CN113234602B - 一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应用，涉及农业生物技术领域。保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。经过实验证实，该菌株对于提升作物的抗逆能力具有广谱性，可以明显提升作物的抗干旱性和抗盐碱能力。在干旱环境胁迫下，球孢毛壳菌MN110495能产生胞外多糖、抗氧化物等物质来对抗干旱环境，提升水果、蔬菜、粮食作物等多类植物的抗干旱能力。球孢毛壳菌还有促进种子萌发和作物生长的作用。

Description

一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体而言，涉及一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应 用。
背景技术
水资源短缺是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球工业化快速发展，自然灾害 频繁，降水量减少，约有43％的耕地为干早、半干早地区，干早逆境严重影响植物的生长 发育，造成作物减产。目前农业领域主要使用海藻肥类、氨基酸水溶肥类、植物生长调节剂类协助作物抗旱，腐植酸便是其代表之一。腐植酸类肥料是以富含腐植酸的泥炭、风化煤等为主要原料，经氨化、硝化、盐化等化学处理，添加微量元素和其他调制制剂制成的 一类化肥。腐植酸虽然具有促进作物根系生长发育、增强作物抗逆性、提产增效等多种功 效，但同时也具有成本高、生产周期长等传统化肥所具有的一系列问题。
近年来，利用微生物促进作物生长、提升作物抗逆性的研究越来越多。专利CN103667132B中公开了一株蜡样芽孢杆菌L90可提高核桃抗干旱能力。专利 CN110358695A中公开了一株假单胞菌G3可提高红枣植株耐干旱能力。专利CN105754901B 中公开了一株克雷伯氏菌LTGPAF-6F可提高小麦幼苗对干旱胁迫的防御能力。但现有的专 利存在如下的问题：多数的菌株只能针对单一的某类作物有效果，无法对多数常规农作物 产生广谱增效作用。因此，亟需开发出更多高效、广谱、经济的微生物肥料来提升作物的 抗旱、抗盐碱能力，促进作物在逆境中快速生长。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)物种的真菌菌株在制备浸种液、 浸种粉或菌剂中的应用。
球孢毛壳菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大 院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
本发明提供了一种球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)物种的真菌菌株在制备作物生 长调节剂或种子萌发调节剂中的应用。
作物生长调节剂适用于经济和粮食作物在盐碱地、干旱地贫瘠土壤或肥沃土壤中的生 长调节；种子萌发调节剂适用于经济作物和粮食作物种子的萌发；
优选地，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物；
优选地，真菌菌株是以保藏号为GDMCC No：61117保藏的球孢毛壳菌或其子代菌株。
本发明提供了一种球孢毛壳菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州 市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述球孢毛壳菌的菌落培养特征为：在真菌培养基 上菌丝最初为白色，后期为淡褐色，子囊壳灰褐色至橄榄褐色，中等大小，散生或聚集， 卵形。
可选的，真菌培养基为PDA培养基、SDAY培养基、液体沙氏培养基、改良马丁培养基、麦芽提取物、玉米粉琼脂、高盐察氏培养基或孟加拉红培养基。
可选的，球孢毛壳菌的最适生长温度为25-30℃。
本发明还提供了一种浸种液或浸种粉，其包括上述的球孢毛壳菌。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述球孢毛壳菌为浸种液或浸种粉的有效成分。优 选地，浸种液中球孢毛壳菌有效量为104cfu/mL～109cfu/mL。
优选地，浸种液中球孢毛壳菌有效量为106cfu/mL。
可选的，浸种液或浸种粉适用于作物的种子浸种。
可选的，作物包括经济作物和粮食作物中的至少一种。
可选的，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物。
可选的，茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒和番茄；蔷薇科选自如下 至少一种的蔷薇科作物：草莓和木瓜；芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；葫芦科选自黄瓜；蝶形花科选自大豆，菊科选自生菜，百合科 选自大蒜，姜科选自生姜，西番莲科选自百香果，凤梨科选自金菠萝，五加科选自三七， 仙人掌科选自火龙果。
本发明还提供了一种菌剂，其包括上述的球孢毛壳菌；优选地，菌剂以球孢毛壳菌为 主要有效成分。
本发明还提供了一种球孢毛壳菌在制备浸种液、浸种粉或菌剂中的应用。
本发明还提供了一种球孢毛壳菌或菌剂在制备作物生长调节剂或种子萌发调节剂中的 应用。
作物生长调节剂适用于经济和粮食作物在盐碱地、干旱地贫瘠土壤或肥沃土壤中的生 长调节；种子萌发调节剂适用于经济作物和粮食作物种子的萌发。
可选的，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物。
本发明还提供了一种肥料或农药，其包括上述的球孢毛壳菌或菌剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述肥料或农药施用于作物叶面或根部。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)，经过实验证实，该菌株对于提 升作物的抗逆能力具有广谱性，可以明显提升作物的抗干旱性和抗盐碱能力。在干旱环境 胁迫下，球孢毛壳菌MN110495能产生胞外多糖、抗氧化物等物质来对抗干旱环境，提升 水果、蔬菜、粮食作物等多类植物的抗干旱能力。球孢毛壳菌还有促进种子萌发和作物生 长的作用，球孢毛壳菌能产生吲哚乙酸来对抗干旱胁迫，提升干旱环境下种子的萌发速度 和作物的生长速度，提高作物存活率。此外，球孢毛壳菌还可以提升作物的抗盐碱能力、促进作物在盐碱环境中的生长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作 简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范 围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。
图1为***发育树分析图；
图2为小麦植株盆栽复水次日的收获图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实 例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本 发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分 而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)物种的真菌菌株在制备浸种液、 浸种粉或菌剂中的应用。
球孢毛壳菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大 院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
本发明提供了一种球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)物种的真菌菌株在制备作物生 长调节剂或种子萌发调节剂中的应用。
作物生长调节剂适用于经济和粮食作物在盐碱地、干旱地贫瘠土壤或肥沃土壤中的生 长调节；种子萌发调节剂适用于经济作物和粮食作物种子的萌发；
优选地，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物；
优选地，真菌菌株是以保藏号为GDMCC No：61117保藏的球孢毛壳菌或其子代菌株。
本发明提供了一种球孢毛壳菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州 市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述球孢毛壳菌的菌落培养特征为：在真菌培养基 上菌丝最初为白色，后期为淡褐色，子囊壳灰褐色至橄榄褐色，中等大小，散生或聚集， 卵形。
可选的，真菌培养基为PDA培养基、SDAY培养基、液体沙氏培养基、改良马丁培养基、麦芽提取物、玉米粉琼脂、高盐察氏培养基或孟加拉红培养基。
可选的，球孢毛壳菌的最适生长温度为25-30℃。
菌株的ITS测序结果如下的SEQ ID NO.1所示：
ACATTACAGAGTTGCAAAACTCCCTAAACCATTGTGAACGTTACCTATACCGTTGC TTCGGCGGGCGGCCCCGGGGTTTACCCCCCGGGCGCCCCTGGGCCCCACCGCGGGCG CCCGCCGGAGGTCACCAAACTCTTGATAATTTATGGCCTCTCTGAGTCTTCTGTACTGA ATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATC AAGCCCCCGGGCTTGTGTTGGGGACCTGCGGCTGCCGCAGGCCCTGAAAAGCAGTGG CGGGCTCGCTGTCGCACCGAGCGTAGTAGCATACATCTCGCTCTGGTCGCGCCGCGGG TTCCGGCCGTTAAACCACCTTTTAACCCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAAGACC CGCTGAACTTAAGCATATCA
菌株的BenA测序结果如下的SEQ ID NO.2所示：
CGGGCGGAAGAGCTGGCCGAAGGGGCCGGCACGGACGGCATCCATGGTGCCGG GCTCCAAGTCGACGAGGACAGCGCGAGGAACATACTTGTTGCCGGAAGCCTGTATAAT ACTATGAGCACGCCATCACTCGGTCGTGTAAAATTATTTGACCCGACTGACCTCGTTGA AGTACACGTTCATACGCTCGAGCTGGAGCTCGGAGGTGCCGTTGTACCTATCGAAGCG GTGAGCGGGGATTTATCGGTTGGGAACTGTCATGCCCACATACACGCCATTGCTGTCG AGGCCGTGCTCGCCAGAGATGGTCTGCCTGAAAAGAAGTCAGTCTCGATTGTCATCA GCCAAGAGTGTTTGCTTTGCTTGGACGTACCAGAAAGCGGCACCGATTTGGTTACCCT AGAGAGCTCCATGTCAGTTATCCTGCGCGGCCGGTCGGTCGTAATGTTCGATTCGGTC CAACTTACGCACTGGCCGGTCTGGAGGTGAACCTATAGTACGAAAAAGCAGTCAGCATCATCAAGCTTCGCATCATCGTCGTGTTGCTATCCGTCAGGAGCTGTGGAAATGAGGG TCGTCCCGATGGGTGGGGTAGTTCAGGGGCCCAAAAAAAAAGCTCCCAGACGCGTCG TCGCCGTGCGGCTCAGGAATGTGCGGGGTGACTTACA
基于多基因(ITS,BenA)建立的***发育树，显示菌株GDMCC 61363为球孢毛壳菌Chaetomium globosum。
本发明还提供了一种浸种液或浸种粉，其包括上述的球孢毛壳菌。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述球孢毛壳菌为浸种液或浸种粉的有效成分。优 选地，浸种液中球孢毛壳菌有效量为104cfu/mL～109cfu/mL。
优选地，浸种液中球孢毛壳菌有效量为106cfu/mL。
需要说明的是，上述的浸种液是球孢毛壳菌的培养液或球孢毛壳菌液的水稀释液。
在其他实施方式中，上述的球孢毛壳菌可以通过生产制得冻干粉剂，制得浸种粉，使 用时，只需将浸种粉与水混合即可。可选的，上述的浸种液或浸种粉还包含防腐剂、抗氧化剂、稳定剂等成分以提升成品的稳定性和活性。
在实际使用时，可将待处理种子进行消毒后，进行浸种。浸种液中孢子数可以根据需 要进行发酵培养调节，可选的，发酵液孢子数调至104CFU/mL以上。
可选的，浸种液或浸种粉适用于作物的种子浸种。
可选的，作物包括经济作物和粮食作物中的至少一种。
可选的，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物。
可选的，茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒、烟草、宁夏枸杞、枸杞、曼陀罗、龙葵和番茄；蔷薇科选自如下至少一种的蔷薇科作物：苹果、梨、草莓和木瓜； 芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；葫芦科选自 黄瓜、西葫芦、西瓜、南瓜等；蝶形花科选自大豆、蚕豆、落花生、豌豆、豇豆、菜豆、 赤豆、绿豆或木豆，菊科选自生菜、莴笋、苍耳、菊花或向日葵，百合科选自大蒜、黄精、 玉竹或知母，姜科选自生姜、砂仁或姜黄，西番莲科选自百香果，凤梨科选自金菠萝，五 加科选自三七，仙人掌科选自火龙果。
需要说明的是，在其他实施方式中，并不限于上述列举的作物种类，本发明提供的浸 种液或浸种粉也可以用于其他作物的种子浸种。
本发明还提供了一种菌剂，其包括上述的球孢毛壳菌；优选地，菌剂以球孢毛壳菌为 主要有效成分。
该菌剂可以是液体制剂、固态菌剂、膏状菌剂、悬浮剂、乳液、喷雾剂或半固态菌剂。
除了球孢毛壳菌为主要有效成分外，上述的菌剂还可以包括其他的添加助剂。
本发明还提供了一种球孢毛壳菌在制备浸种液、浸种粉或菌剂中的应用。
本发明还提供了一种球孢毛壳菌或菌剂在制备作物生长调节剂或种子萌发调节剂中的 应用。
作物生长调节剂适用于经济和粮食作物在盐碱地、干旱地贫瘠土壤或肥沃土壤中的生 长调节；种子萌发调节剂适用于经济作物和粮食作物种子的萌发。
可选的，经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、 葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；粮食 作物选自禾本科作物。
本发明还提供了一种肥料或农药，其包括上述的球孢毛壳菌或菌剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述肥料或农药施用于作物叶面或根部。上述的叶 肥或根肥可以是水溶性肥，也可以其他溶解性质的肥料。
上述的肥料可以作为基肥使用，也可以与其他的有机肥、无机肥或有机-无机肥复混施 用。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技 术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议 的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
关于下述各试剂的配制
5％次氯酸钠：5ml次氯酸钠、95ml无菌水，无需灭菌，现用现配；
75％乙醇：26.67ml无菌水、73.33ml 95％乙醇，无需灭菌，现用现配；
PDA培养基：PDA 16.04g，自来水400mL；
PDB培养基：PDB 9.6g，自来水400mL；
RBM培养基：RBM 14.66g，自来水400mL；
羧甲基纤维素钠：0.7％CMC悬液，655rpm，100℃，2h加热搅拌配好后121℃20min灭菌；
无菌水：量取1000ml无菌水，121℃，20min灭菌。
Hoagland营养液：称取1.28g于900ml蒸馏水或去离子水中，煮沸溶解，另取四水合硝酸钙0.945g于100mL水中溶解。将二者混合，121℃高压灭菌20分钟，备用。
AGPS培养基：多价蛋白胨10g/L，甘油10g/L，S1 20ml/L，S2 20ml/L，S3 20ml/L，接种前加0.1％L-色氨酸(占混合溶液的0.1％)。
Solution 1：无水磷酸氢二钾14g/400mL，无水磷酸二氢钾10.8g/400mL；
Solution 2：七水合硫酸镁50g/L，无水氯化铵25g/L；
Solution 3：二水合氯化钙10g/L；
Salkowski试剂比色液：250ml H2O，150ml H2SO4及7.5ml 5mol/L FeCl3.6H2O， 4度冰箱保存。
EPS特殊培养基：酵母浸提取物2％、K2HPO4 1.5％、MgSO4 0.02％、MnSO40.0015％、FeSO4 0.0015％、CaCl2 0.003％、NaCl 0.0015％、琼脂1.5％、蔗糖10％、pH 7.5；
50mM盐碱霍格兰：NaCl 0.59g、NaHCO3 7.56g、Na2SO4 12.78g、Na2CO3 1.06g、hoagland 2L。
以上所配制的培养基、溶液除了特别说明外，均置于立式压力蒸汽灭菌器中121℃， 20min灭菌。
实施例1
本实施例提供了球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)MN110495菌株的筛选、分离和 鉴定方法。
(1)菌株的筛选和分离：
样品来自河南省的棉花种植地里收集到的根茎土壤。称取干土10g，将土壤放入已灭 菌的研钵中用杵捣碎，放置纱布上用自来水冲洗，纱布上附着粘土移至离心管，加入50ml 无菌水，旋涡，在10000rpm下离心6min，倒掉上清，再用无菌水清洗，再一次离心让颗粒沉淀到锥形离心管的底部，反复离心清洗3次。取上述清洗后的土1g用20mL无菌的羧 甲基纤维素钠制成的悬浮液稀释沉淀涂布于RBM培养基上，于室温黑暗倒置培养7d。挑 取菌丝接种于PDA培养基室温黑暗倒置培养7d，分离获得球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)MN110495。
(2)菌株的鉴定：
菌落在PDA平板上的菌丝最初呈白色，后期呈淡褐色。子囊壳灰褐色至橄榄褐色，中 等大小，散生或聚集，卵形。
对该菌株分别进行ITS、BenA序列测定，采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒完成基因提取与PCR扩增，扩增引物和操作方法如表1所示，扩增产物由金唯智生物科技有 限公司测序。
ITS和BenA序列测序结果见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。登录美国国家生物技 术信息中心(NCBI)网站，利用BLAST检索将测序结果进行同源性搜索，进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)、***发育树分析，确定该菌株种属为球孢毛壳菌(Chaetomium globosum)。***发育树分析图参照图1所示。
表1 PCR上下游引物。
Figure BDA0003003883960000071
Figure BDA0003003883960000081
实施例2
本实施例进行球孢毛壳菌MN110495菌株发酵液的制备。
用无菌打孔器打孔18块实施例1中分离筛选获得的菌体装于含30mL PDB培养液的50mL无菌离心管中，置于恒温振荡培养箱，于28℃，200rmp条件下培养4d，用血球计数 板计数孢子数，并将发酵液孢子数调至106CFU/mL。
实施例3
本实施例进行球孢毛壳菌MN110495菌株对小麦种子萌发期抗旱性的影响研究。技术 路线参照图2所示。
从冷库中取出小麦种子(济麦23)，挑选出颗粒大小一致的健康种子，用75％乙醇消毒1 min，无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5min，最后用无菌水洗3遍。然后于室温条 件下使用处理液进行种子浸种处理。根据处理液不同，设置实验组和空白对照组。
实验组分为MN110495处理组、阴性对照组和阳性对照组，其中MN110495处理组使用实施例2中的菌株发酵液进行浸种过夜；阴性对照组使用PDB培养液浸种；阳性对照组 使用市售产品浸种(参照表2所示)。空白对照组亦使用PDB培养液浸种。
然后将浸种后的种子播种至育苗钵内，育苗钵内装有与hoagland营养液按1：8(体积 ml/质量g比)充分混合后的基质土(基质土混合前经立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60min 处理)，每个育苗钵内播种3粒种子，每组进行十个重复。播种完成后，空白对照组的所有 育苗钵内浇灌50mL hoagland营养液，实验组不浇灌。之后将其置于25℃温室内，每天光 照12h，并进行干旱处理。
在种子萌发期(播种后1-10d)，实验组隔日浇灌hoagland营养液10mL，使实验组盆栽 土壤湿度维持在8-12％之间的超级严重干旱状态；而空白对照组则每日浇灌hoagland营养 液0～20mL，使空白对照组盆栽的土壤湿度维持在75-80％的正常浇灌状态。
种子萌发期结束后，通过统计种子萌发数来计算种子萌发抗旱指数，进而分析干旱胁 迫环境下，不同实验组的种子萌发情况。
水分含量区分土壤干旱等级(轻度55-65％、中度40-55％、重度30-40％)，正常浇灌 75-85％。
种子萌发抗旱指数＝实验组种子萌发指数/空白对照组种子萌发指数。
种子萌发指数＝1*nd2+0.75*nd4+0.5*nd6+0.25*nd8
其中nd2、nd4、nd6、nd8是指第2、4、6、8d的种子萌发率，BOUSLAMA认为种子萌 发抗旱指数是评价种子萌发期抗旱性的可靠指标。
表2市售产品列表
Figure BDA0003003883960000091
由表3结果可知，虽然在超级严重干旱状态下，经球孢毛壳菌MN110495菌株发酵液进行浸种处理的小麦种子萌发抗旱指数(1.15)不及主要成分为黄腐植酸的化学肥料类市售 产品1(1.32)，但是明显优于同类微生物肥料市售产品2和3(萌发抗旱指数分别为1.01和0.82)，且比阴性对照组的萌发抗旱指数(0.86)提升了33.7％。因此，球孢毛壳菌MN110495 菌株能有效提升种子在干旱条件下的萌发速度，改善种子的抗旱能力、提升作物存活率。
表3各组种子萌发期抗旱情况对照表。
Figure BDA0003003883960000092
实施例4球孢毛壳菌MN110495菌株对小麦幼苗抗旱性的影响。
将种子萌发后长势相当的幼苗移栽至育苗钵中，每钵三株幼苗，每组设置五个重复。 移栽后的实验组幼苗隔天浇灌hoagland营养液10mL，移栽后第4天向实验组的每个盆栽内 浇灌hoagland营养液20mL后开始断水处理。而移栽后的空白对照组幼苗依旧每天浇灌 hoagland营养液10mL。断水5天后，浇灌hoagland营养液20mL进行复水处理，复水后次日统计植株平均株高、根部表面积、鲜重和干重和植株干旱等级。结果见表4。
植株干旱等级评价标准：
采用1-9级评价体系，9级最好，1级最差。
9级，植株完好；
8级，叶子开始***，但还没有卷曲，叶子个别区域出现颜色变浅；
7级，叶子继续***，叶色继续变浅，至少有1片叶子开始卷曲；
6级，叶子继续***，颜色变浅，大部分的叶子开始卷曲；
5级，所有叶子都开始***卷曲，甚至叶子下垂；
4级，最下面叶子开始干枯，植株整体变坏，中间的叶子也卷曲严重；
3级，最下面的两片叶子枯萎，其他叶子也开始干枯；
2级，中间叶子开始干枯；
1级，任何比2级更严重的都归为1级。
表4干旱条件下各组小麦幼苗生长情况
Figure BDA0003003883960000101
通过比较空白和阴性对照组可知，断水处理不利于小麦幼苗的生长。而断水处理后， 实验组中的阴性对照组其小麦幼苗各项生长指标都低于其他实验组小麦幼苗，表明微生物 肥料和化学肥料都能有效提升植株幼苗的生长速度。且经市售产品2处理的小麦幼苗其株 高、根部表面积、鲜重、干重和复水后的植株干旱等级皆高于市售产品1，而球孢毛壳菌 MN110495菌株表现出与市售产品1相当的处理效果。表明在干旱条件下，微生物肥料产品 和化学肥料产品表现出相当甚至更好的促生长效果。
另外，将MN110495处理组与阴性对照组进行单独比较发现，在超级严重干旱状态下， MN110495处理组的幼苗株高、根部表面积、鲜重和干重比阴性对照组分别提高了12％、15％、14％和11％。而经复水处理后的MN110495处理组植株干旱等级为6.73，比阴性对照组植株干旱等级5.87提升了15％。且由图2可知，较阴性对照组小麦植株来看，MN110495 处理组植株长得较为青绿，萎缩枯黄部分较少，根系部分较粗长，侧根较多。因此，MN110495处理组在干旱环境状态下具有促进植株生长、加速植株复青的作用。
实施例5
本实施例进一步对球孢毛壳菌MN110495菌株在其他作物抗旱效果进行分析。
以PDB浸种作为对照组，以球孢毛壳菌MN110495菌株发酵液浸种作为实验组，采用实施例3和实施例4所述的浸种、播种、幼苗移栽和抗旱测试方法对水稻、玉米、马铃薯 等实验室现有的更多种类的植株进行抗旱效果测试，最后测得断水处理、复水次日的各植 株幼苗干重情况，验证球孢毛壳菌MN110495菌株对植株的抗旱效果。
球孢毛壳菌MN110495菌株作用于植株根部，能显著增强根部生长速度。本实施例选 用作物收获时的干重作为抗干旱效果的指标来说明球孢毛壳菌MN110495菌株的抗干旱、 促生作用。由表5可知，球孢毛壳菌MN110495菌株在提升作物抗旱方面具有广谱性，能有效提升作物的抗旱能力，促进植株在干旱环境下的生长速度，使植株干重得到明显提升。
表5球孢毛壳菌MN110495菌株对植株抗旱效果的影响。
Figure BDA0003003883960000102
Figure BDA0003003883960000111
实施例6
本实施例对球孢毛壳菌MN110495菌株在玉米植株上的抗盐碱效果进行分析。
玉米种子的消毒、土壤的准备及播种步骤与实施例3相同。
根据处理液不同，设置实验组和空白对照组。实验组分为MN110495处理组使用实施 例2中的菌株发酵液浸种、阴性对照组使用LB培养液浸种；阳性对照组使用市售产品浸种 (见表6)，空白对照组亦使用LB培养液浸种。测OD600并用LB稀释菌液浓度至OD600 为0.8-0.9，浸种5h。
将浸种后的种子播种至育苗钵内，育苗钵内装有与50mM盐碱霍格兰充分混合后的基 质土按1：1(v/m)(基质土混合前经立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60min处理)，每个育苗钵内播种3粒种子，每组进行五个重复。空白处理用等量正常霍格兰拌土。将其置于25℃温室内，每天光照12h，并进行盐碱处理。播种完1-5d，隔天实验组每杯浇灌20mL 100mM 盐碱霍格兰；空白处理每杯浇灌20mL正常霍格兰。8-12d隔天实验组浇灌30mL 100mM盐 碱霍格兰；空白处理每杯浇灌30mL正常霍格兰。15-22d隔天实验组浇灌40mL 100mM盐 碱霍格兰；空白处理每杯浇灌40mL正常霍格兰。使实验组盆栽土壤盐分为重度盐渍化状态， 空白对照组为非盐渍化状态。
待玉米种子播种23天后，收获玉米植株测定植株平均鲜重、表跟面积、干重和抗盐碱 等级，指标结果见表7。
盐分含量区分土壤盐渍化程度(饱和浸出液0-2为非盐渍化、2-4为盐渍化、4-8为中 度盐、8-16为重盐土、>16为极重盐土)。
抗盐碱等级评估标准如下所示：
采用1-5级评价体系，5级最好，1级最差。
5级 植株全株叶片翠绿或植株叶尖稍微枯黄
4级 植株叶片枯黄面积较大且心叶枯萎
3级 植株心叶枯死以及植株完全叶枯萎，同时心叶尚未展开已枯萎
2级 植株整体枯萎严重，所有叶子均有枯萎蜷缩情况
1级 植株所有叶片完全枯死
表6市售产品列表
市售产品 编号 生产厂家 成分
黄腐酸钾 市售产品 山西惠亿农生物科技有限公司 解淀粉芽孢杆菌、黄腐酸等
表7目标菌株在耐盐碱实验中的收获指标
处理 鲜重 根表面积 抗盐碱等级 干重
空白对照组 6.1 59.10 5 0.4
阴性对照 3.37 29.64 3.24 0.24
阳性对照 3.61 28.25 4.22 0.26
MN110495处理组 3.74 36.44 3.59 0.25
通过比较空白和阴性对照组可知，在重度盐渍化环境下不利于玉米幼苗的生长。而处 于重度盐渍化处理后，实验组中的阴性对照组其玉米幼苗各项生长指标都低于其他实验组 玉米幼苗，又表明微生物肥料和化学肥料都能有效提升植株幼苗的生长速度。
另外，将MN110495处理组与阴性对照组进行单独比较发现，在重度盐渍化环境下，MN110495处理组的幼苗鲜重、根部表面积、抗盐碱等级和干重比阴性对照组分别提高了11％、22.9％、10.8％和4.1％。因此，MN110495处理组在盐渍化环境状态下具有促进植株生长的作用。
实施例7
本实施例对菌株进行产吲哚乙酸(IAA)测试。
将菌株(孢子或者菌丝)接种于含有0.1％L-色胺酸的AGPS培养基，置于恒温振荡培 养箱中，于30℃，200rpm条件下培养2d。取50μL菌株发酵液滴于白色陶瓷板上，同时 加入200μL Salkowski比色液(1：4)，以50mg/L的IAA和AGPS培养基取代菌株发酵液 作为阳性对照和阴性对照。白色瓷板放置于室温避光30min后观察显色结果。
若显色反应结果明显则进行进一步定量测试，取处理液(菌株发酵上清液、50mg/L的 IAA和AGPS培养基)与Salkowski比色液1:1混匀，在室温黑暗环境下反应30min后快速于分光光度计530nm波长下测定混合液的吸光值。根据标准曲线计算出吲哚乙酸含量。准曲线用纯3-吲哚乙酸制作，测定吲哚乙酸范围5～200μg/mL。
表8菌株产吲哚乙酸(IAA)测试数据
Figure BDA0003003883960000131
由表8可知，GDMCC 61363菌株产IAA，并且作用于植物表面积，促使植物生长发育。提高植物从土壤中吸收养分的能力，植物在干旱胁迫条件下，存活率显著提高。
实施例8
本实施例对菌株进行EPS产孢外多糖活性测定。将10μL菌液滴在产EPS特殊培养基中直径5mm的无菌滤纸片上，室温培养2d。根据滤纸周围的菌落大小以及透明圈来判断是否产EPS。
表9产孢外多糖(EPS)活性测定数据(菌株分泌透明圈用“+”表示)
试验编号 菌种名 菌落直径/cm 分泌透明圈
GDMCC 61363 Chaetomium globosum 3.27 +
通过表9，可知GDMCC 61363能够产生胞外多糖(EPS)来提高对干旱胁迫的耐受性，维持土壤和水分的稳定，更好的黏附植物根上，增加植物根系的可利用水分。
实施例9
本实施例先进行植物叶片中脯氨酸(Pro)含量测定。
脯氨酸的测定采用脯氨酸测试盒，根据其测试盒说明书的方法进行样品预处理及含量 测定。脯氨酸测试盒生产厂家为南京建成生物工程研究所，货号：A107-1-1，
表10植物叶片中脯氨酸(Pro)含量测定数据
脯氨酸(PRO)测试盒
Figure BDA0003003883960000132
空白管无菌水调零，1cm光径，波长520nm比色。
脯氨酸(PRO)测试公式＝((测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)) *标准品浓度5ug/ml*/匀浆液浓度(g组织湿重/ml)*样本测试前稀释倍数。
本实施例进一步对植物叶片中抗氧化酶类提取及活性进行测定(SOD、CAT、POD)。
SOD活性的测定采用羟胺法测超氧化物歧化酶试剂盒，根据其测试盒说明书植物组织 中SOD的测定的方法进行样品预处理及测定。
CAT(EC 1.11.1.6)活性的测定采用可见光法测过氧化氢酶试剂盒，根据其测试盒说 明书组织样本的检测的方法进行样品预处理及测定。
POD(EC 1.11.1.7)活性的测定采用过氧化物酶测试盒，根据其测试盒说明书的方法进 行样品预处理及测定。
表11植物叶片中超氧化物歧化酶(SOD)含量测定数据
Figure BDA0003003883960000141
表12植物叶片中过氧化氢酶(CAT)含量测定数据
Figure BDA0003003883960000142
表13植物叶片中过氧化物酶(POD)含量测定数据
Figure BDA0003003883960000143
Figure BDA0003003883960000151
通过表10至表13，可得出GDMCC 61363菌株作用于植物时，可分泌大量并能够清除活性氧的酶系和抗氧化物质以及脯氨酸，来对抗逆境。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种球孢毛壳菌、菌剂、浸种液及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 539
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acattacaga gttgcaaaac tccctaaacc attgtgaacg ttacctatac cgttgcttcg 60
gcgggcggcc ccggggttta ccccccgggc gcccctgggc cccaccgcgg gcgcccgccg 120
gaggtcacca aactcttgat aatttatggc ctctctgagt cttctgtact gaataagtca 180
aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 240
aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg 300
ccagcattct ggcgggcatg cctgttcgag cgtcatttca accatcaagc ccccgggctt 360
gtgttgggga cctgcggctg ccgcaggccc tgaaaagcag tggcgggctc gctgtcgcac 420
cgagcgtagt agcatacatc tcgctctggt cgcgccgcgg gttccggccg ttaaaccacc 480
ttttaaccca aggttgacct cggatcaggt aggaagaccc gctgaactta agcatatca 539
<210> 2
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggcggaag agctggccga aggggccggc acggacggca tccatggtgc cgggctccaa 60
gtcgacgagg acagcgcgag gaacatactt gttgccggaa gcctgtataa tactatgagc 120
acgccatcac tcggtcgtgt aaaattattt gacccgactg acctcgttga agtacacgtt 180
catacgctcg agctggagct cggaggtgcc gttgtaccta tcgaagcggt gagcggggat 240
ttatcggttg ggaactgtca tgcccacata cacgccattg ctgtcgaggc cgtgctcgcc 300
agagatggtc tgcctgaaaa gaagtcagtc tcgattgtca tcagccaaga gtgtttgctt 360
tgcttggacg taccagaaag cggcaccgat ttggttaccc tagagagctc catgtcagtt 420
atcctgcgcg gccggtcggt cgtaatgttc gattcggtcc aacttacgca ctggccggtc 480
tggaggtgaa cctatagtac gaaaaagcag tcagcatcat caagcttcgc atcatcgtcg 540
tgttgctatc cgtcaggagc tgtggaaatg agggtcgtcc cgatgggtgg ggtagttcag 600
gggcccaaaa aaaaagctcc cagacgcgtc gtcgccgtgc ggctcaggaa tgtgcggggt 660
gacttaca 668

Claims (14)

1.一种球孢毛壳菌（Chaetomium globosum）物种的真菌菌株在制备菌剂中的应用；所述球孢毛壳菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
2.一种球孢毛壳菌（Chaetomium globosum）物种的真菌菌株在制备作物生长调节剂或种子萌发调节剂中的应用，其特征在于，所述真菌菌株是以保藏号为GDMCC No：61363保藏的球孢毛壳菌或其子代菌株；所述球孢毛壳菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum；
所述作物生长调节剂适用于经济和粮食作物在盐碱地、干旱地贫瘠土壤或肥沃土壤中的生长调节；
所述种子萌发调节剂适用于经济作物和粮食作物种子的萌发，所述经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；
所述茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒和番茄；所述蔷薇科选自如下至少一种的蔷薇科作物：草莓和木瓜；所述芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；所述芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；所述葫芦科选自黄瓜；所述蝶形花科选自大豆，所述菊科选自生菜，所述百合科选自大蒜，所述姜科选自生姜，所述西番莲科选自百香果，所述凤梨科选自金菠萝，所述五加科选自三七，所述仙人掌科选自火龙果；
所述粮食作物选自禾本科作物，所述禾本科作物选自水稻和玉米。
3.一种球孢毛壳菌，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月10日，保藏编号为GDMCC No：61363，菌株分类学名称为Chaetomium globosum。
4.根据权利要求3所述的球孢毛壳菌，其特征在于，所述球孢毛壳菌的菌落培养特征为：在真菌培养基上菌丝最初为白色，后期为淡褐色，子囊壳灰褐色至橄榄褐色，中等大小，散生或聚集，卵形；所述真菌培养基为PDA培养基。
5.根据权利要求4所述的球孢毛壳菌，其特征在于，所述球孢毛壳菌的最适生长温度为25-30℃。
6.一种浸种液或浸种粉，其特征在于，其包括权利要求3-5任一项所述的球孢毛壳菌。
7.根据权利要求6所述的浸种液或浸种粉，其特征在于，所述球孢毛壳菌为所述浸种液或浸种粉的有效成分。
8.根据权利要求7所述的浸种液或浸种粉，其特征在于，所述浸种液中球孢毛壳菌有效量为104cfu/mL~106cfu/mL。
9.根据权利要求7所述的浸种液或浸种粉，其特征在于，所述浸种液中球孢毛壳菌有效量为106cfu/mL。
10.根据权利要求7所述的浸种液或浸种粉，其特征在于，所述浸种液或浸种粉适用于如下作物的种子浸种，所述作物包括经济作物和粮食作物中的至少一种；
所述经济作物选自如下经济作物中的至少一种：茄科、蔷薇科、芸香科、芭蕉科、葫芦科、蝶形花科、菊科、百合科、姜科、西番莲科、凤梨科、五加科和仙人掌科；所述粮食作物选自禾本科作物；所述禾本科作物选自水稻和玉米；
所述茄科选自如下至少一种的茄科作物：马铃薯、辣椒和番茄；所述蔷薇科选自如下至少一种的蔷薇科作物：草莓和木瓜；所述芸香科选自如下的芸香科作物：柑橘；所述芭蕉科选自如下的芭蕉科作物：香蕉；所述葫芦科选自黄瓜；所述蝶形花科选自大豆，所述菊科选自生菜，所述百合科选自大蒜，所述姜科选自生姜，所述西番莲科选自百香果，所述凤梨科选自金菠萝，所述五加科选自三七，所述仙人掌科选自火龙果。
11.一种菌剂，其特征在于，其包括权利要求3-5任一项所述的球孢毛壳菌。
12.根据权利要求11所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂以所述球孢毛壳菌为主要有效成分。
13.一种肥料，其特征在于，其包括权利要求3-5任一项所述的球孢毛壳菌或权利要求11-12任一项所述的菌剂。
14.根据权利要求13所述的肥料，其特征在于，所述肥料施用于作物叶面或根部。
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