CN112522158B

CN112522158B - 一株海洋细菌及其应用

Info

Publication number: CN112522158B
Application number: CN202011523799.4A
Authority: CN
Inventors: 任磊; 胡汉桥; 薛迎斌; 王冠; 翁丽云
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112522158A

Abstract

本发明公开了一株海洋细菌及其应用。该海洋细菌RL‑HY01菌株于2020年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61246，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该海洋细菌RL‑HY01菌株能够在72小时内将无机盐培养基中100mg/L的邻苯二甲酸二(2‑乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)彻底降解，对于邻苯二甲酸酯类污染物的降解和修复邻苯二甲酸酯类污染环境方面具有重要的现实意义和价值。

Description

一株海洋细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境污染修复技术领域，更具体地，涉及一株海洋细菌及其应用。

背景技术

自2004年Thompson在Science发表“Lost at the sea:Where is all theplastic”以来，海洋塑料污染问题受到越来越多的关注。通过关联2010年全球192个海岸线国家的固体废物产生、人口密度、经济发达程度等数据分析，研究人员计算出陆地上产生的2.75亿吨塑料垃圾中约有4.8～12.7千万吨进入海洋；并预计到2025年全球海洋中塑料垃圾量将高达2.5亿吨。进入海洋的塑料垃圾大多数会发生分解，一方面会形成微小的塑料颗粒，也就是常说的海洋微塑料(Microplastics,MPs)；另一方面，在这些塑料分解过程中会释放出有毒物质，如邻苯二甲酸酯类(Phathalic acid esters,PAEs)类塑化剂。邻苯二甲酸酯类塑化剂是目前使用量最大，也是使用最广泛的一类塑化剂。由于邻苯二甲酸酯类塑化剂的广泛使用及其在不同环境中的普遍检出，其对生态环境和人体健康的影响也得到了广泛的关注与研究，研究发现它具有致癌、致畸、致突变和生殖发育毒性等多种毒性，并且可通过多种途径进入环境。在海洋生态***中，由于海洋塑料污染日益严重，使得邻苯二甲酸酯类塑化剂在不同海域中普遍被检测到，对海洋生态***造成了不同程度的污染，并在海洋生物体内富集，进一步通过海产品进入食物链，对人体的健康产生不同程度的危害。常见的有邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)。最近研究指出PAEs具有环境激素的作用，它能干扰生物和人类的内分泌***，引起***数量减少、***形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、子宫粘膜组织增生等。DEHP是邻苯二甲酸酯类塑化剂中使用范围最广、使用量最大的一类，被广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域，也是目前世界范围类广泛检出的有机污染物之一。DEHP为无色透明油状液体，具有较高的流动性、低水溶性以及低挥发性，其自然降解缓慢。DEHP具有较强的生殖毒性、发育毒性、神经毒性、致多器官癌变等毒性。

PAEs在自然界中的降解方式主要包括非生物降解和生物降解，非生物降解包括光解和水解，生物降解主要是微生物降解，一般情况下非生物降解速率远低于生物降解，因此微生物降解是PAEs在环境中的主要降解途径。因此，筛选高效的PAEs降解菌株是目前国内外科学家研究PAEs环境降解、探索PAEs环境污染修复的重要途径。公开号为CN107177529A的中国发明专利提供了一株可以高效降解邻苯二甲酸酯的植物内生菌-枯草芽孢杆菌Enb-N菌株。然而，目前对于PAEs的降解及环境修复研究多集中在陆地生态***，而对于海洋生态***中PAEs命运归趋及生态修复研究的相对较少。分离获得可高效降解PAEs的海洋微生物对于了解PAEs在海洋生态***中的转化机制、建立PAEs污染海域生物修复技术意义重大。且更多新型PAEs污染降解菌的分离、开发及实际应用探索将对环境污染的生物修复提供重要的技术与资源支撑。

发明内容

本发明旨在提供一株海洋细菌Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌株及其应用。本发明从受城市废水污染海域的潮间带沉积物中分离出一株海洋细菌RL-HY01菌株，根据其代谢底物的特点可被应用到邻苯二甲酸酯类塑化剂的生物降解和被相关污染物污染海洋水体的生物修复。在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面具有非常广阔的应用前景。

本发明的首要目的是提供一株海洋细菌Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌株。

本发明的第二个目的是提供一种菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种生物清洁剂。

本发明的第四个目的是提供一种生物降解剂。

本发明的第五个目的是提供所述海洋细菌Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用。

本发明的第六个目的是提供所述菌剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用。

本发明的第七个目的是提供所述生物清洁剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用。

本发明的第八个目的是提供所述生物降解剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一株海洋细菌Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌株，所述海洋细菌RL-HY01菌株于2020年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61246，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

在电镜下观察，该菌菌体为短杆状，无鞭毛，无芽孢。菌落形态呈乳白色、圆形，边缘光滑，表面突起。菌株革兰氏染色、接触酶、葡萄糖氧化、硝酸盐还原和尿酶均为阳性；荚膜染色和吲哚反应为阴性。基于形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，将该菌株鉴定为Mycolicibacterium phocaicum，命名为RL-HY01。

上述菌株是从广东省湛江市霞山区观海长廊附近海域潮间带沉积物中分离得到的，该菌可将无机盐离子培养基中100mg/L的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)有效降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，结果表明该菌降解邻苯二甲酸酯类物质的能力稳定。

本发明还请求保护一种包含上述海洋细菌RL-HY01菌株和/或其菌液的菌剂。

本发明还请求保护一种包含上述海洋细菌RL-HY01菌株和/或其菌液的生物清洁剂。

本发明还请求保护一种包含上述海洋细菌RL-HY01菌株和/或其菌液的生物降解剂。

本发明上述Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌能够在72小时内将无机盐离子培养基中的DEHP(100mg/L)彻底降解。底物谱试验表明，菌株RL-HY01同样可将无机盐离子培养基中的DMP、DEP和DBP(100mg/L)彻底降解。底物浓度耐受试验表明，当底物浓度在≤1000mg/L时，菌株RL-HY01在72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP降解率均达到100％；当底物浓度为1200mg/L时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP降解率均大于70％。菌株RL-HY01对环境pH具有较宽的耐受范围，当初始pH为7.0时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率为100％；在5.0、6.0、8.0和9.0时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均大于60％。菌株RL-HY01对环境温度具有较好的耐受能力，当培养温度为30℃时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率为100％；当培养温度为20℃、40℃和50℃时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均大于60％；当培养温度为10℃时，72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均大于50％。此外，菌株RL-HY01对环境盐离子浓度也具有较高的耐受能力，在NaCl浓度为0-8％时，菌株的生长及对DEHP、DMP、DEP和DBP的降解能力并未受到明显影响；当NaCl浓度为9-10％时，菌株72小时内对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均在70％以上。在模拟海水污染修复过程中，Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01表现出良好的应用前景，10天内对海水中DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均大于95％，且确定最适添加菌体浓度为5×10⁴CFU/mL海水。

因此，上述海洋细菌RL-HY01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质中的应用以及在修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用也在本发明的保护范围中。

上述菌剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用也在本发明的保护范围中。

上述生物清洁剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用也在本发明的保护范围中。

上述生物降解剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用也在本发明的保护范围中。

优选地，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。

优选地，所述邻苯二甲酸酯类物质污染环境为邻苯二甲酸酯类物质污染海水。

最优选地，在修复邻苯二甲酸酯类物质污染海水时，RL-HY01菌的添加量为5×10⁴CFU/mL海水。

本发明具有以下有益效果：

本发明供的Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01菌株能够在72小时内将无机盐培养基中100mg/L的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)彻底降解，对于邻苯二甲酸酯类污染物的降解和修复邻苯二甲酸酯类污染环境方面具有重要的现实意义和价值。

本发明提供的Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于多种邻苯二甲酸酯类环境污染环境的生物修复，并对环境温度、pH及盐度均具有较好耐受能力，可广泛应用于环境水体清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为基于气相色谱法面积与DEHP浓度关系的标准曲线

图2为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01在电镜下的形态结构图。

图3为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01在LB固体培养基上的菌落形态。

图4为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01的***发育树。

图5为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01对不同浓度底物的降解率。

图6为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01在不同温度条件下对各底物的降解率。

图7为本发明菌株Mycolicibacterium phocaicum RL-HY01在不同pH条件下对各底物的降解率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

无机盐培养基组成如下：1.0g/L NH₄NO₃，20g/L NaCl，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.05g/LCaCl₂，0.5g/L KH₂PO₄和1.5g/L K₂HPO₄，pH＝7.0±0.2。

斜面培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1菌株的分离、鉴定和保藏

1、菌株的分离

从广东省湛江市霞山区观海长廊附近海域潮间(北纬20°215′108″，东经110°427′878″)带采集沉积物样品。在无菌操作条件下，将10g沉积物品接种到含100mg/L DEHP的50mL无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取1mL转接至10mL新鲜无机盐培养基中，连续转接5次进行富集与驯化。

取获得的菌液划线至含有100mg/L DEHP的固体无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养5天。挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为100mg/L DEHP的液体无机盐培养基作为实验组，以含相同浓度(100mg/L)DEHP的液体无机盐培养基但不接入菌株作为对照组，培养72小时后分别测定实验组与对照组中DEHP的浓度，计算菌株对DEHP的降解率。

向样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂经0.22μm的有机系滤膜过滤，进行气相色谱分析。使用WondaCap5色谱柱(GL SciencesInc，Japan.25mm×30m×0.25μm)，检测器为电子捕获检测器(Electron capturedetector，ECD)，进样量为1μL，分流进样(分流比49:1)进样室温度为300℃，柱温恒定为280℃，检测器温度为300℃，高纯氮气(99.999％)为载气(2mL/min)，通过软件LabSolutions(Version 5.90，SHIMADZU，Japan)获取并分析数据。采用外标法建立DEHP浓度与检测峰面积之间关系的标准曲线。准确配置浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L的DEHP标准浓度样品，每个浓度各3份，以上述方法对每个浓度样品进行检测，从而建立标准浓度与峰面积之间的标准曲线(图1)。

降解率的计算：通过获得的标准曲线，计算出培养72小时后实验组与对照组中DEHP的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株对DEHP的降解率。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-实验组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％。

对获得的降解率大于90％的菌株进行重复验证3次，直至分离获得纯化的菌株。其中，获得的降解菌RL-HY01对DEHP的降解率3次测定均为100％。

2、菌株的形态学特征

降解菌RL-HY01为革兰氏染色为阳性，菌体呈短杆菌状，无鞭毛，无芽孢(图2)；在LB培养基上菌落呈圆形凸起、乳白色，湿润，边缘规整，不透明，表面光滑(图3)。

3、菌株的生理生化特征

降解菌RL-HY01的接触酶、葡萄糖氧化、硝酸盐还原和尿酶实验均为阳性；氧化酶活性和吲哚反应为阴性。

4、菌株的16S rRNA基因鉴定

将菌株RL-HY01接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用微量分光光度计(Micro Drop，BIO-DL，中国)测定基因组DNA浓度，将获得的基因组DNA于-20℃保存备用。

设计用于扩增16S rDNA序列的一对通用引物：

(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。使用Premix TaqTM DNA聚合酶(Takara,日本)，以提取的菌株RL-HY01基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pMD19-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12小时，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果(GenBank：MW020110)在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本:7.0)构建***发育树(图4)。

综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列，菌株RL-HY01被鉴定为Mycolicibacterium phocaicum，因此，将该菌株命名为海洋细菌Mycolicibacteriumphocaicum RL-HY01。

5、菌株保藏

海洋细菌RL-HY01菌株于2020年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61246，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2菌株对邻苯二甲酸酯的降解性能评估

1、实验方法

将菌株RL-HY01接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量分别接种到含DEHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L的无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株且分别含DEHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L底物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培72小时停止培养并测定每种物质的浓度。向获得的培养液中加入等体积正己烷，超声波充分萃取10min，静置1小时，取上层有机溶剂用0.22μm的有机系滤膜过滤后进行GC检测。使用WondaCap 5色谱柱(GL Sciences Inc，Japan.25mm×30m×0.25μm)，检测器为电子捕获检测器(Electron capture detector，ECD)，进样量为1μL，分流进样(分流比49:1)进样室温度为300℃，柱温恒定为280℃，检测器温度为300℃，高纯氮气(99.999％)为载气(2mL/min)，通过软件LabSolutions(Version 5.90，SHIMADZU，Japan)获取并分析数据。采用外标法建立各底物浓度与检测峰面积之间关系的标准曲线。准确配置浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L各底物标准浓度样品，每个浓度各3份，以上述方法对每个浓度样品进行检测，从而建立标准浓度与峰面积之间的标准曲线(表1)。

表1 基于外标法建立各底物浓度与检测峰面积之间关系的标准曲线

建立气相色谱法检测无机盐培养基中DEHP、DMP、DEP和DBP的方法，通过外标法建立面积与浓度的标准曲线。基于此方法检测菌株RL-HY01对无机盐培养基中DEHP、DMP、DEP和DBP降解率。

降解率的计算：通过获得的标准曲线，计算出培养72小时后实验组与对照组中各底物的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株对各底物的降解率。

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％。

2、降解结果

如表2所示，结果表明该海洋细菌RL-HY01菌株能够在72小时内将无机盐培养基中100mg/L的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)彻底降解。

表2 菌株RL-HY01对各种底物的降解率与底物的自然降解率

实施例3菌株RL-HY01对不同浓度DEHP、DBP、DEP和DMP的降解能力

1、实验方法

分别以DEHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，设置500mg/L、700mg/L、1000mg/L、1200mg/L和1500mg/L共5个浓度，随后将菌株RL-HY01接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。同时，以含相应浓度底物的无机盐离子培养基不接菌作为对照组。培养72小时后，测定各处理底物的浓度。

2、实验结果

从图5可以看出，经过72小时培养后，各底物浓度在500-1000mg/L时降解率均为100％，当底物浓度为1200mg/L时降解率均在70％以上，当底物浓度为1500mg/L时降解率均在40％以上。

实施例4菌株RL-HY01对不同温度的耐受能力

1、实验方法

将菌株RL-HY01接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别以DEHP、DMP、DEP和DBP(分别为100mg/L)作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。以未接种菌株的并分别加入DEHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下，180rpm摇床振荡避光培养。培养72小时后测定各底物浓度并计算降解率。

2、实验结果

结果如图6所示，菌株RL-HY01降解底物的最适温度是30℃，在10-50℃均可降解DEHP、DMP、DEP和DBP。在20℃、40℃和50℃条件下，对各底物的降解效率均大于60％。在较低的温度下(10℃)，对各底物的降解效率均低于50％。

实施例5菌株RL-HY01对pH的耐受能力

1、实验方法

分别配制不同pH(4-10)的无机盐离子培养基，灭菌备用。将菌株RL-HY01接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，分别以DEHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源加入无机盐离子培养基中(浓度各自为100mg/L)，作为处理组；以未接种菌株不同pH的同时分别加入DEHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，处理组与对照组同时置于30℃，180rpm摇床振荡避光培养。培养72小时后测定各底物浓度并计算降解率。

2、实验结果

pH对菌株RL-HY01降解各底物的影响如图7所示。当pH值从5.0增加到7.0，各底物的降解率也逐渐由最低65.3％增加到均达到100％。在pH值为7.0-9.0时，RL-HY01对各底物的降解效率由100％逐渐降低至最低68.7％，当pH过低(4.0)或过高(10.0)时，各底物降解率均低于30％。

实施例6菌株RL-HY01对不同盐度的耐受能力

1、实验方法

分别配制不同NaCl浓度(30～100g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别以DEHP、DMP、DEP和DBP作为唯一碳源至浓度各自为100mg/L。将菌株RL-HY01接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中作为处理组，于30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的不同NaCl浓度分别加入DEHP、DMP、DEP和DBP至浓度为100mg/L的相同无机盐培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培养72小时后测定各底物浓度。

2、实验结果

结果如表3所示，菌株RL-HY01在盐度≤80g/L条件下对DEHP、DMP、DEP和DBP(100mg/L)的降解率均为100％，当NaCl浓度为90-100g/L时，降解率下降，但均仍大于70％。

表3 不同盐度下菌株RL-HY01对不同底物的降解率

实施例7菌株RL-HY01在污染海水的生物修复中的应用

1、实验方法

本实施例中使用的海水取自广东省湛江市硇洲岛附近海域(北纬20°872′667″，东经110°613′199″)。将菌株RL-HY01在LB液体培养基中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.7，菌体浓度约为1.0×10⁸CFU/mL)，向土壤中加入制备的菌液至终浓度分别为1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶和5×10⁶CFU/mL海水(每个处理为100mL海水)，并向海水中分别加入DEHP、DMP、DEP和DBP至各浓度分别为100mg/mL，作为处理组；同时，以相同条件下加入相同浓度污染物且不接菌的海水作为对照组，将最终获得的培养体系(处理组与对照组)充分混匀。将处理组与对照组置于恒温光照培养箱中，于30℃条件下12小时黑暗12小时光照，180rpm振荡培养，在培养的第10日取样测定各种底物的浓度。对照组与处理组中每个处理均设3个重复。

2、实验结果

菌株RL-HY01对污染海水中底物的降解率如表4所示，随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到5×10⁴CFU/mL海水时，各底物的降解率基本达到最大值。

表4 菌株RL-HY01对污染海水中底物的降解率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株弗卡分枝杆菌（Mycolicibacterium phocaicum）RL-HY01菌株，其特征在于，所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株于2020年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61246。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株和/或其菌液。

3.一种生物清洁剂，其特征在于，所述生物清洁剂包含权利要求1所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株和/或其菌液。

4.一种生物降解剂，其特征在于，所述生物降解剂包含权利要求1所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株和/或其菌液。

5.权利要求1所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质中的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。

6.权利要求1所述弗卡分枝杆菌RL-HY01菌株在修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。

7.权利要求2所述菌剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。

8.权利要求3所述生物清洁剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。

9.权利要求4所述生物降解剂在降解邻苯二甲酸酯类物质或修复邻苯二甲酸酯类物质污染环境方面的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或几种。