CN1132211A - 纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法 - Google Patents

Abstract

一种从重组生物体细胞中纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，其特征在于所述的细胞是用含离液盐的缓冲液破碎的。

Description

纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒 表面抗原的方法

本发明涉及纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，更具体地，涉及从重组酵母细胞纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，所述的方法包括一个细胞破碎步骤，该步骤中通过使用离液盐而防止preS2肽的损失，接着进行抽提、沉淀、二氧化硅吸附以及柱层析。

乙型肝炎是一种世界范围的公众健康问题并据称世界人口中约有2-3亿人携带乙型肝炎病毒(HBV)。HBV感染通常会引发肝硬化和肝细胞癌，可能会使患者死亡。

到目前未止尚未开发出乙型肝炎的治疗剂，因此疫苗的重要性就更加强了。

1955年Blumberg等从乙型肝炎患者的血中发现了澳大利亚抗原；1971年Krugman等报道了使用热处理的含HBV的人血清的活性免疫方法，从而提供了开发乙型肝炎疫苗的可能性。从那以后，通过从乙型肝炎患者的血浆中分离并纯化乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)而制备的第一代乙型肝炎疫苗已经商品化(M.R.Hilleman等，Develop.Bio.Standard，54，3-12(1983))。

然而从血浆制得的疫苗存在以下问题：它们的纯化和失活过程很复杂并且费用很高；人血供应有限；接种者有可能被血源中的病原感染。

因此，为解决上述问题已尝试使用遗传工程手段开发乙型肝炎疫苗。

例如，Valenzuela等开发了一种在酵母中生产HBsAg的方法(Nature，293，347-350(1982))。这种重组HBsAg(r-HBsAg)主要由具有226个氨基酸的S蛋白(P25)组成，并且当其纯化时会形成与那些从血浆中分离出的HBsAg几乎相同的表面抗原颗粒。

K.H.Heermann等报道乙型肝炎包膜蛋白含有大量的L-蛋白(preS1+preS2+S：P39)、M-蛋白(preS2+S：P31)以及S-蛋白(J.Virol.，Nov.396-402(1984))。已知preS1肽在人体感染乙型肝炎病毒后对于杀灭肝上的乙型肝炎病毒有重要作用。preS2肽由55个氨基酸组成，在动物实验中已证实其帮助形成抗表面抗原的抗体(D.R.Milich等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，8168-8172(1985))。

另外，已知形成的抗preS2肽的抗体表现出对病毒感染的防御活性(Y.Ito等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83，9174-9178(1986))。因此，含preS2肽的疫苗可能对不能形成抗预先已存在的表面抗原的抗体的人是有用的。这种疫苗的开发对于保护不受新近发现的乙型肝炎病毒变种的感染也是很重要的。

但是由于preS肽对存在于酵母细胞中的蛋白酶非常敏感，所以制备含preS肽的乙型肝炎病毒表面抗原遇到了各种困难。为克服这些困难，Kobayashi等生产了一种疫苗，其是通过对preS2和S肽之间的蛋白酶敏感区进行遗传修饰而制备的(J.Bacteriology，8，1-22(1988))；美国专利4,742,158公开了一种生产含preS肽的疫苗的方法，其中通过在细胞破碎步骤中使用一种蛋白酶抑制剂保护所述的肽不受蛋白酶攻击。然而，Kobayashi等的遗传修饰方法对preS2肽的活性的影响没有充分阐明，而后一方法是不实用的，因为蛋白酶抑制剂太昂贵而不能用在大量纯化过程中。另外，当由于纯化规模或纯化要求加大而使得纯化时间变长时，不管蛋白酶抑制剂的用量多大都不能使preS2肽的水平保持在一定量。

欧洲专利0337492A1提供了一种用硫氰酸钾从毕赤酵母培养物中提纯HBsAg的方法。硫氰酸钾用于提高亲脂蛋白的产量，整个方法的目的是纯化仅含S肽的HBsAg。当HBsAg还包含位于由226个氨基酸组成的S肽之前的由55个氨基酸组成的preS2肽时，它的免疫性质与仅含S肽的表面抗原的免疫性质相似，因为S肽组分的抗原性和免疫原性是相同的。但是这两种表面抗原的物理化学特性都是不同的。特别是preS2肽有足够的亲水性而可暴露在抗原颗粒的表面，因此，它对纯化步骤有重要的影响。

因此，已开发出各种纯化含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法。

欧洲专利0130178A1描述了一种用于纯化含preS2肽的HBsAg的方法，其特征在于用向酵母抽提物中加入适量的葡聚糖和甘油而制备的两个液相来分离表面抗原。但是这种方法存在以下问题：分离的抗原不够纯，该方法不适于大规模纯化过程，因为葡聚糖和聚乙二醇很贵；由于需附加步骤以除去所用的表面活性剂所以不经济。

美国专利4,742,158描述了一种用于纯化含preS2肽的HBsAg的方法，其包括：在各种蛋白酶抑制剂的存在下制备酵母抽提物，通过一系列柱层析分离步骤从酵母抽提物中提纯表面抗原，所述的柱层析步骤使用将人血清白蛋白聚合物连到凝胶基质上制备的亲和柱以及用表面活性剂洗脱的疏水柱。但是，此方法的缺陷在于其中所用的蛋白酶抑制剂很贵；亲和柱不适于大量纯化；以及需特殊的步骤以除去疏水柱层析中使用的表面活性剂。

M.Kobayashi等还报道了一种用于纯化含preS2肽的HBsAg的方法(J.of Biotechnology，8，1-22(1988)。但是这种方法由于采用了导致低产率的免疫亲和柱而不适于大量纯化过程。

韩国专利065305公开了一种用于纯化HBsAg的方法，其包括pH沉淀、二氧化硅和阴离子交换柱层析。该方法的缺点是很难使preS2肽的含量保持在一合适的水平，因为preS2肽在该方法的最初步骤中被蛋白酶消化。

因此，还是需要一种纯化含preS2肽的HBsAg的有效的方法。

因此，本发明的主要目的在于提供一种从酵母细胞中纯化含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，该方法将该表面抗原纯化至足够的纯化状态以便能直接掺入到疫苗中。

根据本发明的一个方面，提供了一种纯化在重组生物体中表达的含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，其特征在于用含离液盐的缓冲液破碎所述的重组生物体细胞。

本发明的上述和其它目的及特征将通过结合附图所做的以下描述而变得清楚，其中：

图1为15％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果，其证实了当含preS2肽的表面抗原在硫氰酸钠作为离液盐存在下被纯化时在HBsAg中的preS2的肽的含量。

本发明提供了一种纯化在重组生物体中表达的含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，其特征在于用含离液盐的缓冲液以使preS2肽的损失在最小程度。使用含离液盐的缓冲液破碎细胞促进了HBsAg颗粒的形成并保护preS2肽不受蛋白酶的攻击(通常此攻击发生在纯化的初始步骤)，从而能使preS2肽含量保持在恒定水平直至纯化过程完成。

本发明的方法可以应用于一种用于纯化在任何合适的重组生物体，优选为重组酵母细胞例如酿酒酵母中生产的HBs Ag的方法。

可以用于本发明的合适的离液盐包括硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、盐酸胍和尿素；优选为硫氰酸钠。

任何传统的缓冲液***，例如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，可以用于本发明方法的细胞破碎步骤；缓冲液的pH优选调至6-8。在缓冲液中的离液盐的浓度可以为1-8M，优选为1-3M。

当使用含上述离液盐的缓冲液破碎重组细胞时，其余的纯化过程可以采用传统纯化步骤的任意组合来进行，但本发明方法优选包括下述步骤：

(a)向重组细胞匀浆中加入表面活性剂以从细胞膜中抽提表面抗原；

(b)通过碱化步骤(a)中得到的抽提物增加表面抗原溶解性并促进在抽提物中形成表面抗原颗粒；

(c)通过酸化经步骤(b)处理的抽提物并随之离心以从抽提物中沉淀并除去细胞碎片、脂类和杂蛋白，得到含表面抗原的溶液；

(d)将步骤(c)中得到的溶液与二氧化硅接触以将表面抗原吸附于二氧化硅上，洗去杂蛋白，采用缓冲液使表面抗原从二氧化硅上脱附以获得纯化表面抗原组分；

(e)将步骤(d)中得到的纯化表面抗原组分进行疏水柱层析以得到含表面抗原的组分；以及

(f)采用大小排阻凝胶过滤层析纯化步骤(e)中得到的组分以获得纯化形式的表面抗原。

可用于上述步骤(a)从细胞膜中抽提表面抗原的表面活性剂的例子包括：吐温^20，吐温^80、Triton X-100和脱氧胆酸钠，其中吐温20是优选的。以细胞匀浆的量计，表面活性剂的用量可为0.1-0.5％(w/v)，优选为0.1-0.2％(w/v)。

为了增加表面抗原在细胞匀浆中的溶解性并促进其颗粒的形成，优选的是通过用碱，优选为氢氧化钠和氢氧化钾将表面抗原抽提物的pH升至11.0-13.5。据认为这一碱化过程通过增加的溶解性增加分子间二硫键并将杂蛋白从HBs Ag中解离而促进HBs Ag颗粒形成。随后，优选将抽提物置于0-30℃下0.5-1小时。

随后，酸化抽提物以沉淀细胞碎片、脂类和杂蛋白，其中抽提物的pH降至4.5-6.0。可用于本步骤的代表性的酸包括无机酸或有机酸的任一种，优选为10-30％乙酸溶液。酸化反应可以在0-30℃下进行0.5-2小时，优选在搅拌下进行。离心酸化的抽提物以除去得到的沉淀物，获得含表面抗原的上清液。这一步骤的优点在于一个简单的离心步骤即同时除去了细胞碎片、脂类和杂蛋白，以及由于前面的在高pH下溶解表面抗原的步骤使得表面抗原的产率很高。

升高并然后降低细胞抽提物的pH稳定了表面抗原的颗粒形成性质，并能有效地除去脂类和杂蛋白。

然而，当在细胞破碎步骤中使用硫氰酸盐作为离液盐时，在酸化步骤中可能会散发出臭味。硫氰酸盐本身是无色、无味和无害的化合物并且硫氰酸根离子在溶液中很稳定。因此，据认为酸化步骤中产生的气味是由于硫氰酸盐与细胞抽提物中的某些物质反应所致。这种气味在小规模纯化过程中操作者是可以忍受的，但在大规模操作中，优选在酸化步骤前除去所述的硫氰酸盐。

例如，优选可以通过下述方法除去硫氰酸盐，在例如上述步骤(a)后立即向细胞抽提物中加入合适的盐以将硫氰酸盐与一些杂蛋白一起沉淀；通过例如离心除去沉淀物；以及渗滤得到的上清液。在这一步骤中表面抗原不沉淀。另外，硫氰酸盐与部分杂蛋白同时除去也有利于后续的纯化过程。

可以用于除臭过程的优选的盐包括多电荷阴离子盐，例如硫酸钠和硫酸铵，浓度为8-15％(w/v)。将表面抗原从细胞膜中抽提出之后，加入盐并在搅拌或不搅拌下在室温进行反应0.5-2小时。得到的沉淀物可以通过传统方法例如离心除去以得到含表面抗原的上清液。将得到的上清液重复渗滤以除去硫氰酸盐和硫酸盐。这一步骤中使用的缓冲液优选为pH6-8。当完成盐处理，离心和渗滤步骤后，将得到的上清液进行步骤(b)和(c)的过程。

利用柱或分批法用二氧化硅处理步骤(c)得到的含表面抗原的上清液，优选分批法。此步骤中使用的合适的二氧化硅为表面积为100-500m²/g的微晶二氧化硅；并优选采用Aerosil^380(Degussa，Germany)。通过剧烈搅拌将含表面抗原的上清液与二氧化硅浆液在pH6-8、4-30℃下接触2-16小时。以细胞饼块的重量计，用于吸附表面抗原的干二氧化硅量优选为约5％(w/v)。利用传统方法，例如离心将表面抗原-二氧化硅复合体从溶液中分离出来。

随后，用pH6-8的缓冲液，优选为磷酸钠-氯化钠缓冲液洗复合体例如三次以除去二氧化硅中残留的杂蛋白。通过将复合体与合适的缓冲液接触约2小时可使表面抗原从二氧化硅上脱附。

pH8.8-11.0的缓冲液，优选为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液可以合适地用在此步骤中。缓冲液还可含有1-8M尿素以及0.1-0.3％(重量)表面活性剂(优选为脱氧胆酸钠)。随后用传统方法，例如离心从溶液中除去二氧化硅，得到含表面抗原的上清液。然而当在脱附步骤中使用脱氧胆酸钠时，必须通过重复渗滤除去它。

上述得到的含表面抗原的上清液可以进一步由疏水柱层析进行纯化，其中的疏水性树脂优选为带苯基残基的琼脂糖凝胶。在上清液与疏水性树脂接触之前，用pH8.8-11.0的缓冲液平衡填充材料，即疏水性树脂，该缓冲液可以是前一步骤中使用的相同的缓冲液。该缓冲液优选可含有浓度为1-4M的尿素以便最大限度地除去比表面抗原较不疏水的杂蛋白。

随后含表面抗原的上清液过柱以与其中的填充材料接触。用含10-40％(重量)乙二醇的平衡缓冲液洗柱以从填充材料中除去相对较弱吸附的杂蛋白。然后用含60-80％(重量)乙二醇的平衡缓冲液洗脱结合于疏水树脂上的表面抗原。

这种疏水柱层析是很有效的纯化步骤，其中经二氧化硅吸附步骤后仍留在上清液中的杂质大部分被除去。特别是很难用传统方法除去的热原性物质可通过此步骤得以除去。仍留在含表面抗原的组分中的尿素和乙二醇可以通过例如透析或重复渗滤除去，其中优选使用pH6-8的缓冲液。

由疏水柱层析得到的含表面抗原的组分进一步由大小排阻凝胶过滤纯化到纯化抗原可用于制备疫苗的程度。

可用作柱填充材料的极性基质的例子包括，例如分子量截断值至少为1,000,000，优选为5,000-500,000的琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。大小排阻凝胶过滤层析如下进行：将含表面抗原的组分通过用pH6-8的、含0.1-0.2M氯化钠的Tris或磷酸盐缓冲液平衡的柱，以及用相同的缓冲液洗脱表面抗原。

将含表面抗原的各个组分混合并用SDS-PAGE确定其中所含的表面抗原和preS2肽的纯度。如下述实施例的各种实验所证实，由本发明方法纯化的表面抗原的纯度很纯并且其中的preS2肽的含量很高以致于纯化的抗原可直接用于制备疫苗。

下述实施例和比较例用于进一步描述本发明而非限制其范围。

另外，除非另有说明，以下给出的固固混合物百分比、液液百分比和固液百分比均基于重/重、体积/体积和重量/体积。

实施例1(步骤1)破碎酵母细胞

在30升YEPD培养基(1％酵母膏、2％酵母蛋白胨、1.6％葡萄糖)中于27℃培养能表达含preS2肽的乙型肝炎表面抗原的重组酿酒酵母KCTC0098BP，由此得到的70g酵母细胞饼块与140ml缓冲液1(50mM Tris，pH7.2，1M硫氰酸钠、0.15M氯化钠、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF))混合，将混合物放入含210ml直径为0.5mm玻璃珠的玻珠打击器(Biospec Products，OKLA，U.S.A.)的容器中。

将容器浸入冰水中并以15分钟间隔操作玻珠打击器三次，每次5分钟。从玻璃珠中分离得到的细胞匀浆，用210ml缓冲液1洗玻璃珠，洗过的溶液与细胞匀浆混合。(步骤2)抽提及溶解表面抗原

向(步骤1)得到的细胞匀浆中加入0.1％(w/v)吐温20，室温搅拌混合物2小时。

通过加入5N氢氧化钠调节溶液的pH至11.5并室温搅拌1小时。加入20％乙酸调节得到的溶液的pH至5.2，室温搅拌30分钟，然后静置30分钟。

8℃离心溶液，与沉淀一起除去细胞碎片。

加入5N氢氧化钠将含表面抗原的上清液调至pH7.2，此时上清液的体积约为300ml。(步骤3)用二氧化硅吸附和脱附

干二氧化硅与水混合制成5％浆液(干重/浆液体积)，取其70ml加入(步骤2)得到的上清液中，室温搅拌混合物2小时。以5,500rpm离心得到的溶液10分钟并除去上清液，吸附有表面抗原的沉淀的二氧化硅用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗二次。

洗过的二氧化硅加入到含1M尿素的70ml 50mM碳酸盐缓冲液中(pH9.5)，室温搅拌混合物1小时将表面抗原从二氧化硅上脱附，此时缓冲液的pH为9.2。以12,000rpm离心(Beckman JA14 rotor)溶液30分钟，得到含表面抗原的上清液。

用Auzyme试剂盒(Abbott，U.S.A.)测得上清液中乙型肝炎病毒表面抗原的含量为约6.5mg。

比较例

重复实施例1的步骤，只是缓冲液1中不含硫氰酸钠，得到纯化的表面抗原溶液。结果是用Auzyme试剂盒测得的上清液中的乙型肝炎病毒表面抗原的含量为约7.1mg。

将实施例和比较例中得到的表面抗原溶液进行15％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后银染，结果示出图1，其中泳道1和2分别代表实施例1和比较例中得到的表面抗原溶液，A表示完整蛋白带；B和C代表由蛋白酶攻击造成的蛋白片段。

如图1所示，根据本发明方法可以从酵母细胞中以高产率纯化得到高preS2肽含量的表面抗原。

实施例2

(步骤1)破碎酵母细胞

在300升YEPD培养基中于27℃培养可以表达含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的重组酿酒酵母KCTC 0098BP，由此得到的3kg酵母细胞饼块与6升缓冲液1混合，混合物在10℃以650ml/分钟的流速流过含3升直径为0.5mm的玻璃珠的Dynomill(Glenmills，Japan)，共进行两次，以破碎酵母细胞。

将得到的细胞匀浆与玻璃珠分离，用9升缓冲液1洗玻璃珠，洗过的溶液与细胞匀浆混合。用Auzyme试剂盒测得上清液中HBs Ag的含量约为754mg。(步骤2)抽提及溶解表面抗原

向(步骤1)得到的细胞匀浆中加入0.1％(w/v)吐温20并室温搅拌混合物2小时。

通过加入5N氢氧化钠调节溶液的pH至11.5，室温搅拌1小时。加入20％乙酸将得到的溶液调至pH5.2，室温搅拌30分钟，然后静置30分钟。

8℃离心溶液以与沉淀一起除去细胞碎片。

通过加入5N氢氧化钠将含表面抗原的上清液的pH调至7.2。结果是上清液的终体积约为12升，用Auzyme试剂盒测得上清液中的HBs Ag含量约为1,250mg。

以(步骤1)中测定的表面抗原量计，此步骤中表面抗原的产率为165.8％。这种未预料到的高产率主要是由于表面活性剂和碱的结合作用所致，它们提高了抗原性并促进了表面抗原的溶解度。(步骤3)用二氧化硅吸附和脱附

用2倍体积的0.15M氯化钠稀释(步骤2)中得到的上清液，然后根据下述步骤将其吸附到二氧化硅(Aerosil 380)上。干燥的二氧化硅与水混合制成10％浆液(干重/浆液体积)，取其1.5l加到(步骤2)得到的上清液中，4℃搅拌混合物过夜。

以5,500rpm离心得到的溶液10分钟，弃去上清液，用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗吸附有表面抗原的沉淀的二氧化硅二次。

将洗过的二氧化硅加到31含1M尿素的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)中，室温搅拌混合物2小时以将表面抗原从二氧化硅上脱附。此时缓冲液pH9.2。以8,700rpm离心溶液30分钟以得到含表面抗原的上清液。

用Auzyme试剂盒测得上清液中HBsAg含量约为895mg(产率：118.7％)。(步骤4)疏水柱层析

向(步骤3)得到的含表面抗原的上清液中加入尿素至终浓度为4M，得到的溶液通过用含4M尿素的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)平衡的苯基琼脂糖柱。用含20％乙二醇的相同缓冲液洗柱；随后将含60％乙二醇的相同缓冲液加到柱中洗脱表面抗原。

混合各个含表面抗原的组分并用分子截断值为100,000的Amicon渗滤***(Amicon，U.S.A.)过滤以从洗脱液中除去尿素和乙二醇，用同样的***浓缩得到的滤液。

用Auzyme试剂盒测得滤液中HBs Ag量约为546mg(产率：72.4％)。(步骤5)凝胶过滤层析

用8l Sepharose CL-4B(Pharmacia，U.S.A.)填充柱并用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)平衡。将(步骤4)得到的含表面抗原的浓缩物通过柱并用相同的缓冲液洗脱，得到含表面抗原的组分。

用Auzyme试剂盒测得混合的组分中HBs Ag(包含完整蛋白和由于蛋白酶攻击产生的片段)的量约为540mg(产率：71.6％)，表面抗原的纯度约为98.2％。用SDS-PAGE测得在总表面抗原中的preS2肽含量约为75％。将由此得到的纯化的表面抗原溶液过0.2μ的过滤器(Corning，U.S.A.)并将滤液于4℃贮存。

实施例3

(步骤1)破碎酵母细胞

在300升YEPD培养基中于27℃培养重组酿酒酵母KCTC 0098BP，由此得到的4kg酵母细胞饼块与8升缓冲液1混合，混合物在10℃以650ml/分钟的流速流过含3升直径为0.5mm的玻璃珠的Dynomill(Glenmills，Japan)，共进行两次，以破碎酵母细胞。

将得到的细胞匀浆与玻璃珠分离，用12升缓冲液1洗玻璃珠，洗过的溶液与细胞匀浆混合。(步骤2)抽提及溶解表面抗原

向(步骤1)得到的细胞匀浆中加入0.1％(w/v)吐温20并室温搅拌混合物2小时。

向溶液中加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为10％，室温搅拌混合物1小时。8℃离心得到的溶液以与沉淀一起除去细胞碎片。

用20mM Tris缓冲液(pH7.5)在一分子截断值为100,000的Amicon渗滤***(Amicon，U.S.A.)中过滤上清液以除去其中的硫氰酸盐和硫酸钠，随后用同样的***将其浓缩至终体积为6升。

通过加入5N氢氧化钠将浓缩物调至pH11.5并室温搅拌1小时。通过逐渐加入20％乙酸将得到的溶液调至pH5.2，室温搅拌30分钟，然后静置30分钟。8℃离心溶液以与沉淀一起除去细胞碎片。(步骤3)用二氧化硅吸附和脱附

根据下述步骤将(步骤2)中得到的上清液吸附到二氧化硅(Aerosil 380)上。干燥的二氧化硅与水混合制成10％浆液(干重/浆液体积)，取其21加到(步骤2)得到的上清液中，4℃搅拌混合物过夜。

以5,500rpm离心得到的溶液10分钟，弃去上清液，用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗吸附有表面抗原的沉淀的二氧化硅二次。

将洗过的二氧化硅加到41含1M尿素的50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中，室温搅拌混合物2小时以将表面抗原从二氧化硅上脱附。此时缓冲液pH9.2。以8,700rpm离心溶液得到含表面抗原的上清液。

用Auzyme试剂盒测得上清液中HBs Ag含量约为840mg。(步骤4)疏水柱层析

向(步骤3)得到的含表面抗原的上清液中加入尿素至终浓度为4M，得到的溶液通过用含4M尿素的50mM碳酸盐缓冲液(pH9.2)平衡的苯基琼脂糖柱。用含20％乙二醇的相同缓冲液洗柱；随后将含60％乙二醇的相同缓冲液加到柱中洗脱表面抗原。

混合各个含表面抗原的组分并用分子截断值为100,000的Amicon渗滤***(Amicon，U.S.A.)过滤以从洗脱液中除去尿素和乙二醇，用同样的***浓缩得到的滤液。

用Auzyme试剂盒测得滤液中HBs Ag量约为527mg。(步骤5)凝胶过滤层析

用8l Sepharose CL-4B(Pharmacia，U.S.A.)填充柱并用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)平衡。将(步骤4)得到的含表面抗原的浓缩物通过柱并用相同的缓冲液洗脱，得到含表面抗原的组分。

用Auzyme试剂盒测得混合的组分中乙型肝炎病毒表面抗原的量约为480mg，表面抗原的纯度约为98.9％。用SDS-PAGE测得在总表面抗原中的preS2肽含量约为75％。将由此得到的纯化的表面抗原溶液过0.2μ的过滤器(Corning，U.S.A.)并将滤液于4℃贮存。

实施例4

根据下述实验用豚鼠证实了实施例2和3得到的表面抗原(以下称“表面抗原2”和“表面抗原3”)中的S和preS2肽的免疫原性。

将1ml(200μg/ml)表面抗原2或3与18ml含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合，将混合物用0.2μ针筒式滤器过滤。将滤液与1ml 3％alhydro凝胶(Superfos Biosector，Denmark)混合。上述程序是在无菌状态下在洁净的桌面上进行的。

每只重约350g的十一只豚鼠分别用1ml如上制备的表面抗原2或3组合物进行皮下注射，间隔15天注射2次。在第一次注射之后30天，取每只豚鼠的血样并从中分离血清。用Ausab^R试剂盒(Abbott，U.S.A.)分析血清得知抗原2或3的S肽的抗体形成率为100％，表面抗原2和3的GMT分别为33.38和29.77mIU/ml。

根据下述步骤测定preS2肽的抗体形成率，将50μl(1mg/ml)具有26个N-末端氨基酸的preS2肽(其是用自动固相肽合成法由肽合成仪(Applied Biosystems，U.S.A.)合成的)和20μl(10mg/ml)聚L-赖氨酸加入到200μl 50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)中。将混合物中加入10μl 1％EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)羰二酰亚胺)，得到的混合物在37℃反应1小时。用20ml 10mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释得到物并以200μl/孔的量将其加到96孔ELISA板的板孔中。室温温育板20小时使肽吸附到孔表面，然后用蒸馏水洗三次。

以250μl/孔的量将含0.5％酪素水解物的PBS加到孔中；室温温育板2小时以上以防止以后可能发生的非特异性反应。向每孔中加入阳性对照和阴性对照以及200μl用PBS10倍顺序稀释的每只豚鼠的血清(实验组)。室温温育板4小时，然后用TTBS缓冲液(0.9％氯化钠、0.05％吐温20、10mM Tris，pH7.5)洗五次。以200μl/孔的量向孔中加入用4000倍体积的含0.5％酪素水解物的PBS稀释的、用辣根过氧化物酶(HRP)标记的含猪抗豚鼠抗体的溶液。在37℃温育得到物1小时并用TTBS缓冲液洗5次。

随后，向每孔中加入200μl辣根过氧化物酶的底物溶液并反应至显色，所述的底物溶液是如此制备的，将200μg四甲基联苯胺(TMB)溶于20μlDMSO，向其中加入10ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.1)和20μl 30％过氧化氢，加蒸馏水调整溶液体积至20ml。向每孔得到物中加入50μl 1N硫酸以中止显色；用Microplata阅读器(Dynatech MR5000，U.S.A.)d 450nm波长处测定每孔的O.D.。

当实验组的O.D.高于截断值(阴性对照的O.D.值的两倍)时，确定发生了preS2肽抗体形成，计数显示阳性抗体反应的豚鼠只数。

结果是表面抗原2和3均显示100％的抗体形成率。

实施例5

为确定表面抗原2和3中S和preS2肽的免疫原性，用小鼠进行下述实验。将1ml(20μg/ml)表面抗原2或3与18ml含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)混合，将混合物用0.2μ针筒式滤器过滤，将滤液与1ml 3％alhydro凝胶(Superfos Biosector，Denmark)混合。

得到的含10μg/ml表面抗原2或3的溶液用alhydro凝胶稀释液(其由用含0.15M氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释alhydro凝胶至终浓度为0.15％制备而成)稀释成分别含0.01、0.03、0.09和0.27ng/ml表面抗原的4个样品。充分摇动含样品的容器以防止alhydro凝胶的沉淀。上述程序是在无菌状态下在洁净的桌面进行的。

将80只5周龄的小鼠分成8组，每组10只，给每只小鼠腹膜内注射1ml每种如上制备的表面抗原2或3的稀释液。注射后28天从每只小鼠中取血样并从血样中分离血清。用Ausab试剂盒(Abbott，U.S.A.)测定S肽抗体，表1列出了抗表面抗原2或3中的S肽的上述抗体形成率。

             表1

表面抗原浓度(ng/ml)	表面抗原抗体形成率(％)
			表面抗原2	表面抗原3
	0.01	10			10
0.03			20	40
	0.09	80			60
0.27			90	100

根据实施例4的方法测定preS2肽的抗体，表2列出了抗表面抗原2或3中的preS2肽的上述抗体形成率。

              表2

表面抗原浓度(ng/ml)	表面抗原抗体形成率(％)
			表面抗原2	表面抗原3
	0.01	10			10
0.03			20	40
	0.09	80			60
0.27			90	100

使用概率法(Finney，D.J.，Probit Analysis，1971)由上述得到的抗体形成率计算S和preS2肽的有效剂量50(ED₅₀)，结果是表面抗原2中S和preS2肽的ED₅₀分别为0.0580和0.0577ng/ml，表面抗原3中S和preS2肽的ED₅₀分别为0.0455和0.0469ng/ml。然而由于表面抗原2或3中preS2肽的含量为75％，所以据认为preS2肽的ED₅₀比上述计算值低。

如上述实施例所示，根据本发明可以从重组酵母细胞中获得具有高preS2肽含量以及高免疫原性的S和preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原。

本发明已参照上述具体实施方案加以描述，然而应理解的是本领域技术人员对本发明做出的各种改进和变动也应包含在所附权利要求书所规定的本发明的范围内。

Claims (17)

1、一种从重组生物体细胞中纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法，所述的方法包括用含离液盐的缓冲液破碎细胞以获得细胞匀浆的步骤。

2、如权利要求1所述的方法，其中离液盐选自由硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、盐酸胍和尿素组成的一组。

3、如权利要求1所述的方法，其中缓冲液中离液盐的浓度为1-8M。

4、如权利要求1所述的方法，进一步包括如下步骤：

(a)向细胞匀浆中加入表面活性剂以从细胞的细胞膜中抽提表面抗原；

(b)碱化步骤(a)中得到的抽提物以增加抽提物中表面抗原的溶解度并促进形成表面抗原颗粒；

(c)酸化经步骤(b)处理的抽提物然后离心沉淀并除去抽提物中的细胞碎片、脂类和杂蛋白，获得含表面抗原的溶液；

(d)将步骤(c)中得到的溶液与二氧化硅接触以将表面抗原吸附到二氧化硅上，洗去杂蛋白，并用缓冲液将表面抗原从二氧化硅上脱附，获得纯化的表面抗原组分；

(e)将步骤(d)中得到的纯化的表面抗原组分进行疏水柱层析，获得含表面抗原的组分；以及

(f)通过大小排阻凝胶过滤层析纯化步骤(e)中得到的组分，获得纯化形式的表面抗原。

5、如权利要求4所述的方法，进一步包括如下步骤：向步骤(a)或(b)中得到的细胞抽提物中加入一种盐；除去细胞碎片和杂质；在步骤(c)之前将上清液进行渗滤。

6、如权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中使用的表面活性剂是吐温^20、吐温^80、Triton X-100或脱氧胆酸钠。

7、如权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中使用的表面活性剂的浓度以细胞匀浆的体积计为0.1-0.5％(w/v)。

8、如权利要求4所述的方法，其中步骤(a)中得到的细胞抽提物的pH在步骤(b)中被调至11.0-13.5。

9、如权利要求4所述的方法，其中细胞抽提物的pH在步骤(c)中被调至4.5-6.0。

10、如权利要求4所述的方法，其中步骤(d)中使用的二氧化硅的表面积为100-500m²/g。

11、如权利要求4所述的方法，其中在步骤(d)中，使用pH为8.8-11.0的、含有1-8M尿素和0.1-0.3％(重)表面活性剂的缓冲液将表面抗原从二氧化硅上脱附。

12、如权利要求11所述的方法，其中所述的表面活性剂为脱氧胆酸钠。

13、如权利要求4所述的方法，其中步骤(e)中的疏水性树脂为具有苯基的琼脂糖凝胶。

14、如权利要求4所述的方法，其中步骤(e)中的疏水柱层析是如下进行的：将含表面抗原的组分通过用pH为8.8-11.0并含有1-4M尿素的平衡缓冲液平衡的柱；用含10-40％(重)乙二醇的平衡缓冲液洗柱；以及用含60-80％(重)乙二醇的平衡缓冲液洗脱表面抗原。

15、如权利要求4所述的方法，其中步骤(f)中的大小排阻层析是通过用分子量截断值至少为1,000,000的葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶进行的。

16、如权利要求4所述的方法，其中步骤(f)中的大小排阻层析是如下进行的：将含表面抗原的组分通过用pH为6-8并含0.1-0.2M氯化钠的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液平衡的柱；以及用相同的缓冲液洗脱表面抗原。

17、含有根据权利要求1所述而纯化的表面抗原的乙型肝炎病毒疫苗。

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