剂，可为BDE-47污染土壤的原位生物修复提供微生物菌剂资源，具有广阔的应用前景。
序列表
<110>哈尔滨师范大学
<120>一株皮特不动杆菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213>皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）
<400> 1
gcggcggacg ggtgagtaat gcttaggaat ctgcctatta gtgggggaca acatttcgaa 60
aggaatgcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggatcttcg gaccttgcgc 120
taatagatga gcctaagtcg gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg 180
atctgtagcg ggtctgagag gatgatccgc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 240
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc 300
gcgtgtgtga agaaggcctt atggttgtaa agcactttaa gcgaggagga ggctactgaa 360
gttaatacct tcagatagtg gacgttactc gcagaataag caccggctaa ctctgtgcca 420
gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggat ttactgggcg taaagcgcgc 480
gtaggcggct aattaagtca aatgtgaaat ccccgagctt aacttgggaa ttgcattcga 540
tactggttag ctagagtgtg ggagaggatg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg 600
tagagatctg gaggaatacc gatggcgaag gcagccatct ggcctaacac tgacgctgag 660
gtgcgaaagc atggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat 720
gtctactagc cgttggggcc tttgaggctt tagtggcgca gctaacgcga taagtagacc 780
gcctggggag tacggtcgca agactaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 840
ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatagt 900
aagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactta catacaggtg ctgcatggct 960
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttttcc 1020
ttatttgcca gcgagtaatg tcgggaactt taaggatact gccagtgaca aactggagga 1080
aggcggggac gacgtcaagt catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa 1140
tggtcggtac aaagggttgc tacctagcga taggatgcta atctcaaaaa gccgatcgta 1200
gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1260
agaatgccgc ggtgaata 1278
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物27F的核苷酸序列。
<400> 2
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物1492R核苷酸序列。
<400> 3
GGTTACCTTG TTACGACTT 19

Claims (2)

1.一株皮特不动杆菌，其特征在于它为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii)GB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2021年1月19日，保藏编号为CCTCC No.M 2021107。
2.如权利要求1所述的一株皮特不动杆菌在降解环境污染物中的应用，其特征在于所述的环境污染物为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。
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