CN109554319B

CN109554319B - 一种芽孢杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN109554319B
Application number: CN201910100279.3A
Authority: CN
Inventors: 刘巍; 王志春; 倪洁; 张涛; 席悦; 姜旭; 杨勇; 傅深展
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109554319A

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌菌株及其应用，其解决了化学农药具有广谱性、杀死致病微生物的同时、把土壤中大量的有益微生物群体一同杀死、严重破坏土壤的生态环境的技术问题，该菌株的命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)XS‑2；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号编号为：CGMCC No.14454。本发明同时提供了其复合菌剂及应用。该菌株对病害防控效果显著、对环境安全，具有良好的开发应用前景。

Description

一种芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体地说涉及一种芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

在自然界中，任何植物个体都和其体内、外的微生物存在着密切的关系，这些微生物从对植物的作用上，分为植物病原微生物和非病原微生物。在农作物生长过程中，植物病原菌以植物作为寄主，侵害植物，常会造成植物生长缓慢、停滞，影响果实的外观和品质，甚至引起农作物毁灭性死亡，造成巨大的经济损失。

植物病害的防治在我国经历了“有病治病”到“无病防病”的发展时期，以往有病治病的植保措施，都是以消灭病原物为目标，大量的化学药剂投入农业生产，也由此产生了一系列负效应，耐药性越来越强。人们开始对植物病害重新认识，“无病防病、综合防治”的植保方针开始形成。在此基础之上，以微生物菌剂为主的微生态制剂逐渐形成，微生态制剂就成了一种新的病害防治方法。该技术是一顼综合措施，包括生物、物理、化学等一系列措施，利用微生态制剂调控徴生态把病害防治带入了“无病保健”的新的历史发展阶段。

微生态制剂是从植物体内、体表、根际筛选出有益微生物，通过现代发酵工艺制备而成，施用后可在植物体内、体表、根际定植繁殖，通过调控植物体内、体表、根际微生物群落，使有益微生物成为种群优势，充分发挥对植物的促进同化作用，提高产量和品质，增强寄主对不良环境和有害微生物的抵抗性，使寄主健康生长，这是传统植保措施不能实现的。“保健为主”的植保方针是在“无病防病”的基础之上的发展，使我国的植保工作步入一个新的发展阶段，是对农业产业的重大贡献。

芽孢杆菌是微生态制剂中主要的一类微生物，它在自然界中广泛存在，其生理特征丰富多样、分布广泛，是土壤和植物根际的重要的微生物种群。在植物病虫害中被广泛关注，是目前研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、肥力的保持和提高、生态环境的改善、植物的生长发育等方面均起着极其重要的作用，是理想的生防菌研究对象。

目前国内外主要是通过化学方法防治，但是这些化学农药具有广谱性，杀死致病微生物的同时，把土壤中大量的有益微生物群体一同杀死，严重破坏了土壤的生态环境。随着人们频繁和过度施用，给环境和人类健康带来极大的危害。因此开展绿色环保的生物防治的研究和应用，正受到世界各国的广泛重视。

发明内容

本发明就是为了解决化学农药具有广谱性、杀死致病微生物的同时、把土壤中大量的有益微生物群体一同杀死、严重破坏土壤的生态环境的技术问题，提供一种解淀粉芽孢杆菌XS-2以及发酵产品，该菌种及其制剂可以用作生物肥料以及生物农药，作为生物农药可以防治植物多种病害。

本发明提供的芽孢杆菌菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.) XS-2；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2017年7月25日，保藏号编号为：CGMCC No.14454。

本发明同时提供芽孢杆菌菌株在防控尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的植物霜霉病、青霉病、稻瘟病、根腐病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病中的应用。

本发明也提供芽孢杆菌菌株作为生物肥料的应用。

本发明还提供含有芽孢杆菌菌株的复合菌剂，菌剂的成份为芽孢杆菌(Bacillussp.)XS-2、巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌、淡紫拟青霉，质量比范围为：1：(1～3)：(1～4)：(1～5)。

本发明也提供芽孢杆菌菌株的复合菌剂作为生物肥料的应用。

本发明的有益效果是，本发明的菌株芽孢杆菌XS-2以及发酵产品可以用作生物肥料以及生物农药，作为生物农药可以防治植物多种病害。一方面该微生物菌株开发成叶面肥，通过喷洒叶面施用能够防治农作物多种植物霜霉病、青霉病、稻瘟病、根腐病、疫病、立枯病、灰霉病、炭疽病等；另一方面该微生物菌株开发成固体生物有机肥，直接施用于土壤或者拌种可以预防生姜、水稻、黄瓜、番茄、豆类、花生、苹果树、梨树、桃树、柑橘、火龙果、百香果、猕猴桃等由镰刀菌Fusarium spp、曲霉属Aspergillus spp、链格孢属Alternariaspp和丝核菌属 Rhizoctonia spp所引起的根部和种子的真菌病害。

该解淀粉芽孢杆菌还可以通过产生类似细胞***素、植物生长激素等物质，促进生姜、水稻、黄瓜、番茄、豆类、花生、苹果树、梨树、桃树、柑橘、火龙果、百香果、猕猴桃等农作物的生长，其发酵液及制得的菌剂可以用于防治植物病害，同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力的优点。

附图说明

图1是本发明XS-2菌落形态；

图2是本发明XS-2菌株水解淀粉；

图3是本发明XS-2菌株水解纤维素；

图4是本发明XS-2菌株水解蛋白质；

图5是本发明XS-2菌株拮抗立枯丝核菌；

图6是本发明XS-2菌株拮抗禾谷镰刀菌；

图7是本发明XS-2菌株拮抗尖孢镰刀菌；

图8是苹果树施加菌肥前；

图9是苹果树施加菌肥后；

图10是同期苹果树不施加菌肥；

图11未施加菌肥；

图12施加菌肥；

图13未施加菌肥；

图14施加菌肥；

图15未施加菌肥；

图16施加菌肥。

本发明的芽孢杆菌菌株，其分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.) XS-2；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2017年7月25日，保藏号编号为：CGMCC No.14454。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。以下实施例中所记载的解淀粉芽孢杆菌,即为前述保藏号编号为：CGMCC No.14454的芽孢杆菌(Bacillus sp.)XS-2。本发明中所涉及的巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌种，均为常规菌种，来源于中国科学院微生物研究所，社会公众可以从该所购买。

实施例1

本发明提供的芽孢杆菌XS-2是在山西运城市苹果园土壤中分离所得。主要采用梯度稀释法、选择筛选培养基，反复划线纯化得到纯培养菌株。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10～15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂粉15g，水1000ml，自然p H值； LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g水1000ml，自然p H值；孟加拉红培养基：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L，琼脂20g/L，1/3000孟加拉红溶液100mL/L，氯霉素0.1g/L。改良高氏1号培养基：硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂15g/L，灭菌后每300ml培养液中加入3％重铬酸钾溶液1mL。无机盐基础培养基：硝酸铵1.0g氯化钙0.1g磷酸氢二钾0.5g氯化铁0.02g磷酸二氢钾0.5g七水硫酸镁0.5g氯化钠 1.0g PH7.0-7.2。

培养滤液的制备：将筛选出的拮抗菌于NA斜面上培养活化24h，移入100m1NB液体培养基中，置28℃180r/min下培养48h，将培养后的菌液经5000r/min离心20min，取上清液，取上清液，经0.22μm细菌过滤器过滤，去除菌体，制成拮抗菌无菌培养滤液，备用。

筛选方法：

土壤微生物筛选：

称取土样10克，放入装有100mL带玻璃珠的无菌水中，置于160转 /分钟的摇床震荡20分钟。将土壤悬液稀释到10^-1至10^-6，根据土壤微生物特点，真菌稀释度10^-4至10^-2涂布PDA和孟加拉红培养皿；放线菌稀释度10^-5至10^-3涂布高氏培养皿；细菌10^-6至10^-4涂布LB培养皿，每个浓度梯度重复3皿，在28℃恒温下培养2-3d。从平板上挑取不同培养性状的单菌落，继续在筛选平板上划线纯化，斜面保存。

植物内生细菌的筛选：

采集健康植株的树皮、茎、叶用无菌水冲洗干净后，各称取5g，用 75％的酒精浸泡3min，然后将叶片用1％次氯酸钠浸泡3min、树皮和茎用0.1％升汞浸泡3min，无菌水冲洗3～5次。取最后一次无菌水冲洗液 0.1ml分别涂布于NA培养基上，置于28℃恒温箱中培养2～3d，观察有无菌落长出，若发现皿中无菌落生成，表明该材料表面消毒彻底，否则不能使用。每5g样品中加入10ml无菌水和少许石英砂将组织研磨成匀浆，静止20min后，各取0.1ml涂NA平板，每处理重复3次，28℃培养 3～5d，计数。挑取不同形态的菌落平板划线纯化，斜面保存。

该菌株的菌落形态为白色、初期半透明、光滑湿润菌落、稍***、近圆形、边缘不整齐、后期表面褶皱、中央突起(如图1)。该菌株为好氧细菌，革兰氏阳性。生理生化检测发现该菌具有产淀粉酶(如图2)、纤维素酶(如图3)、蛋白水解酶(如图4)等特性。根据菌落形态、生理生化实验、分子生物学和PCR鉴定结果，该菌株为一株解淀粉芽孢杆菌。

菌株分子生物学鉴定

用碱变性法抽提细菌总DNA，用真菌与细菌PCR的通用引物515F， 1390R对其基因进行扩增。

515F：GTG YCA GCM GCC GCG GTA A

1390R：GAC GGG CGG TGT GTR CAA

PCR反应体系(50μL)如下：

PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s，35℃退1min， 32个循环后，72℃延伸10min。

PCR扩增产物，通过跑琼脂糖凝胶电泳检验鉴定后，送华大基因测序，测序结果见序列表中序列1所示。将测序得到的序列与NCBI Genbank数据库中己有微生物序列进行同源性比较分析，同源相似性100％。通过相似性分析为解淀粉芽孢杆菌该菌具有良好的拮抗病原菌效果(如图 5,6,7)，具有广谱的抑菌效果，对植物病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、茄病镰孢菌、链格孢属等都有拮抗效果。

为了获得最佳的性价比高的培养基，对该菌株发酵生产工艺进行了条件优化，其发酵生产工艺：培养基为玉米浆10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、NH₄Cl 1g/L，程中用氢氧化钠控制pH＝7.0；温度30℃；转速步骤控制，起始100r/pm，后每4小时提升100转至300rpm，维持300转直至发酵结束；空气流量从1：0.2vvm，随后每8小时提升 0.2vvm直至维持在0.6vvm直到发酵结束。进行一级摇瓶、二级摇瓶培养后进100升罐，一级摇瓶为500ml摇瓶，装液量为20％，培养24小时，二级摇瓶为3L摇瓶，装液量为20％，培养36小时。使菌株的生长密度达到2×10¹⁰cfu/ml。

通过实验，所述的解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2作为配方成分的生物农药及生物肥料复合菌剂的应用，具有增强的抗菌,抑菌效果。所述复合菌剂的配方包括但不限于巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌、淡紫拟青霉等菌的一种或几种。提高防控土传病害和促进农作物的生长。

实施例2

选用所述解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2与巨大芽孢杆菌按质量比1：1 复配制成复合菌剂应用于江苏农垦水稻田实验地。实验组每亩采用10公斤复合微生物菌剂，对照区不施加菌剂。除了正常上水、高温补水外、其他措施均不再使用。每个小区定苗情点，记载小麦茎蘖动态及叶龄进程；关键的生育期：返青期、拔节期、孕穗期小区五点取苗法选取10株稻苗测定干物重及叶面积指数；成熟期进行室内考种：包括株高、穗长、各个节间的比例、穗粒结构等；水稻成熟后及时进行测产和割方计产(1 平方米)。

根据现场试验反馈数据，有效地防控了水稻尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的水稻霜霉病、青霉病、稻瘟病、根腐病、立枯病、稻瘟病，可以使水稻和对照相比增产10％左右。

实施例3

选择在山西省运城市万荣县薛李家村宋家园区作为试验地。此地块苹果树，根腐病的发病比较严重，并且区域发病，向四周辐射扩散。此发病果树长势比较弱、树叶发黄甚至枯死、树抽枝比较慢，整体发病比较严重。严重影响果树的生长，制约着果农预期的收入。选用解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2、胶冻芽孢杆菌和淡紫拟青霉，按质量比1：2：5复配，作为复合生物防治菌剂对目标果树进行防控。漫灌果树根部，用菌剂与灌溉水稀释比例1:50，4L/棵。

选择100棵明显患有根腐病的树。其中50棵作为实验的处理组，50 棵树作为对照组。

经过一个周期的实验，处理组树叶明显变绿，抽枝能力明显增强，树的长势明显转好，枯死率明显低于对照组。复合微生物菌剂有效的防控了由尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌引起的根腐病如图(8,9,10)

结果如下表：

实施例4

选择在山东省潍坊市辖区农田。由于全国生姜常年种植面积约400 万亩，其中山东种植面积约120万亩地，占全国种植面积的30-35％；潍坊市生姜种植面积已达80万余亩；生姜种植附加值高，经济效益可观；目前生姜种植深受连作障碍和土传病害的影响，严重影响生姜的产量和品质，制约着生姜种植农户经济收入。选用解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2、巨大芽孢杆菌和淡紫拟青霉，按质量比1：4：3复配，作为复合功能性微生物菌肥对生姜灌根冲施。选择不同区域、不同地点生姜种植基地100 多亩地，使用功能性微生物菌肥。

经过一个生姜种植周期的试验，施用微生物菌肥的试验田和对照比，生姜试验田苗齐、苗壮、株高、深绿并且和对照比显著提高了生姜的产量，平均每亩地增产20％左右。有效的预防了由尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的生姜土传病害。

实施例5

选择在山东省寿光市辖区农户大棚。由于山东寿光是全国的蔬菜供应基地，种植比较集中，复种指数高，连作障碍比较严重，影响了西红柿的产量和品质，制约着西红柿种植农户的经济收入。因此开发一种高效、绿色的功能性微生物菌肥，改善土壤，消减连作障碍对种植的影响。选用解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2、胶冻芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和淡紫拟青霉，按质量比1：2：4：5复配，作为复合功能性微生物菌肥对西红柿灌根冲施。选择连作5年以上的西红柿种植大棚基地，选择10亩地，使用功能性微生物菌肥。

经过一个西红柿种植周期的试验，施用微生物菌肥的试验田和对照比，西红柿试验田苗齐、苗壮、株高、深绿并且和对照比显著提高了西红柿的产量，平均每亩地增产10％左右。有效的预防了尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的西红柿种植过程中的土传病害。如图(15,16)

实施例6

选择在宁夏中宁县辖区农户西瓜农田。由于宁夏中宁县是全国的西瓜主要供应基地，种植比较集中，复种指数高，连作障碍比较严重，影响了西瓜的产量和品质，制约着西瓜种植农户的经济收入。因此开发一种高效、绿色的功能性微生物菌肥，改善土壤，消减连作障碍对种植的影响。选用解淀粉芽孢杆菌菌株XS-2、巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌，按质量比1：1：3复配，作为复合功能性微生物菌肥对西瓜灌根冲施。选择连作5年以上的西瓜种植大棚基地，选择10亩地，使用功能性微生物菌肥。

经过一个西瓜种植周期的试验，施用微生物菌肥的试验田和对照比，西瓜试验田苗齐、苗壮、深绿、西瓜大、均匀度高并且和对照比显著提高了西瓜的产量，平均每亩地增产20％左右。有效地预防了尖孢镰刀菌、茄病镰孢菌、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、富克葡萄孢盘菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的西红柿种植过程中的土传病害。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种芽孢杆菌菌株及其应用

<130> WPFC1190021

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）

<400> 1

ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60

ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca 120

cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc 180

tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag 240

gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta 300

gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360

ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa 420

ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt 480

tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540

ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag 600

gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660

aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc 720

ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg gaattccact 780

ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc 840

tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat tccggacaac 900

gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta 960

ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac aacagagctt 1020

tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc 1080

ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg 1140

ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac 1200

tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt tatgtctgaa 1260

ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta tcccagtctt 1320

acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg agcaagctcc 1380

catctgtccg ctcgact 1397

Claims

1.一种芽孢杆菌菌株，其特征是，所述菌株的命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)XS-2；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号编号为：CGMCCNo.14454。

2.如权利要求1所述的芽孢杆菌菌株在防控茄病镰孢菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌、美澳型核果褐腐病菌、葡萄座腔菌、链格孢引起的植物霜霉病、青霉病、稻瘟病、根腐病、疫病、立枯病、炭疽病中的应用。

3.含有如权利要求1所述的芽孢杆菌菌株的复合菌剂作为生物肥料的应用，所述复合菌剂的成份为芽孢杆菌(Bacillus sp.)XS-2 、巨大芽孢杆菌、胶冻芽孢杆菌、淡紫拟青霉，质量比范围为：1：(1～3)：(1～4)：(1～5)。