CN113234052A - 细胞外调节蛋白激酶抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN113234052A CN202110423088.8A CN202110423088A CN113234052A CN 113234052 A CN113234052 A CN 113234052A CN 202110423088 A CN202110423088 A CN 202110423088A CN 113234052 A CN113234052 A CN 113234052A
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Abstract

本申请提供了一种ERK1/2抑制剂，其中，ERK1/2抑制剂的结构式如式I所示，该结构式利用其结构上的D环不饱和双键，与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸反应生成稳定且不可逆的共价键，同时，形成3‑5个氢键结合位点，提高与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子‑靶标蛋白结合产物，从而阻遏ERK1/2蛋白质的激活，进而通过下调ERK下游靶基因AREG、EREG的表达，反馈抑制上游EGFR的活化及EGFR通路，最终有效抑制EGFR/MEK/ERK通路活化的细胞系和肿瘤的生长，达到抑癌效果，具有应用于制备抗癌药物的潜力。

Description

细胞外调节蛋白激酶抑制剂及其制备方法与应用
技术领域
本申请属于抑制剂技术领域，尤其涉及一种细胞外调节蛋白激酶抑制剂及其制备方法与应用。
背景技术
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是调控细胞增殖、应激、炎症、分化、功能同步化、转化、凋亡等的信号转导的共同交汇通路之一，通过将胞外信号经受体、G蛋白/小G蛋白、蛋白激酶、转录因子等组成的信号网络，传递到胞内，参与多种生物学行为。在不同的细胞，MAPK通路可接受不同的生长刺激、应激刺激，经过特异的细胞骨架局限的特异信号通路，产生多种效应。细胞外调节蛋白激酶(简称为ERK1/2)是广泛表达的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，也是MAPK信号通路的关键成员，可被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等刺激而激活，进入细胞核，作用于E1k-1、c-myc、c-fos、c-jun、ATF、NF-kB和AP-1等转录因子，促进靶基因的转录与表达，调控细胞的增殖与分化。
当机体出现癌症或其他疾病时，MAPK通路上游组分发生激活突变，ERK1/2的活性相应发生上调，从而导致多种癌症的形成。而大量的临床研究表明，抑制MAPK通路可以抑制部分癌细胞系的生长，进而达到控制疾病的目的。
目前研发的ERK1/2抑制剂绝大多数为非共价结合化合物，在使用过程中，由于ERK1/2抑制剂与Erk1/2激酶区域口袋结合不紧密，导致作用效果不稳定，同时，大部分的ERK1/2抑制剂为人工合成，毒性较高，安全性较差，不利于临床广泛使用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)抑制剂及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中ERK1/2抑制剂与ERK1/2激酶区域口袋结合不紧密，易脱靶导致使用效果不稳定且安全性较差的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种ERK1/2抑制剂，所述ERK1/2抑制剂为Laxiflorin B及其衍生物，其中，所述ERK1/2抑制剂的结构通式如式I所示，
Figure BDA0003028522740000011
式I；
其中，R1选自H、烷基酯、氨基酸成酯、芳基酯、杂芳基酯、取代的芳基酯、取代的杂芳基酯中的任意一种。
第二方面，本申请提供一种ERK1/2抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行分离处理、重结晶浓缩，得到毛萼乙素；
将所述毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理，再进行纯化处理，得到回流产物；
将所述回流产物与还原剂混合进行还原反应，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂。
第三方面，本申请提供ERK1/2抑制剂或ERK1/2抑制剂的制备方法制备得到的ERK1/2抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
本申请第一方面提供的ERK1/2抑制剂，其中，ERK1/2抑制剂的结构式如式I所示，该结构式利用其结构上的D环不饱和双键，与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸通过Michael反应生成稳定的、不可逆的共价键，同时，与ERK1/2激酶区域口袋周围的氨基酸残基形成3-5个氢键。共价键、氢键，以及相匹配的疏水作用和分子形状，有利于提高该化合物与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而阻遏ERK1/2蛋白质的激活。
本申请第二方面提供ERK1/2抑制剂的制备方法中，该制备方法利用天然植物提取毛萼乙素，再以毛萼乙素为原料，利用半合成的方法将毛萼乙素转换为ERK1/2抑制剂，该制备方法原料容易获取，成本低，且操作简单，一方面，相较于其他人工合成的化学抑制剂来说，毒性更低，更安全；另一方面，相较于直接从药用植物中提取Laxiflorin B,能够大幅度的提高Laxiflorin B的产率，容易实现工业化生产应用。
本申请第三方面提供ERK1/2抑制剂能够提高与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而抑制ERK1/2蛋白质的激活，有效地抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路活化的细胞系和肿瘤的生长，进而达到抑癌效果，可应用于制备抗癌药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的制备结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B的流程图。
图2是本申请实施例提供的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对不同细胞的细胞存活抑制作用图。
图3是本申请实施例提供的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对不同细胞的诱导细胞凋亡结果图。
图4是本申请实施例提供的Laxiflorin B对EGFR信号通路的抑制作用图。
图5是本申请实施例提供的Laxiflorin B与EGFR通路成员结合的分析图。
图6是本申请实施例提供的Laxiflorin B与ERK1结合的质谱分析图。
图7是本申请实施例提供的Laxiflorin B的结构类似物Laxiflorin A的结构及活性分析图。
图8是本申请实施例提供的各Laxiflorin B类似物的化学结构图。
图9是本申请实施例提供的Laxiflorin B类似物下拉实验结果图。
图10是本申请实施例提供的Laxiflorin B与ERK1的分子对接结果。
图11是本申请实施例提供的Laxiflorin B与ERK2的分子对接结果。
图12是本申请实施例提供的荷瘤小鼠实验流程及Laxiflorin B抑制肿瘤生长的结果图。
图13是本申请实施例提供的荷瘤小鼠给药三周后肿瘤大小与瘤重分析图。
图14是本申请实施例提供的荷瘤小鼠的体重与给药三周后心脏、肾脏与肝脏的相对重量图。
图15是本申请实施例提供的Laxiflorin B衍生物结构及其细胞活力抑制效果图。
图16是本申请实施例提供的Laxiflorin B的作用效果(以AREG,EREG作为分析指标)分析图。
图17是本申请实施例提供的Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白在荷瘤小鼠肿瘤中的表达分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例第一方面提供一种ERK1/2抑制剂，ERK1/2抑制剂为Laxiflorin B及其衍生物，其中，ERK1/2抑制剂的结构通式如式I所示，
Figure BDA0003028522740000031
其中，R1选自H、烷基酯、氨基酸成酯、芳基酯、杂芳基酯、取代的芳基酯、取代的杂芳基酯中的任一一种。
本申请第一方面提供的ERK1/2抑制剂，其中，ERK1/2抑制剂的结构式如式I所示，该结构式利用其结构上的D环不饱和双键，与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸通过Michael反应生成稳定的、不可逆的共价键，同时，与ERK1/2激酶区域口袋周围的氨基酸残基形成3-5个氢键结合位点，以及相匹配的疏水作用和分子形状，这些有利于提高该结构分子与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而阻遏ERK1/2蛋白质的活化，有效抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路激活的肿瘤中的信号转导进而有效抑制肿瘤的生长，达到抑癌的效果，具有应用于制备抗癌药物的潜力。
具体的，ERK1/2抑制剂
Figure BDA0003028522740000032
结构通式I中，能够与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸通过Michael反应生成稳定的、不可逆的共价键，同时，与ERK1/2激酶区域口袋周围的氨基酸残基形成3-5个氢键结合位点，以及相匹配的疏水作用和分子形状，能够进一步增强与ERK1/2激酶的对接效果。
在一些实施例中，式I中R1选自H，此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-1所示，
Figure BDA0003028522740000033
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000034
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-2所示，
Figure BDA0003028522740000041
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000042
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-3所示，
Figure BDA0003028522740000043
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000044
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-4所示，
Figure BDA0003028522740000045
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000046
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-5所示，
Figure BDA0003028522740000051
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000052
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-6所示，
Figure BDA0003028522740000053
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000054
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-7所示，
Figure BDA0003028522740000055
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000056
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-8所示，
Figure BDA0003028522740000061
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000062
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-9所示，
Figure BDA0003028522740000063
在一些实施例中，式I中R1选自
Figure BDA0003028522740000064
此时ERK1/2抑制剂的结构为式I-10所示，
Figure BDA0003028522740000065
其中，式子I-2～式I-10均是在式I-1的基础上，对式I-1的第六个碳上进行修饰，采用上述取代基进行修饰，能够增加肿瘤细胞对于药物的敏感度，能够增加药物对于肿瘤细胞的毒杀能力，提高对肿瘤的作用效果。
在一些实施例中，ERK1/2抑制剂还包括药学上可接受的辅料、佐剂和前药中的至少一种。
在一些实施例中，对于PC9、HCC827与H1650等三种非小细胞肺癌细胞系，结构式I-1的ERK1/2抑制剂的IC50皆在1μM左右，因此，结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B只需较低浓度就能够对非小细胞肺癌细胞系产生较好的抑制效果。
在一些实施例中，结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B影响了细胞内许多生理反应，包含细胞周期、代谢等方面的内容，同时也影响了细胞内许多信号通路，其中影响最为显着的是ErbB、MAPK通路。
在一些实施例中，采用分子对接的分析，结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B与ERK1和ERK2能够分别形成“inner”构型结合的复合物或“out”构型结合的复合物，其中，与ERK1的183位、ERK2的166位氨基酸形成共价键，很好地结合在ERK1和ERK2的结合口袋内。“inner”构型与ERK1之间无氢键，但是“inner”构型的O5氧原子与ERK2的105位谷氨酰胺侧链形成氢键。“out”构型的O7氧原子与ERK1的171位天冬酰胺侧链形成氢键，但是“out”构型与ERK2之间无氢键。进一步，通过动力学模拟发现Laxiflorin B在ERK1和ERK2表面的结合位点趋于一致。不管是在ERK1还是ERK2的结合口袋内，“out”构型的结合模式都是一致的，Laxiflorin B的O7氧原子与ERK1的128位或ERK2的111位天冬氨酸侧链形成稳定的氢键。而“inner”构型在ERK1的结合口袋内存在3中不同的结合模式，在Erk2中的结合模式与“out”构型一致。动力学模拟发现ERK2的185和187位氨基酸的磷酸化修饰对Laxiflorin B的结合模式存在一定的影响。Laxiflorin B在185和187位磷酸化修饰的ERK2中的结合模式是一致的，但是与磷酸化修饰之前不同。磷酸化修饰之后，Laxiflorin B的O7氧原子与111位天冬氨酸侧链的氢键断裂，但是O5氧原子与ERK2的35位丙氨酸会形成氢键相互作用。
本申请实施例第二方面提供一种ERK1/2抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
S01.获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行分离处理、重结晶浓缩，得到毛萼乙素；
S02.将毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理，再进行纯化处理，得到回流产物；
S03.将回流产物与还原剂混合进行还原反应，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂。
本申请第二方面提供ERK1/2抑制剂的制备方法中，该制备方法利用天然植物提取毛萼乙素，再以毛萼乙素为原料，利用半合成的方法将毛萼乙素转换为ERK1/2抑制剂，该制备方法原料容易获取，成本低，且操作简单，一方面，相较于其他人工合成的化学抑制剂来说，对于动物毒性更低，更安全；另一方面，相较于直接从药用植物中提取Laxiflorin B，能够大幅度的提高Laxiflorin B的产率，容易实现工业化生产应用。
步骤S01中，获取毛萼香茶菜药材粉末的步骤包括：获取毛萼香茶菜药材，将毛萼香茶菜药材进行风干处理后进行粉碎处理成目数为10～60目的毛萼香茶菜药材粉末。
进一步，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理的步骤包括：提供体积百分浓度为80％～85％的甲醇水溶液，对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理2小时；再减压回收甲醇，使浸膏溶剂浓缩至甲醇的体积百分浓度为40％～45％，得到回流提取产物。
进一步，分离处理采用色谱分离处理、凝胶柱分离处理、重结晶分离处理和制备液相分离处理中的任意一种方法进行处理。
在一些实施例中，再依次进行分离处理、重结晶浓缩包括如下步骤：
S011.将回流提取产物进行静置结晶，等有大量白色固体析出，进行过滤处理得到滤液；
S012.将滤液依次经色谱分离、凝胶柱脱色、重结晶和制备液相分离等方法进行纯化，得到滤饼粗提物；
S013.将滤饼粗提物经甲醇加热溶解，经活性炭脱色，过滤，收集滤液进行重结晶浓缩，得到毛萼乙素。
毛萼香茶菜药材采用上述分离流程，成功地从2Kg干燥枝干和50g干燥叶子，成功地从中分离得到500mg以上的毛萼乙素。
步骤S02中，将毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理，再进行纯化处理，得到回流产物。
在一些实施例中，将毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理的步骤包括：将毛萼乙素溶解在二氯甲烷中，加热至回流状态后，加入戴斯-马丁试剂1.5当量，再持续回流2～2.5小时。
进一步的，再进行纯化处理，其中，纯化处理采用柱层析分离进行纯化处理。
在一些实施例中，纯化处理的方法包括：
S021.提供层析检测原料，将层析检测原料和加热回流处理得到的产物反应完全，冷却至室温，得到第一混合液；
S022.在第一混合液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液和饱和的硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，将有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，得到第二混合物；
S023.将第二混合物进行减压旋干溶剂，采用体积比为3：1石油醚-乙酸乙酯混合进行快速柱层析分离，得到回流产物，即醛中间体。
步骤S03中，将回流产物与还原剂混合进行还原反应，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂。
在一些实施例中，将回流产物与还原剂混合进行还原反应的步骤包括：将回流产物溶解在体积比为(10～12)：1的四氢呋喃-乙酸的混合溶液中，得到混合液；将混合液冷却至0℃后，与硼氢化钠混合，进行还原反应30～40分钟。
进一步，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂，其中，纯化处理采用柱层析分离进行纯化处理。
在一些实施例中，纯化处理的方法包括：
S031.提供层析检测原料，将层析检测原料和还原反应得到的产物反应完全，冷却至室温，得到第二混合液；
S032.在第二混合液中加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，将有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，得到第三混合物；
S033.将第三混合物进行减压旋干溶剂，采用体积比为3：1石油醚-乙酸乙酯混合进行快速柱层析分离，得到ERK1/2抑制剂。
其中，得到的ERK1/2抑制剂为结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B。
在一些实施例中，要得到结构式I-2～I-9的ERK1/2抑制剂，制备方法还包括：
G01.以结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B为原料，溶解在二氯甲烷中，以1：1配比加入对应的取代基的酸化合物，冷却至0℃；
G02.加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，缓慢升温至室温反应3小时，得到反应粗产物；
G03.将反应粗产物和层析检测原料反应完全，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压旋干溶剂，采用体积比为2：1的石油醚-乙酸乙酯混合进行快速柱层析分离，得到相应的产物。
本申请实施例第三方面提供ERK1/2抑制剂或ERK1/2抑制剂的制备方法制备得到的ERK1/2抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
本申请第三方面提供ERK1/2抑制剂能够提高与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而抑制ERK1/2蛋白质的活性，通过对信号通路进行抑制进而有效抑制部分癌细胞系的生长，进而达到对疾病的控制的目的，可应用于制备抗癌药物。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
制备结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B
结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B如下：
Figure BDA0003028522740000081
制备方法如图1所示，详细流程如下：
(1)获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行分离处理、重结晶浓缩，得到毛萼乙素：
详细步骤：购买新鲜采摘的毛萼香茶菜药材，枝叶分离，自然风干后粉碎成10-60目，枝叶粉末分别经2小时80％甲醇水回流提取3次，减压回收甲醇，使浸膏溶剂浓缩至甲醇约为40％，转移静置结晶。等有大量白色固体析出，过滤，滤液依次经色谱分离、凝胶柱脱色、重结晶和制备液相分离等方法进行纯化；滤饼粗提物经甲醇加热溶解，经活性炭脱色，过滤，收集滤液进行重结晶纯化。
(2)将毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理，再进行纯化处理，得到回流产物；
详细步骤：以毛萼乙素为起始原料，溶解在二氯甲烷中，加入戴斯-马丁试剂(DMP)，加热回流反应2h；
进一步，加热回流的产物与层析检测原料反应完全，冷却至室温，加入饱和的碳酸氢钠水溶液和饱和的硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压旋干溶剂，经快速柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯)得到回流产物，即醛中间体。
(3)将回流产物与还原剂混合进行还原反应，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂。
详细方法：将回流产物(即醛中间体)溶解在四氢呋喃：乙酸(10：1)的溶液中，冰浴中冷却至0℃，加入硼氢化钠，还原反应30min；
进一步，还原反应得到的产物与层析检测原料反应完全，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压旋干溶剂，经快速柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯)得到Laxiflorin B。
结果分析：
根据实施例1的制备方法，成功地从2Kg毛萼香茶菜药材的干燥枝干和50g从毛萼香茶菜药材的干燥叶子，成功地从中分离得到毛萼乙素500mg以上。且利用半合成的方式,将EB转换成Laxiflorin B，得到的Laxiflorin B的产率为70％。
实施例2
分析结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B的肿瘤抑制效果
试验一试验过程：
(1)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9、HCC827与H1650等三种非小细胞肺癌细胞系，每个不同Laxiflorin B浓度(0、0.25、0.5、1、2、4μM)处理的组别皆作5个复孔，以利后续统计分析。
(2)待细胞贴壁后加入不同浓度的Laxiflorin B，并在不同时间点(24、48、72小时)加入CCK-8呈色试剂，并放置于37℃培养箱，反应2小时。
(3)以酶标仪测定450nm吸光值读数，并以excel作出抑制曲线图。
试验一结果分析：
实施例2试验一的试验结果如图2所示，图2(A)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对PC9细胞的抑制作用图，图2(B)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对HCC827细胞的抑制作用图，图2(C)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对H1650细胞的抑制作用图；图中，X轴为LaxiflorinB浓度(μM)，Y轴为不同细胞活力(％)。当药物浓度抑制50％的细胞活力时，称之为药物对细胞的”半抑制剂量”(IC50)，实验所用三种细胞之IC50皆在1μM左右，说明Laxiflorin B只需较低浓度就能够对于非小细胞肺癌细胞系产生较好的抑制效果。
试验二试验过程：
(1)在96孔板中以5×105颗细胞/孔的密度分别种入PC9、HCC827与H1650等三种非小细胞肺癌细胞系，每个不同Laxiflorin B浓度(0、1、2、4μM)处理的组别皆作3个复孔，以利后续统计分析。
(2)待细胞贴壁后，加入不同浓度的Laxiflorin B处理48小时。
(3)将细胞用胰酶消化后，以碘化丙啶染液(PI)与annexin V-FITC试剂组避光室温染色1小时，以PBS缓冲液清洗并离心，重复3次。
(4)以流式细胞仪分析系胞凋亡的状况，并量化统计。
试验二结果分析：
实施例2试验二的试验结果如图3所示，图3(A)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对PC9细胞的作用图，图3(B)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对HCC827细胞的作用图，图3(C)是ERK1/2抑制剂Laxiflorin B对H1650细胞的作用图。比较各图中的第一象限内的细胞所占百分比，第一象限代表同时有染上PI与annexin V的细胞，属于晚期凋亡细胞，比较结果发现，随着Laxiflorin B浓度增加，能够诱导三种细胞凋亡的百分比就越高，说明LaxiflorinB具有抑癌功能。
实施例3
分析结构式I-1的ERK1/2抑制剂Laxiflorin B下调的信号通路
试验过程：
(1)以0,1,2,4μM的Laxiflorin B处理PC9,HCC827,H1650细胞24小时。
(2)收取总蛋白,并定量蛋白,以Western Blot分析EGFR通路中相关信号蛋白及其磷酸化的表达水平。
结果分析：
实施例3的试验结果如图4所示，透过Western Blot分析,Laxiflorin B处理后,EGFR通路相关蛋白的磷酸化水平,随着化合物剂量增加而下降,说明Laxiflorin B能有效的抑制EGFR相关的信号通路。
实施例4
利用蛋白下拉实验与质谱分析证明Laxiflorin B的靶蛋白及结合氨基酸
试验一试验过程：
(1)将带有生物素(biotin)标记的Laxiflorin B以链霉亲和素的磁珠结合备用。
(2)提取PC9细胞的总蛋白，并取2mg的总蛋白与10μL的磁珠4℃孵育16小时。
(3)以磁力架吸附磁珠，并以PBS缓冲液清洗3次后，以Western Blot法，用EGFR、RAS、RAF、MEK、ERK、RSK、AKT等专一性的抗体检测Laxiflorin B结合的蛋白。
试验一结果分析：
如图5所示，ERK1/2与Laxiflorin B有较为显着的结合，其他蛋白或较弱，或没有信号，说明ERK1/2可能是Laxiflorin B的靶蛋白。
试验二试验过程：
(1)在HEK293T细胞中过表达ERK1-Flag重组蛋白，48小时后提取细胞总蛋白。
(2)将Laxiflorin B与总蛋白4℃孵育16小时后,以偶联抗Flag抗体的磁珠富集ERK1-Flag蛋白,并以PBS缓冲液清洗3次。
(3)向磁珠中加入含有脱氧胆酸钠SDC(sodium deoxycholate)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP(Tris-(2-carboxyethyl)phosphine,Hydrochloride)和氯乙酰胺CAA(Chloroacetamide)的反应液进行一步法还原、烷基化和洗脱。该步骤重复2次，合并洗脱液，加水稀释后加入胰酶酶解过夜。酶解后的肽段溶液通过脱盐柱进行脱盐。在离心浓缩仪抽干后，冻存于-20℃℃等待上机检测。
(4)质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600+液质联用***进行。样品通过微升流速的液相Eksigent microLC 415***进行分离。肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5μm,
Figure BDA0003028522740000101
Figure BDA0003028522740000102
300μm×5mm)，接着被洗脱至分析柱(3μm,
Figure BDA0003028522740000103
300μm×15mm)进行分离。利用两个流动相(流动相A:3％DMSO,0.1％formic acid,97％H2O和流动相B:3％DMSO,0.1％formic acid,97％ACN)建立分析梯度。液相的流速设置为5μL/min。质谱DDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(scan range 350–1500 m/z,ion accumulation time 250ms)，以及随后的40个MS/MS扫描(scan range 100–1500m/z,ion accumulation time 50ms)。信号超过120cps的肽段离子(+2～+5)触发MS/MS扫描。MS/MS重复采集的排除时间设置为18s。
(5)TripleTOF 5600+产生的质谱数据通过ProteinPilot(V4.5)进行检索，采用的数据库检索算法是Paragon。检索使用的数据库是UniProt中Human的蛋白质组参考数据库。检索参数如下：Sample Type选Identification；Cys Alkylation选Iodoacetamide；Digestion选Trypsin；Search Effort设置为Rapid ID。检索结果以Unused≥1.3为标准进行筛选，删去反库中检索的条目和污染蛋白，余下的鉴定信息用作后续分析。基于各蛋白谱图数，筛选不同样品中差异显着的蛋白。为了便于统计分析，并降低低丰度蛋白鉴定造成的假阳性结果，谱图数为0的数据将人为填充为1。计算不同样品中各蛋白谱图数比值(KRAS/HA ratio)及谱图数平均值(MeanSP)，令x＝log2(KRAS/HA ratio)，y＝log2(MeanSP)。
试验二结果分析:
如图6A所示，在ERK1(182-189)的肽段上检测到增加了Laxiflorin B分子量(344.4Da)，且共价结合位置在第183位半胱胺酸。
如图6B所示，在ERK1(166-181)的肽段上检测到增加了Laxiflorin B分子量(344.4Da)，且共价结合位置在第178位半胱胺酸。
实施例5
Laxiflorin B的结构类似物Laxiflorin A(缺少了Laxiflorin B D环上的共价活性)并不具有生物活性
试验分析:
(1)细胞活性检测:
①在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9与A549等非小细胞肺癌细胞系,以不同Laxiflorin A浓度(0,6.25,12.5,25,50,100μM)处理的组别皆作5个复孔，以利后续统计分析。
②待细胞贴壁后加入不同浓度Laxiflorin B的,并在48小时的时间点加入CCK-8呈色试剂,并放置于37℃培养箱,反应2小时。
③以酶标仪测定450nm吸光值读数,并以excel作出抑制曲线图。
(2)信号通路检测:
①在6厘米的培养皿中种入5x105个A549或是PC9细胞,待细胞长到7分满后，以不同Laxiflorin A浓度(0,50,100μM)处理48小时。
②收取总蛋白后,以Western Blot检测与细胞增殖与生存通路相关的蛋白pERK1/2,ERK1/2,pAKT,AKT等蛋白的表达。
结果分析:
结果如图7A所示，Laxiflorin A与Laxiflorin B在结构上只差一个OH基团(如虚线框所示)，而这个OH基团位在Laxiflorin B的结构D环上，能够抑制Laxiflorin B的抑癌活性。
细胞活性检测的结果如图7B和图7C所示，图7B为Laxiflorin A对细胞A549的作用结果分析图，图7C为Laxiflorin A对细胞PC9的作用结果分析图，其中，X轴为Laxiflorin A浓度(μM)，Y轴为细胞活力(％)，由图中可以看出，Laxiflorin A对于细胞A549和细胞PC9的增殖没有抑制的效果。
信号通路检测的结果如图7D和图7E所示，图7D为Laxiflorin A对细胞PC9的作用结果分析图，图7E为Laxiflorin A对细胞A549的作用结果分析图，对于与细胞增殖、生存相关的信号通路也无抑制效果。
实施例6
Laxiflorin B的抑癌活性是透过结构上的D环与ERK1激酶区域ATP口袋中的第183位(Cys)半胱胺酸结合的分析
试验过程:
(1)合成生物素标记的Laxiflorin B类似物:
①在室温条件下，向Eriocalyxin B(344mg,1mmol)的DCM(10mL)溶液中加入戴斯-马丁试剂(852mg,2mmol)。缓慢升温至40℃，搅拌30min后冷却至室温，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和硫代硫酸钠溶液(2ml)淬灭反应。
②加入饱和氯化钠溶液(10mL)，乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到白色固体粉末醛化合物(257mg,0.75mmol)。
③将上述醛化合物溶解在2mL THF溶剂中，加入0.2mL醋酸，冷却至0℃，然后加入硼氢化钠固体(30mg，0.75mmol)，缓慢恢复至室温再反应1小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到白色固体化合物(241mg,0.70mmol，70％总产率)，同时可获得少量天然产物LA(18mg,0.05mmol，5％总产率)。
④通用方法：取Laxiflorin B(或其他天然产物)(17mg，0.05mmol)溶解在1mL二氯甲烷中，依次加入5-炔基戊酸模块(0.05mmol)，EDCI(0.05mmol)和DMAP(cat.)，继续室温反应12小时，TLC检测反应原料完全消失，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。
⑤柱色谱分离(PE/EA＝1:1)得到末端炔基衍生物。将上述粗产品溶解在3mL混合溶剂(THF/H2O＝2:1)中，依次加入已知化合物N3-PEG2-Biotin(0.05mmol)和羧甲基纤维素钠(0.005mmol)，超声脱气3次，氩气保护下加入五水硫酸铜(0.005mmol)，室温反应12小时至TLC检测反应原料完全消失。加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，浓缩。
结果分析：
柱色谱分离(MeOH/DCM＝1:10)得到产物(35mg,0.042mmol,总产率84％)。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.92(t,J＝5.6Hz,1H),7.85(s,1H),6.78(d,J＝10.2Hz,1H),5.96(s,1H),5.88(d,J＝10.2Hz,1H),5.59(s,1H),4.71(d,J＝11.3Hz,1H),4.65(d,J＝11.3Hz,1H),4.56(t,J＝5.1Hz,2H),4.49(dd,J＝7.9,4.8Hz,1H),4.41(dd,J＝13.0,3.8Hz,1H),4.38–4.27(m,2H),3.89(t,J＝5.1Hz,2H),3.66–3.59(m,2H),3.59–3.54(m,2H),3.50(t,J＝5.5Hz,2H),3.39–3.31(m,3H),3.20(ddd,J＝9.0,5.8,4.4Hz,1H),3.14(dd,J＝9.4,4.8Hz,1H),2.92(dd,J＝12.7,5.0Hz,1H),2.81–2.64(m,4H),2.42(t,J＝4.3Hz,1H),2.36(dt,J＝10.1,6.1Hz,3H),2.28(td,J＝14.8,13.6,5.9Hz,2H),2.21(t,J＝7.4Hz,2H),2.05–1.91(m,2H),1.79–1.54(m,6H),1.51–1.37(m,3H),1.28(s,3H),1.23(s,3H).13C NMR(125MHz,MeOD)δ202.4,199.8,174.7,172.6,170.7,164.6,159.1,151.2,146.6,123.7,122.8,118.5,70.0,69.8,69.8,69.2,69.0,62.0,60.3,60.2,58.5,55.6,51.5,49.9,44.3,42.0,39.7,38.9,36.3,35.3,35.0,33.0,30.5,30.2,29.4,28.4,28.1,25.4,24.3,24.2,22.5,17.6.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.for C42H58N6NaO10S:861.3827,found 861.3830.
LA-Biotin：33mg,0.04mmol,总产率80％。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.83(s,1H),6.75(d,J＝10.2Hz,1H),5.85(d,J＝10.2Hz,1H),5.07(dt,J＝10.7,1.8Hz,2H),4.85(s,2H),4.68–4.53(m,3H),4.52–4.43(m,2H),4.44–4.33(m,2H),4.31(dd,J＝7.9,4.5Hz,1H),3.90(t,J＝5.1Hz,2H),3.70–3.54(m,4H),3.51(t,J＝5.6Hz,2H),3.36–3.28(m,7H),3.21(ddd,J＝8.9,5.8,4.4Hz,1H),2.93(dd,J＝12.7,4.9Hz,1H),2.75(t,J＝7.6Hz,2H),2.70(dd,J＝11.7,6.8Hz,3H),2.45(t,J＝4.2Hz,1H),2.41(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(t,J＝7.4Hz,2H),2.09–1.87(m,2H),1.80–1.55(m,4H),1.44(t,J＝7.7Hz,4H),1.27(s,3H),1.21(s,3H).13C NMR(125MHz,MeOD)δ201.1,176.8,174.7,172.9,164.6,159.2,158.8,146.8,123.9,122.8,108.4,81.6,70.0,69.8,69.4,69.2,69.0,62.0,60.6,60.2,55.6,52.3,51.0,49.9,44.5,39.7,38.9,36.1,36.0,35.3,34.8,33.1,32.8,30.6,30.1,28.3,28.1,25.4,24.3,24.2,22.6,16.4.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.for C42H60N6NaO10S:863.3984,found 863.3987.
LB-Di-Biotin：32mg,0.038mmol,总产率76％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(s,1H),7.77(t,J＝5.6Hz,1H),6.37(s,1H),6.32(s,1H),4.71(d,J＝11.6Hz,1H),4.45(t,J＝5.3Hz,2H),4.33–4.25(m,2H),4.24(dd,J＝12.6,3.8Hz,1H),4.19–4.07(m,2H),3.78(t,J＝5.3Hz,2H),3.50(dd,J＝6.2,3.6Hz,3H),3.46(dd,J＝6.0,3.5Hz,2H),3.35(t,J＝5.9Hz,2H),3.15(q,J＝5.8Hz,2H),3.12–3.03(m,1H),2.80(dd,J＝12.4,5.0Hz,1H),2.74–2.50(m,5H),2.32(t,J＝7.5Hz,2H),2.22(ddd,J＝21.4,11.7,5.1Hz,2H),2.09–1.90(m,3H),1.90–1.78(m,2H),1.74(dt,J＝29.5,7.5Hz,1H),1.62–1.52(m,1H),1.51–1.35(m,3H),1.29(s,1H),1.23(s,2H),1.08–0.99(m,9H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ217.1,212.1,172.8,172.7,169.8,163.3,146.5,122.9,70.1,70.0,69.7,69.4,68.9,61.9,61.6,59.8,58.9,56.0,53.7,49.8,48.3,47.6,43.1,39.0,37.1,36.7,35.7,33.6,32.2,31.5,28.8,28.6,25.8,24.9,24.8,24.2,20.1,17.9,12.0.HRMS(ESI/[M+Na]+)calcd.forC42H62N6NaO10S:865.4140,found 865.4145.
LB-Ala：(24mg,0.045mmol,90％)。1H NMR(300MHz,Methanol-d4)δ6.80(d,J＝10.2Hz,1H),6.01(s,1H),5.90(d,J＝10.2Hz,1H),5.62(s,1H),4.74(d,J＝11.3Hz,1H),4.67–4.45(m,3H),4.08(q,J＝7.3Hz,1H),3.16(dd,J＝9.3,4.8Hz,1H),2.71(d,J＝12.5Hz,1H),2.48(t,J＝4.2Hz,1H),2.38(dd,J＝12.3,4.6Hz,1H),2.29(dd,J＝12.4,5.2Hz,2H),1.78–1.40(m,5H),1.32–1.12(m,7H).13C NMR(75MHz,MeOD)δ202.5,199.1,170.3,169.2,158.6,150.9,143.0,123.5,118.2,90.1,69.3,62.3,58.1,51.1,44.1,41.9,36.0,34.7,30.1,29.7,29.3,24.3,22.5,17.3,14.4.HRMS(ESI/[M+H]+)calcd.forC23H30NO6:416.2068,found 416.2074.
实施例7
药物蛋白下拉实验:
试验过程：
1.将生物素标记的Laxiflorin B,Laxiflorin A,Eriocalyxin B,Laxiflorin J,Laxiflorin B-Di与链霉素偶联的磁珠在4℃结合16小时后备用。
2.在HEK293T细胞内过表达重组蛋白Flag-ERK1WT,Flag-ERK1C178A(第178位半胱胺酸突变成丙胺酸),Flag-ERK1C183A(第183位半胱胺酸突变成丙胺酸),Flag-ERK1C178A/C183A(第178与183位半胱胺酸突变成丙胺酸),48小时后提取细胞总蛋白。
3.将四种重组蛋白分别与五种化合物的磁珠复合物在4℃孵育16小时后,以含有2％SDS的PBS涡旋20秒,重复清洗三次。
4.以Western blot检测被五种化合物的磁珠复合所下拉的重组蛋白Flag标签,来判读Laxiflorin B上结构的重要位置。
结果分析:
(1)图8中,Laxiflorin A是去除D环活性的Laxiflorin B类似物；Eriocalyxin B是空间结构上的Laxiflorin B类似物；Laxiflorin J是去除A环活性的Laxiflorin B类似物；Laxiflorin B-DI是去除A环与D环活性的Laxiflorin B类似物,分别在第6个碳的位置上连接上生物素,并不影响化合物A环或D环的活性。
(2)图9中，图9(A)与图9(B)图中,下拉实验可以看到野生型的ERK1(ERK1WT)能与Laxiflorin A,Laxiflorin B及Laxiflorin J有较强的结合,而这两者皆有A环或D环,说明Laxiflorin B是利用A环或D环与ERK1相结合,而立体空间结构不同的Eriocalyxin B,则结合能力较差,若是把A环与D环同时破坏后,则Laxiflorin B-DI与ERK1的结合能力最差。
图9(A)与图9(B)图中,若是将ERK1的178位半胱胺酸突变成丙胺酸后,只剩下ATP口袋位置中的183半胱胺酸,则Laxiflorin B是最强的,其次是Eriocalyxin B与Laxiflorin J,说明D环与化合物的立体结构,对于Laxiflorin B结合ERK1是重要的,相较于只有A环的Laxiflorin A结合能力与A环D环都缺乏的Laxiflorin B-DI相当。
图9(A)与图9(B)图中,若是将ERK1 ATP口袋位置中的第183位半胱胺酸酸突变成丙胺酸后,可以发现只具有A环的Laxiflorin A结合能力最强,说明远离ERK1活性口袋位置的第178位半胱胺酸与A环的结合概率较大,也因为第178位半胱胺酸远离ERK1的活性口袋位置,因此结合上ERK1也没有肿瘤抑制活性,而Laxiflorin B也具有完整的A环,因此约有一半的Laxiflorin B会与第178位半胱胺酸结合,造成Laxiflorin B药效的损失,而不论是Eriocalyxin B,或是只含有D环的Laxiflorin J,或是A环D环都缺少的Laxiflorin B-DI都无法与第178位半胱胺酸结合。
图9(A)与图9(B)图中,若是将ERK1的第178与183位半胱胺酸皆突变成丙胺酸,则无论是Laxiflorin B,Laxiflorin A,Eriocalyxin B,Laxiflorin J,Laxiflorin B-Di都无法结合,说明ERK1的这两个半胱胺酸位点对于Laxiflorin B类似物的结合是重要的。
综合以上，Laxiflorin B是透过结构上的D环双键结构与ERK1 ATP口袋位置中的第183位半胱胺酸共价结合后，占住ATP口袋，抑制ERK1与ATP的结合与ERK1活化，进而发挥抑制肿瘤细胞生长的效果。Laxiflorin A可以利用A环选择性的与ERK非活性位点结合，可成为靶向ERK的新型小分子探针，为靶向ERK激酶的蛋白质修饰与标记研究提供小分子导向基团。
实施例8
利用计算机模拟分析证明Laxiflorin B与靶蛋白的相互作用
试验过程：
(1)从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)编码为6GES和6G54的实验结构中提取ERK1和ERK2的三维结构用于准备分子对接。采用HADDOCK2.2网页对接软件(https://alcazar.science.uu.n1/services/HADDOCK2.2/)分别将Laxiflorin B共价对接到ERK1的第183位半胱氨酸和Ekr2的第166位半胱氨酸上，同时考虑Laxiflorin B结合时的不同朝向(“out”和“inner”)。通过聚类分析和打分函数排序，HADDOCK2.2输出3大类ERK1与Laxiflorin B的“inner”构型结合的复合物，1大类ERK1与Laxiflorin B的“out”构型结合的复合物，4大类ERK2与Laxiflorin B的“inner”构型结合的复合物，5大类ERK2与Laxiflorin B的“out”构型结合的复合物。使用PYMOL等可视化软件对各类结构进行人为检查，分别选择结构进行后续的分子动力学模拟研究。
(2)Laxiflorin B共价对接到半光氨基酸上，为非标准氨基酸，项目采取如下步骤准备Laxiflorin B的力场参数：一、运用Gaussian09软件计算Laxiflorin B的表面电势，计算方法和基组为HF/6-31G*；二、运用AMBER16软件包中的RESP模块，针对Gaussian09输出的表面电势，拟合Laxiflorin B及其共价结合半光氨基酸的点电荷；三、使用AMBER16软件包中的ANTECHAMBER模块准备Laxiflorin B及其共价结合半光氨基酸的参数文件，力场参数选择GAFF2。
(3)ERK1/ERK2参数的准备过程：PDB数据库编码为6GES和6G54的实验结构分别用于ERK1和ERK2模拟的起始结构，由于部分N端和C端氨基酸在实验结构中缺失，仅6GES中的P25-G374氨基酸片段和6G54中的G10-P356片段参与ERK1和ERK2的模拟。确定组氨酸的质子化状态，此项目中组氨酸的质子化状态采用AMBER16中的默认状态。所有氨基酸的参数来自AMBER16软件包中的FF14SB力场。
(4)运用AMBER16软件包中的tleap整合ERK1/ERK2和Laxiflorin B的参数，流程如下：一、运用tleap分别导入ERK1/ERK2和Laxiflorin B的参数文件，导入第1步中挑选的代表性结构。二、在ERK1/ERK2的表面加水箱，水箱大小为
Figure BDA0003028522740000141
三、向整个体系加中和离子。四、输出体系的参数文件和坐标文件，准备动力学模拟。
(5)采用AMBER16中的PMEMD模块进行动力学模拟，模拟过程如下：一、限制ERK1/ERK2和Laxiflorin B的重原子，优化水分子和氢原子直至能量收敛。二、不加任何限制，优化整个体系直至能量收敛。三、限制ERK1/ERK2和Laxiflorin B的重原子，在NVT系综中，整个体系的温度在1ns内从0K上升至300K。四、去掉所有限制，在NPT系综内，300K温度下整个体系模拟2ns，优化整个体系。五、对整个体系进行200ns的动力学模拟，存储模拟轨迹进行分析。
(6)模拟ERK2中第185和187位氨基酸磷酸化修饰对Laxiflorin B结合的影响。ERK2和Laxiflorin B的参数保持不变，磷酸化参数来自于AMBER网址(http://ambermd.org/)中。参数准备和模拟过程与以上流程保持一致，对体系模拟200ns，保存轨迹进行分析。
结果分析：
分子对接的结果如图10和图11所示，其中，图10是Laxiflorin B与ERK1的分子对接结果，图11是Laxiflorin B与ERK2的分子对接结果。
通过分子对接发现：不管是“inner”还是“out”构型，Laxiflorin B都能够与ERK1的183、ERK2的第166位氨基酸形成共价键，很好地结合在ERK1和ERK2的结合口袋内。不同构型的Laxiflorin B与ERK1、ERK2的对接结果有些许区别，其中，当Laxiflorin B为“inner”构型，与ERK1之间无氢键；与ERK2对接时，Laxiflorin B的O5氧原子与ERK2的第105位谷氨酰胺侧链形成氢键。当Laxiflorin B为“out”构型，与ERK1对接时，Laxiflorin B的O7氧原子与ERK1的第171位天冬酰胺侧链形成氢键；与ERK2之间无氢键。
进一步的，通过动力学模拟发现Laxiflorin B在ERK1和ERK2表面的结合位点趋于一致。如图10和图11所示，不管是在ERK1还是ERK2的结合口袋内，“out”构型的结合模式都是一致的，Laxiflorin B的O7氧原子与ERK1的第128位或ERK2的第111位天冬氨酸侧链形成稳定的氢键。而“inner”构型在ERK1的结合口袋内存在3中不同的结合模式，在ERK2中的结合模式与“out”构型一致。
动力学模拟发现ERK2的第185和187位氨基酸的磷酸化修饰对Laxiflorin B的结合模式存在一定的影响。Laxiflorin B在第185和187位磷酸化修饰的ERK2中的结合模式是一致的，但是与磷酸化修饰之前不同。磷酸化修饰之后，Laxiflorin B的O7氧原子与第111位天冬氨酸侧链的氢键断裂，但是O5氧原子与ERK2的第35位丙氨酸会形成氢键相互作用。
实施例9
利用动物实验分析证明水溶性较佳的式I-10的Laxiflorin B-Ala的抑癌效果
试验过程如图12(A)所示:
(1)将PC9细胞以5×106/只老鼠的浓度已注射的方式接种至裸鼠皮下，待其生长1周。
(2)对照组给予生理食盐水，实验组分别给予5、10、20mg/kg的Laxiflorin B-Ala，以腹腔注射的方式每天给药，连续3周，并每两天测量一次肿瘤大小与小鼠体重，监测药物毒性。
(3)三周后取出鼠背上的肿瘤与内脏，并秤重拍照。
结果分析:
图12(B)所示，显示Laxiflorin B-Ala抑制肿瘤生长的情况，从图12(B)中可以看出，Laxiflorin B三周内能有效的抑制肿瘤生长。
图13所示，图13(A)为给药三周后的肿瘤拍照图，图13(B)为肿瘤重量量化图与统计分析结果。
图14(A)为小鼠给药三周内的体重检测，可以看出，体重并未有明显下降,小鼠并未因给予Laxiflorin B而明显消瘦。图14(B)为小鼠心脏、肾脏与肝脏的重量除以个体体重的统计量化图，实验组与对照组并未有明显差异，说明Laxiflorin B对于小鼠毒性低。(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001)
实施例10
制备结构式I-2～I-10的ERK1/2抑制剂
试验过程：
(1)类似物制备通用方法：以Laxiflorin B为原料，溶解在二氯甲烷中，以1：1配比加入对应的酸化合物模块，冷却至0℃。加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，缓慢升温至室温反应3小时。层析检测原料反应完全，加入饱和的碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后经饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压旋干溶剂，经快速柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯)得到相应的结构式I-2～I-10的ERK1/2抑制剂，其结构如图15(A)所示。
(2)在96孔板中以3000-5000颗细胞/孔的密度分别种入PC9细胞,每个不同Laxiflorin B类似物(如图15A所示，结构式I-2～I-10的ERK1/2抑制剂浓度(0,0.15625,0.3125,0.625,1.25,2.5,5μM)处理的组别皆作5个复孔,以利后续统计分析。
(3)待细胞贴壁后加入不同浓度Laxiflorin B类似物的,48小时后加入CCK-8呈色试剂,并放置于37℃培养箱,反应2小时。
(4)以酶标仪测定450nm吸光值读数,并以excel作出抑制曲线图。
结果分析:
如图15(B)，X轴为Laxiflorin B浓度(μM),Y轴为细胞活力(％)，当药物浓度抑制50％的细胞活力时,称之为药物对细胞的”半抑制剂量”(IC50)，跟Laxiflorin B相较，结构式I-3、结构式I-4、结构式I-5、结构式I-6、结构式I-8的ERK1/2抑制剂皆有较佳的抑制效果。
实施例11
Laxiflorin B的作用效果分析实验(以AREG,EREG作为分析指标)
试验过程：
(1)以DMSO或Laxiflorin B(4μM)处理PC9或HCC827细胞24小时后，以Trizol试剂回收RNA后，反转为cDNA。再以AREG、EREG专一性的引物进行检测并分析二者基因的表达情况。
(2)以不同浓度的Laxiflorin B处理PC9或是HCC827细胞48小时后，收取总蛋白，采用Western Blot，以专一性的抗体检测Amphiregulin(AREG基因產物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白的表达量。
(3)在动物实验中，将裸鼠北部的肿瘤取出后，采用石蜡进行包埋并切片处理，以专一性的抗体用免疫组化的方式，检测Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白在肿瘤中的表达位置及表达量。
结果分析：
如图16(A)和图16(B)所示，Laxiflorin B处理之后，非小细胞肺癌细胞中的AREG、EREG的mRNA水平表达量显著下调。
如图16(C)所示,在不同剂量的Laxiflorin B处理之后,非小细胞肺癌细胞中的Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白水平表达量显著下调，且由剂量依赖的响应。
Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白在肿瘤中的表达位置及表达量的分析如图17所示，以Laxiflorin B处理三周后的裸鼠体内肿瘤，经过组织切片与免疫组化的分析，Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)蛋白水平表达量显著下调，与细胞中现象一致。综上，本申请提供的ERK1/2抑制剂，其中，ERK1/2抑制剂的结构式如式I所示，该结构式利用其结构上的D环不饱和双键，与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183/166位半胱氨酸通过Michael反应生成稳定的、不可逆的共价键，同时，与ERK1/2激酶区域口袋周围的氨基酸残基形成3-5个氢键结合位点，以及相匹配的疏水作用和分子形状，这些有利于提高该结构分子与靶标蛋白ERK1/2作用口袋的结合能力，并稳定共价小分子-靶标蛋白结合产物，从而阻遏ERK1/2蛋白质的激活，进而通过下调ERK下游靶基因AREG,EREG的表达，反馈抑制上游EGFR的活化及EGFR通路,最终有效抑制EGFR/MEK/ERK通路活化的细胞系和肿瘤的生长，达到抑癌效果，具有应用于制备抗癌药物的潜力。而AREG,EREG的表达,可作为这种ERK1/2抑制剂和EGFR/MEK/ERK通路阻断的疗效评估指标。
同时，提供ERK1/2抑制剂的制备方法中，该制备方法利用天然植物提取毛萼乙素，再以毛萼乙素为原料，利用半合成的方法将毛萼乙素转换为ERK1/2抑制剂，该制备方法原料容易获取，成本低，且操作简单，一方面，相较于其他人工合成的化学抑制剂来说，对于动物毒性更低，更安全；另一方面，相较于直接从药用植物中提取Laxiflorin B,能够大幅度的提高Laxiflorin B的产率，容易实现工业化生产应用。而在未來Laxiflorin B的临床应用上，可以凭借血液或组织中Amphiregulin(AREG基因产物)、Epiregulin(EREG基因产物)的表达量，作为用药成效的评估指标。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种ERK1/2抑制剂，其特征在于，所述ERK1/2抑制剂为Laxiflorin B及其衍生物，其中，所述ERK1/2抑制剂的结构通式如式I所示，
Figure FDA0003028522730000011
其中，R1选自H、烷基酯、氨基酸成酯、芳基酯、杂芳基酯、取代的芳基酯、取代的杂芳基酯中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的ERK1/2抑制剂，其特征在于，所述R1选自以下取代基的任意一种，
Figure FDA0003028522730000012
3.根据权利要求1所述的ERK1/2抑制剂，其特征在于，所述ERK1/2抑制剂分别与ERK1/2激酶区域口袋位置的第183半胱氨酸、第166位半胱氨酸共价结合，并形成3～5个氢键进行作用。
4.根据权利要求1～3任一所述的ERK1/2抑制剂，其特征在于，所述ERK1/2抑制剂还包括药学上可接受的辅料、佐剂和前药中的至少一种。
5.一种ERK1/2抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取毛萼香茶菜药材粉末，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理，再依次进行分离处理、重结晶浓缩，得到毛萼乙素；
将所述毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理，再进行纯化处理，得到回流产物；
将所述回流产物与还原剂混合进行还原反应，再进行纯化处理，得到ERK1/2抑制剂。
6.根据权利要求5所述的ERK1/2抑制剂的制备方法，其特征在于，所述获取毛萼香茶菜药材粉末的步骤包括：获取毛萼香茶菜药材，将所述毛萼香茶菜药材进行风干处理后进行粉碎处理成目数为10～60目的毛萼香茶菜药材粉末。
7.根据权利要求5所述的ERK1/2抑制剂的制备方法，其特征在于，采用醇类溶液对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理的步骤包括：提供体积百分浓度为80％～85％的甲醇水溶液，对所述毛萼香茶菜药材粉末进行回流提取处理2小时；再减压回收甲醇，使浸膏溶剂浓缩至甲醇的体积百分浓度为40％～45％，得到回流提取产物；和/或，
所述分离处理采用色谱分离处理、凝胶柱分离处理、重结晶分离处理和制备液相分离处理中的任意一种方法进行处理。
8.根据权利要求5所述的ERK1/2抑制剂的制备方法，其特征在于，将所述毛萼乙素与有机溶剂混合进行加热回流处理的步骤包括：将所述毛萼乙素与二氯甲烷、戴斯-马丁试剂混合处理，进行加热回流2～2.5小时；和/或，
将所述回流产物与还原剂混合进行还原反应的步骤包括：将所述回流产物溶解在体积比为(10～12)：1的四氢呋喃-乙酸的混合溶液中，得到混合液；将所述混合液冷却至0℃后，与硼氢化钠混合，进行还原反应30～40分钟。
9.根据权利要求5所述的ERK1/2抑制剂的制备方法，其特征在于，所述纯化处理采用柱层析分离进行纯化处理。
10.权利要求1～4任一所述的ERK1/2抑制剂或权利要求5～9任一所述的ERK1/2抑制剂的制备方法制备得到的ERK1/2抑制剂在制备抗癌药物中的应用。
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