JP4740133B2 - Ｈｂｖ感染症およびｈｂｖ介在性疾患の予防／治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、それらの断片および／またはそれらをコードする核酸を含む組成物に関し、該ＨＢｓＡｇはＨＢｓＡｇのＳ領域および／またはプレＳ１領域におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子型において異なり、該組成物はＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）またはその抗原をコードする核酸を全く含有しない。また、本発明は、医薬組成物、特にそれらの組成物を含むワクチンおよびＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の予防／治療におけるそれらの使用に関する。本発明は、肝炎の治療的処置において患者特異的な薬物を調製する方法ならびに、ＨＢＶ遺伝子型の診断用キットにも関する。

世界中で２億５０００万人を超える人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染する。極めて多数の感染者は、慢性肝不全、肝硬変、および肝細胞癌（ＨＣＣ）などを含む病理学的結果を呈する。急性ＨＢＶ感染症を発症する特定の人々がいる一方で発症しない人々もいる理由はほとんど理解されていない。臨床データおよび他の慢性ウイルス感染症との類似性は、ウイルス感染症の制御下での細胞介在性免疫応答、特に細胞障害性Ｔリンパ球を含む免疫応答における意義について強調している。細胞障害性Ｔ細胞応答の誘発は、急性ＨＢＶ感染症の除去、および慢性ＨＢＶ感染症の予防における決定因子である。ウイルスゲノムは、特にエンベロープタンパク質であるプレＳ１、プレＳ２およびＳ抗原（ＨＢｓＡｇ）、ポリメラーゼ、ならびにコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）をコードする。

慢性Ｂ型肝炎は慢性持続性または慢性的に悪性の経過をたどる可能性がある肝臓の進行性炎症である。慢性持続性肝炎は、繊維化の亢進を伴う肝臓の拡大した門脈域に限局される浸潤を呈し；臨床的には、持続性肝炎の徴候が長年（最大で１０年）にわたって残存し、症例の約８０％がＨＢｓＡｇ陽性である。病原性は、細胞性免疫系の不全および持続性ウイルス感染症に基づく可能性が高い。

２２６個のアミノ酸からなるタンパク質（ｐ２４／ｇｐ２７すなわちＳタンパク質）である小さなＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、２０〜３０ｎｍのリポタンパク質粒子内に単独で構築される重要なＨＢＶ抗原である。該粒子内では、複数の分子間および分子内でのジスルフィド結合によって１００〜１５０個のサブユニットが架橋される。種々のサブタイプおよび遺伝子型のＨＢＶ単離物由来のＳタンパク質の可変性は限られている。４つの安定なＨＢｓＡｇサブタイプであるａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒおよびａｙｒは、免疫優勢の「ａ決定因子」（残基１２４〜１４７を含む親水性領域）の近隣に位置する位置１２２および１６０における単一アミノ酸交換に関する。同サブタイプは、以前からＨＢＶ感染症における何らかの生物学的なまたは病原性における差異によるものとされてはいない。

慢性ＨＢｓＡｇキャリアの血漿から得られるワクチンは、１９８２年にドイツ連邦共和国で最初に認可された。それ以来、ワクチンは遺伝子技術によって生産され、リスクを有する集団の能動免疫化に用いられている。接種に先立って血清反応陰性の９５％の人々は１年後に免疫応答を示す。用いられるあらゆるＢ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの非感染性のさやに対応する高濃度の精製ＨＢｓＡｇタンパク質を含有し、ウイルスＤＮＡを含有せず、またはホルマリンで不活化される。

先行技術における不利な点は、免疫される少なくとも５％の人々が免疫応答を示さない「非応答者」であることである。さらに、慢性持続性肝炎の治療に対するワクチンは現在までに知られていない。

国際公開第０１／４０２７９号パンフレットおよび国際公開第０１／３８４９８号パンフレットにはＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｇに基づくワクチンについての記載があるが、その２つの特許明細書には異なる遺伝子型の組み合わせについての記載はない。

マイケル（Ｍｉｃｈｅｌ）ら、ＰＮＡＳ ９２（１９９５年）、５３０７−５３１１頁およびマンチニ（Ｍａｎｃｉｎｉ）ら、ＰＮＡＳ ９３（１９９６年）、１２４９６−１２５０１頁は、ＨＢｓＡｇに基づくＤＮＡワクチンに関する。この文献には異なるＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇの組み合わせを含有する組成物の使用に関する記載はない。

したがって本発明は、ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の予防／治療に関する改善された手段を提供するという課題に基づく。本発明は、肝炎の治療的処置において患者特異的な薬物を提供するという課題にも基づく。更なる目的は、ＨＢＶ感染症の診断において改善されたキットを提供することである。

本発明における根本的な課題は、少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、それらの断片、および／またはそれらをコードする核酸を含む組成物の提供によって解決される。この場合、ＨＢｓＡｇはＨＢｓＡｇのＳ領域および／またはプレＳ１領域におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子型において異なり、組成物はＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）または同抗原をコードする核酸を含有しない。

本発明は、以下に示す驚くべき観察に基づいている。肝臓において常時ＨＢｓＡｇサブタイプａｙｗを発現するトランスジェニックマウスは、慢性ＨＢＶ感染症に特異的な免疫療法プロトコルの効率を評価するための前臨床モデルとしてみなされる。上記マウスは、持続性抗原血症の結果として生じるＨＢｓＡｇを大量に産生し、かつＨＢｓＡｇに対して実質上耐性を有する。発明者は、一方でトランスジェニックマウス（ａｙｗ）の遺伝子型にそのＨＢｓＡｇ遺伝子型において正確に対応するワクチン、他方でトランスジェニックマウスの遺伝子型とは異なるＨＢｓＡｇ遺伝子型を含有するワクチンでＨＢｓＡｇ−トランスジェニックマウスを免疫している。トランスジェニックマウスに対してその固有のＨＢｓＡｇに対応するＨＢｓＡｇ抗原によって繰り返し免疫したにもかかわらず、細胞障害性Ｔ細胞応答が何も認められなかった。一方、トランスジェニックマウスに対してその固有の遺伝子型とは異なるＨＢｓＡｇ遺伝子型で免疫したところ、ＨＢｓＡｇに対し、遺伝子型に特異的でかつ交差反応性のある細胞障害性Ｔ細胞応答が得られた。これは自然発生するＨＢｓＡｇ変異体が交差反応性Ｔ細胞免疫のプライミングによって「耐性」を破壊できることを示す。細胞障害性Ｔ細胞の免疫の活性化は、ＨＢｓＡｇ ａｙｗ−抗原の低下に加え、ＨＢＶの有効な制御下で急性肝炎に対応する肝臓に特異的な徴候および症状をもたらす。ＨＢｓＡｇ ａｙｗ−抗原のアミノ酸配列がＨＢｓＡｇ ａｄｗ２−抗原のアミノ配列と小数の位置に限って異なることから観察された免疫応答は特に顕著である。本発明では、Ｔ細胞エピトープ内のアミノ酸における極めて少数の保存的置換が同エピトープに対するＴ細胞応答において変化をもたらす場合があることが確認されている。

タンパク質抗原に対するＴ細胞応答の特異性および効率は、様々なレベル、特に（ｉ）エピトープ（または抗原ペプチド）のタンパク質分解による遊離；（ｉｉ）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に提示される糖タンパク質に対する抗原ペプチドの親和性；および（ｉｉｉ）同一抗原における種々のエピトープに対して競合的に起こるＴ細胞応答の負の干渉といった決定因子に基づいて調節される。タンパク質抗原の天然変異体は：
（ｉ）タンパク質からのより効率的な抗原ペプチドのタンパク質分解によるプロセシング（遊離）；
（ｉｉ）提示されたＭＨＣ分子に対する抗原ペプチドの高親和性結合；
（ｉｉｉ）エピトープの免疫原性を弱める、（ｉ）および／または（ｉｉ）の記載と類似の過程を介する（同一タンパク質抗原における他のエピトープに対する応答を抑制する）免疫優勢エピトープの除去；
（ｉｖ）新たなエピトープが生成できる
といった４つの方法において（エピトープ内部もしくはエピトープに隣接する重要な配列における個々のアミノ酸交換または新たなエピトープの創出によって）特異的なＴ細胞応答を誘発できる。

本発明に関連して、遺伝子型によって示されるＨＢｓＡｇ天然変異体は、同変異体が刺激するＴ細胞応答における特異性に関して比較的幅広いスペクトルを有することが明らかにされる。

本発明と関連して、「ＨＢＶ遺伝子型」という用語はＢ型肝炎ウイルスゲノムの全体性を意味する。ＨＢＶ遺伝子型は、好ましくは全配列決定および系統発生解析によって決定される。現段階では、８つの標準的な遺伝子型が知られている。これら８つの遺伝子型はヌクレオチド相互における８％のバリエーションに基づいており、これについてはバーソロミューズ（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓｚ）、Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１３（２００３年）、１−１４頁を参照されたし。好ましくは、ＨＢＶ遺伝子型Ａは、参照核酸配列Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ０２７６３、すなわちＨＢＶ遺伝子型Ａ_ａｆｒに対するＧｅｎｂａｎｋ ＡＦ２９７６２１に従う参照核酸配列を有する。ＨＢＶ遺伝子型Ｂ_ａに対する参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ Ｄ００３３０であり、遺伝子型Ｂｊに対する参照核酸配列はＡＢ０７３８５８である。ＨＢＶ遺伝子型Ｃに対する参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ ＡＹ２０６３８９であり、遺伝子型Ｃ_ａｕｓについては参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ ＡＢ０４８７０４に相当する。遺伝子型Ｄに対する参照核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ Ｘ０２４９６である。遺伝子型Ｅに対する参照核酸配列はＸ７５６５７である。遺伝子型Ｆに対する参照核酸配列はＸ６９７９８である。遺伝子型Ｇに対する参照核酸配列はＡＦ１６０５０１であり、遺伝子型Ｈに対する参照核酸配列はＡＹ０９０４５４である。

上記の遺伝子型については、以下のように遺伝子型とサブタイプの間にはある種の相関がある。すなわち、遺伝子型Ａは、サブタイプのａｄｗ２、ａｙｗ１と相関し、遺伝子型Ｂはａｄｗ２、ａｙｗ１と相関し、遺伝子型Ｃはａｄｗ２、ａｄｒｑ＋、ａｄｒｑ−、ａｙｒ、ａｄｒと相関する。遺伝子型Ｄはａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４と相関する。遺伝子型Ｅはａｙｗ４と相関する。遺伝子型Ｆはａｄｗ４ｑ−、ａｄｗ２およびａｙｗ４と相関し、遺伝子型Ｇはａｄｗ２と相関し、かつ遺伝子型Ｈはａｄｗ４と相関する。

感染患者のＨＢＶサブタイプの測定は、例えば抗ｄ、抗ｙ、抗ｒ、抗ａ（ｗ）といったモノに特異的な抗体を活用することで血清学的に実施できる。同測定は寒天ゲル拡散試験の形態またはラジオイムノアッセイの形態で実施できる（クールージュ Ａ．Ｍ．（Ｃｏｕｒｏｕｃｅ、Ａ．Ｍ．）、ホーランド Ｐ．Ｖ．（Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｐ．Ｖ．）、ミュラー Ｊ．Ｙ．（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｊ．Ｙ．）およびソリエ Ｊ．Ｐ．（Ｓｏｕｌｉｅｒ、Ｊ．Ｐ．）、Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ｎｏ．４２、Ｓ．Ｋａｒｇｅｒ、バーゼル、１９７６年によって公開された「ＨＢ抗原サブタイプ」）。

患者血清由来のＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡの配列決定により、サブタイプも決定できる。次いでＨＢｓＡｇのアミノ酸配列は決定された核酸配列から派生する。次いでサブタイプの割り付けは、マグニス Ｌ．Ｏ．（Ｍａｇｎｉｕｓ、Ｌ．Ｏ．）およびノーダー Ｈ．（Ｎｏｒｄｅｒ、Ｈ．）、「Ｓｕｂｔｙｐｅｓ、Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ａｓ ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ−ｇｅｎｅ」 Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８（１−２）：２４−３４頁にて記載されたように、位置１２２および１６０におけるアミノ酸を用いて行われる。

本発明と関連して、「Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原」（ＨＢｓＡｇ）という表現は小さいＨＢＶ表面抗原またはＳタンパク質（ｐ２４／ｇｐ２７）を意味する。ＨＢｓＡｇは、プレＳ１タンパク質ドメインも含む可能性がある。好ましくは、ＨＢｓＡｇはＳタンパク質および／またはプレＳ１タンパク質のドメインからなる。

ＨＢｓＡｇの番号付けについては、キッド・ユンググレーン（Ｋｉｄｄ−Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３（２００２年）、１２６７−１２８０頁に従う系が用いられる。

「断片」という用語は、本発明によるとＨＢｓＡｇの断片を含む。好ましくは、断片は、少なくとも５個のアミノ酸を含み、Ｔ細胞エピトープ、すなわち好ましくは少なくとも１０個、特に少なくとも２０個、より特殊な場合には少なくとも５０個のアミノ酸を含有する。好ましい実施形態によると、組成物は少なくとも２つのＨＢｓＡｇまたは２つのそれらの断片を含む。上記の組成物は、特にポリペプチドに基づくワクチンとして用いる場合に適する。特に、組成物が異なるＨＢＶ遺伝子型を有するＨＢｓＡｇ由来の２つの断片を含む場合、第１および第２の断片は少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは２０個のアミノ酸を共に有するが、アミノ酸の少なくとも１個分だけ互いに異なる。

上記のように、本発明は、遺伝子型が異なる結果として生じる抗原（ＨＢｓＡｇ）における差異が極めてわずかである場合でさえ、互いに極めてわずかに異なるだけの修飾されたＴ細胞エピトープが生成され、Ｔ細胞応答性における変化が顕著になるという認識に基づく。したがって、互いに少なくとも１個のアミノ酸だけ異なる２つの断片は、ＨＢｓＡｇに関して既知の遺伝子型を単純に配列比較することによって容易に検出できる。互いに少なくとも１個のアミノ酸だけ異なる適切な断片は、本発明に従う組成物において使用できる。好ましくは、同断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、特にヒト細胞エピトープを含有する。Ｔ細胞エピトープを決定する方法は、例えばラウアー（Ｌａｕｅｒ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（２００２年）、６１０４−６１１３頁において知られている。

好ましい実施形態によると、組成物は少なくとも２つのＨＢｓＡｇおよび／または少なくとも２つのそれらの断片を含む。

好ましくは、少なくとも第１のＨＢｓＡｇまたはその断片および第２のＨＢｓＡｇをコードする核酸またはその断片を含む組成物が提供され、この場合第１および第２のＨＢｓＡｇがＨＢＶ遺伝子型において異なる。

さらに好ましい実施形態によると、組成物は２つのＨＢｓＡｇをコードする少なくとも２つの核酸を含み、この場合ＨＢｓＡｇはＨＢＶ遺伝子型において異なる。核酸は、先に定義された断片をコードする核酸でもありうる。核酸はウイルスＤＮＡまたは合成ＤＮＡである場合があり、この場合の合成ＤＮＡ配列は修飾されたヌクレオチド間結合を含有するものを含むものとして理解される。核酸は、組換えベクター系を介する発現に必要とされる場合があるＲＮＡ分子でもありえる。さらに本発明によると、混合されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子は核酸としても検討に値する。

好ましい実施形態によると、遺伝子型が既知の遺伝子型のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨから選択される。個々の参照核酸配列については、先に定義された切片に対して参照される。遺伝子型は通常、参照核酸配列に対する８％のヌクレオチドのバリエーションを介して定義される。すなわち参照核酸配列と少なくとも９２％同一である核酸は、同定義に従う遺伝子型としても理解される。参照核酸配列に対しては少なくとも９５％、特に９８％の同一性が特に好ましい。ここで、参照核酸配列に対する「同一性」は既知の方法を活用して決定される。一般に、特定の要件を考慮するアルゴリズムを含む特別なコンピュータプログラムが用いられる。

同一性を決定する好ましい方法は、第一に比較される配列間で最大限の一致をもたらす。同一性を決定するためのコンピュータプログラムとして、ＧＡＰ（デベロイ Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｏｙ、Ｊ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１９８４年）、３８７頁；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＷＩ）；およびＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルトシュル Ｓ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０年）、４０３−４１０頁を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）や他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、アルトシュル Ｓ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＮＤ２２８９４；アルトシュル Ｓ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら；上記）から入手できる。同様に、同一性を決定するのに既知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用できる。

核酸の比較における好ましいパラメータは以下を含む：
ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０年）、４４３−４５３頁
比較マトリックス：
マッチ＝＋１０
ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３

ＧＡＰプログラムは、上記パラメータとともに用いる場合にも同様に適する。上記パラメータは、核酸配列比較におけるデフォルトパラメータである。アルゴリズムの更なる例であるギャップ・オープニング・ペナルティ、ギャップ延長ペナルティおよび比較マトリックスは、プログラムハンドブックＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ９、１９９７年９月におけるものを含む。その選択は実施される比較に依存し、さらにＧＡＰもしくはＢｅｓｔ Ｆｉｔが用いられる場合には配列ペア間、またはＦＡＳＴＡもしくはＢＬＡＳＴが用いられる場合には配列と大規模な配列データバンクの間で比較が実施中か否かに依存する。

上記アルゴリズムに基づいた９２％の一致は、本発明と関連した９２％の同一性を示す。同一性がより高い場合にも同様に適用される。

本発明による組成物は、好ましくは変異体が参照核酸配列によってコードされるポリメラーゼの活性に実質的に相当する活性を有するポリメラーゼをコードする、および／または変異体が参照核酸によってコードされるＨＢｓＡｇの免疫応答性に実質的に相当する免疫応答性を有するＨＢｓＡｇをコードすることを特徴とする。

本明細書におけるポリメラーゼ活性は、キム（Ｋｉｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１９９９年；４７（２）、３０１−３０８頁にしたがって測定できる。ＨＢｓＡｇの免疫応答性は、商用の抗原ＥＬＩＳＡを介して測定できる。「実質的に参照核酸によってコードされるＨＢｓＡｇの免疫応答性による」とは、抗体が変異体によってコードされるＨＢｓＡｇに関して実質的に同一の親和性を有する参照ＨＢｓＡｇに結合することを意味する。

好ましい実施形態によると、組成物は、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つの異なるＨＢｓＡｇ、それらの断片および／またはそれらをコードする核酸を含む。

特に好ましくは、組成物はあらゆる既知のＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇ、それらの断片および／またはそれらをコードする核酸を含む。

本発明による組成物の更なる好ましい実施形態にしたがって、ＨＢｓＡｇをコードする核酸またはその断片は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞におけるＨＢｓＡｇの発現に適するプロモータの制御下でベクターに存在する。組成物がＨＢｓＡｇまたはその断片をコードする少なくとも２つの核酸を含む場合、これらの核酸は同一ベクター（バイナリーベクター）においてまたは異なるベクターにおいて互いに独立して存在できる。適切なベクターとして、たとえば、プラスミド、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、麻疹ウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。一般に、ベクターは、トランスフェクトされた哺乳類細胞におけるベクターの複製に作用する複製源を含む。

適切なプロモータは、構成プロモータ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および誘導プロモータ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の両方でありうる。好ましいプロモータは、ＣＭＶおよびＳＶ−４０に由来する。

上記の組成物は、単に個々の成分を混合することによって取得できることから、調製が極めて容易である。適切な溶媒および担体は、組成物（ポリペプチドおよび／または核酸）の性質に依存する。原理上、水を含有する系が好ましい。ＨＢｓＡｇまたはその断片は、合成的にまたは組換え調製を介して得られる。調製されたポリペプチドは、クロマトグラフ法によって精製できる。

あるいは、組成物は組換え発現系におけるＨＢｓＡｇまたはその断片をコードする少なくとも２つの核酸の共発現によって得られる。当業者であれば、極めて多くの発現系や方法に熟知するあろうし、好ましくは酵母が宿主細胞として用いられ、特に好ましくはメタノール資化性酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が用いられる。核酸は、ベクター内または互いに独立の２つのベクター内に存在できる。適切なベクターおよびプロモータについては先に説明した通りである。

本発明の更なる態様にしたがって、本発明による組成物および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が調製される。医薬的に許容できる担体は、当業者にとっては既知である。例として、多糖類、水中油型乳剤、ポリ−ラクチド−コ−グリコール酸の添加の有無にかかわらないＨＢｓＡｇのアルミニウム塩、リン酸カルシウム、凍結乾燥物などが挙げられる。上記担体自体がアジュバント活性を含まない場合、それらは例えば、脂質Ａミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、免疫活性化ヌクレオチドまたは細菌毒素などの更なるアジュバントと混合できる。

本発明による医薬組成物として、特にワクチンが挙げられる。本発明によると、医薬組成物、特にワクチンは、ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の治療的処置に適する。医薬組成物、特にワクチンは、ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の予防的処置にも適する。ＨＢＶ感染症は、特に慢性持続性Ｂ型肝炎感染症である。ＨＢＶ介在性疾患は、急性慢性Ｂ型肝炎感染症でありうる。更なるＨＢＶ介在性疾患として、肝硬変および原発性肝細胞癌が挙げられる。ワクチンは、臨床的に不顕性のＨＢＶ保菌者、すなわち真の意味でまだ疾患を患っていないが将来的にＨＢＶ介在性疾患を発症するリスクが高い保菌者に対する投与に適する。

医薬組成物は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内、粘膜、または経口を介して投与できるが、かかる投与は好適なものを示すにすぎず、それらに限定されることはない。

医薬組成物は、用量範囲が０．１から１０００μｇ／ＨＢｓＡｇもしくはその断片、好ましくは２．５から４０μｇ／ＨＢｓＡｇもしくはその断片の、少なくとも２つのＨＢｓＡｇまたはそれらの断片を含む。

医薬組成物がＨＢｓＡｇまたはその断片をコードする核酸を含む場合、それらは１０から１０００μｇ／ＨＢｓＡｇもしくはその断片をコードする核酸の用量範囲で存在する。

本発明の更なる態様は、
ａ）感染患者が保有するＨＢＶ遺伝子型を決定するステップと；
ｂ）ａ）によって決定される患者のＨＢＶ遺伝子型とは異なるＨＢＶ遺伝子型の少なくとも１つのＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇの断片またはＨＢｓＡｇまたはその断片をコードする核酸を含む薬物を提供するステップと、
を含むＢ型肝炎の治療的処置における薬物の調製方法を提供する。

上記のように、本発明で重要な認識は、慢性持続性肝炎の前臨床モデルでは、トランスジェニック動物の遺伝子型と異なるＨＢＶ遺伝子型由来のＨＢｓＡｇによるトランスジェニック動物の治療によって治療効果が得られているということである。

遺伝子型は、全ＨＢＶゲノムまたはＨＢｓＡｇをコードする少なくとも一部の配列決定および系統発生解析、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、多重ＰＣＲといった方法によって決定できる。

少なくとも１つのＨＢｓＡｇ、その断片またはその断片のＨＢｓＡｇをコードする核酸の調製を介したそれ自体が知られた方法で薬物の提供を行う。

更なる態様によると、本発明はＨＢＶ感染症の遺伝子型における診断用キットを提供する。キットは、２つのＨＢｓＡｇに特異的な結合剤が種々のＨＢＶ遺伝子型に特異的であることを特徴とする、少なくとも２つのＨＢｓＡｇに特異的な結合剤を含む。少なくとも２つのＨＢｓＡｇに特異的な結合剤は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型に特異的なプライマーおよび／または特異的抗体でありうる。プライマーは、１０〜３０ヌクレオチド長を有する可能性があり、かつ個々の遺伝子型における既知のＨＢｓＡｇ配列に相補的である。抗体は、例えば所望のＨＢｓＡｇ遺伝子型にそれぞれ対応するＨＢｓＡｇを有するマウスなどの実験動物への免疫、本質的に知られた方法によるハイブリドーマの調製、およびサブタイプに特異的なモノクローナル抗体に対するスクリーニングによって得られる抗体である。

本発明は、実施例と関連させて以下により詳細に説明されることになる。しかしながら、実施例は本発明を限定することを意図するものではない。

実施例
材料および方法
概要
研究中のＨＢＶサブタイプａｄｗ２は遺伝子型Ａに対応する。ＨＢＶサブタイプａｙｗは遺伝子型Ｄに対応する。ＨＢＶサブタイプａｄｒは遺伝子型Ｃに対応する。

マウス
標準の病原体が存在しない条件下でＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍ（Ｂ６）マウス（Ｈ−２^ｂ）を保存した。

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＴｇＮ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉトランスジェニック（ＨＢｓ−ｔｇ）マウスのＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（登録番号Ｖ０１４６０ Ｊ０２２０３を有するＨＢＶ配列によってコードされる）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から得た。８〜１６週齢の雌雄マウスを用いた。

細胞、組換えＨＢｓＡｇ粒子および抗原ＨＢｓＡｇペプチド
用いたＨ−２^ｂ細胞系ＲＢＬ５を［１０］に示す。ＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２とほぼ等しい量を発現した安定なＲＢＬ５トランスフェクタントを調製した（データは示さず）。サブタイプのａｙｗ、ａｄｗ_２およびａｄｒの組換えＨＢｓＡｇ粒子は、ライン・バイオテック（Ｒｈｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）（デュッセルドルフ、ドイツ）から入手可能である。メタノール資化性酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）宿主株ＲＢ１０で調製されたＨＢｓＡｇ粒子を［３］で示すように精製した。合成Ｋ^ｂ拘束性Ｓ_{２０８−２１５}ＩＬＳＰＦＬＰＬ（ａｙｗ）またはＩＶＳＰＦＩＰＬ（サブタイプａｄｗ２）ペプチドおよびＫ^ｂ拘束性Ｓ_{１９０−１９７}ＶＷＬＳＶＩＷＭ（ａｙｗ）またはＶＷＬＳＡＩＷＭ（ａｄｗ２）ペプチドをジェリニ・バイオツールズ（Ｊｅｒｉｎｉ ＢｉｏＴｏｏｌｓ）（ベルリン、ドイツ）から入手した。ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ溶液に溶解し、使用前に培地で希釈した。

プラスミドおよびＤＮＡによる免疫
［４；５］で記載のように、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗ、ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２およびＨＢｓＡｇ_ａｄｒをｐＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＢＭＧｎｅｏベクター内でクローニングした。ＤＮＡワクチンとして、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗ、ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２およびＨＢｓＡｇ_ａｄｒを十分に等しく発現するプラスミドｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ、ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２およびｐＣＩ／Ｓ_ａｄｒを用いた。これらのプラスミドＤＮＡで一時的にトランスフェクト済みの細胞を由来とするＨＢｓＡｇの免疫沈降によってこれを示した（データは示さず）。したがって、ＤＮＡワクチンまたはトランスフェクタントによるＨＢｓＡｇの種々の発現量に基づいてＨＢｓＡｇエピトープにおける免疫原性上の差異を解明することができなかった。［４］に記載のように、筋肉内への核酸の免疫では、プラスミドＤＮＡ１μｇ／μｌを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０μｌをそれぞれの前脛骨筋内に注射した。各場合に１μｇ／μｌ ｐＣＩ／Ｓ_ａｙｗ、１μｇ／μｌ ｐＣＩ／Ｓ_ａｄｗ２および１μｇ／μｌ ｐＣＩ／Ｓ_ａｄｒを含有するＰＢＳ５０μｌを注射することにより、ＨＢｓＡｇサブタイプの混合物による免疫を行った。

ＨＢｓＡｇタンパク質粒子による免疫
マウス１匹あたりＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）１００μｌ中のＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１８２６、ＭＷＧ バイオテック（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、エーバースベルク、ドイツ）３０μｇまたはＲＣ−５２９（コリクサ（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐ．）、シアトル、ワシントン州、米国）８μｇとともに、ＨＢｓＡｇタンパク質粒子５μｇを皮下注射した。ＨＢｓＡｇサブタイプの混合物で免疫した各場合において、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗ５μｇ、ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２５μｇおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｒ５μｇのタンパク質粒子をＰＢＳ１００μｌ中のＣｐＧオリゴヌクレオチドアジュバント３０μｇまたはＲＣ−５２９ ８μｇとともに皮下注射した。

特異的な脾臓および肝臓におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度の測定
脾臓細胞懸濁液［１］および肝ＮＰＣ（非実質）細胞の調製について記載されている［６；７］。５μｇ／μｌのＨＢｓＡｇ由来ペプチド、ＨＢｓＡｇを発現するトランスフェクタント（１０^６個／ｍｌ）、ＨＢｓＡｇ粒子でパルスした細胞のいずれかを含むＲＰＭＩ−１６４０培地において脾臓細胞および肝ＮＰＣ（１ｘ１０^６個／ｍｌ）を１時間にわたってインキュベートした。次いで、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）（カタログ番号１５８７０；シグマ）５μｇ／μｌを添加し、培養物をさらに４時間インキュベートした。細胞を採取し、それらの表面を抗ＣＤ８ｍＡｂで染色し、固定化し、浸透化し、そして細胞質ＩＦＮγに対する染色を行った。ＣＤ８^＋ＩＦＮγ^＋ＣＴＬの頻度をＦＡＣＳ解析によって測定した。ＣＤ８^＋ＩＦＮγ^＋Ｔ細胞／１０^５個の脾臓または肝臓のＴ細胞における平均値を示す。

特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞系の移入
ＣＤ８^＋Ｔ細胞系をｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗのＤＮＡワクチンに免疫したＢ６マウスの脾臓から採取した。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）またはＫ^ｂ／Ｓ_{１９０−１９７}拘束性ペプチド２（ＶＷＬＳＶＩＷＭ）でパルスした同質遺伝子的ＲＢＬ５細胞で脾臓細胞を再刺激した。特異的ＩＦＮγ発現試験によって明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて約２週間にわたって増殖させた系において８０％を超えるＣＤ８^＋Ｔ細胞は予定のエピトープ特異性を有した。細胞を洗浄し、同系における５×１０^６個の細胞を静脈内に注射した。対照細胞は、３日間にわたってＣｏｎＡで刺激した培養物から単離した非特異的ＣＤ８^＋Ｔブラストであった。

血清中のトランスアミナーゼ、ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｓＡｇ抗体の測定
注射後に特定の時刻に、尾静脈由来の血液の採取により、個々の、免疫マウスまたは対照マウスから血清抗体が繰り返し得られた。Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ（登録商標）試験（カタログ番号７４５１３８；ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ））を用いて血液において血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を行った。

トランスジェニックマウスの血清におけるＨＢｓＡｇ濃度を市販のＥＬＩＳＡ ＡＵＳＺＹＭＥ ＩＩ（アボット・ラボラトリーズ（ＡＢＢＯＴＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヴィースバーデン、ドイツ）試験によって測定した。市販のＩＭｘＡＵＳＡＢ試験（カタログ番号７Ａ３９−２０；アボット（Ａｂｂｏｔｔ）、ヴィースバーデン、ドイツ）を用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇに対する抗体について明らかにした。

６つの標準血清を活用して抗体濃度を定量した。測定されたＯＤ値が標準血清１〜６にあるように試験血清を希釈した。本明細書に示す同値を測定された抗体濃度（ｍｌＵ／ｍｌ）を介して血清希釈倍率によって測定した。所定の血清力価は４匹の各マウスの平均値±標準偏差に相当する。

組織学
肝臓組織薄片（＜３ｍｍ）を２４時間にわたって４％ホルマリン（ｐＨ７．０）で固定し、パラフィン包埋した。２μｍ厚のパラフィン切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。

Ｋ^ｂに対するＨＢｓＡｇペプチドの拘束
［８、９］に記載のように、３μＭのヒトβ２ｍの存在下で上昇した試験ペプチド濃度および放射活性物質で標識したＶＳＶ ＮＰ ５２−５９標識ペプチドの規定濃度（約２ｎＭ）で、アフィニティ精製したＭＨＣクラスＩ分子Ｋ^ｂを１８℃で４８時間にわたってインキュベートした。次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラムを用いたゲルろ過によってＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチドの拘束について測定した［８］。放射活性物質で標識したＶＳＶ ＮＰ ５２〜５９ペプチドを排除量（ＭＨＣ結合ペプチド）および含有量（遊離ペプチド）に位置づけた。これをγ線分光分析によって測定し、そして試験ペプチド総量に対するＭＨＣ分子に結合していた試験ペプチドの割合を測定した。標識ペプチドの拘束に対する５０％の阻害（ＩＣ５０値）を得るために必要な試験ペプチド濃度を測定した。ＩＣ５０値が低下すると、試験ペプチドの拘束が亢進する。リガンドの低下を防止するために、すべての拘束に関する実験において１５〜２５％以下の拘束を得るのに十分なＭＨＣ量を用いた。これらの条件下で、ＩＣ５０値は解離定数（Ｋｄ）に対する近似値である。阻害実験としてあらゆる拘束に関する実験を行った。

実施例１
エピトープ１またはエピトープ２に特異的なＫ^ｂに制限されたＣＤ８^＋Ｔ細胞系の養子移入はＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスにおいて肝障害を誘発する。
Ｂ６マウス脾臓由来のＨＢｓＡｇのエピトープ１またはエピトープ２（図１Ｂ）に特異的で、ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗプラスミドＤＮＡで免疫した短寿命ＣＤ８^＋Ｔ細胞系を産生した。同細胞系内では細胞の＞９５％はＣＤ８^＋であり、これらＣＤ８^＋Ｔ細胞の＞８０％において特異的ＩＦＮγの発現を誘発した。血清トランスアミナーゼにおける短期間であるが大幅な上昇によって示されたように、ある導入遺伝子から肝臓におけるＨＢｓＡｇ_ａｙｗを発現したコンジェニックＢ６宿主内への同細胞系における５×１０^６個の細胞の養子移入は、急性肝障害を誘発した（図２）。移入の５〜６日後に血清トランスアミナーゼ値は正常化し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が移入されていない時点で宿主内で検出可能であった。ポリクローナル（ミトゲンで活性化された）ＣＤ８^＋Ｔブラストと同数の移入によっては肝障害を呈さなかった。したがって、（ｉ）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞がＨＢｓ−ｔｇマウスにおける肝障害を有効に誘発し（［２］に記載）、（ｉｉ）内因性もしくは外因性ＨＢｓＡｇのプロセシングによって産生されたＨＢｓＡｇエピトープが導入遺伝子を発現する肝臓内に存在し、かつ（ｉｉｉ）養子導入のＣＤ８^＋Ｔ細胞をトランスジェニック宿主から速やかに取り出す。したがって、ＨＢｓＡｇにおいて種々の特異性を有する移入ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、肝臓で使用でき、原位置において活性化できるが、安定的に吸収できない。

実施例２：ＨＢｓＡｇエピトープ１および２を認識するＫ^ｂ拘束性ＣＴＬは脾臓および肝臓において認められた。
ワクチンでプライミングしたＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞がＨＢｓＡｇを発現する正常またはトランスジェニック（ＨＢｓ−ｔｇ）Ｂ６マウスの肝臓で使用できるか否かについて検討した（図３）。１２〜１５日以前にｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗワクチンで免疫済みのＢ６マウスから脾臓細胞および非実質肝細胞（ＮＰＣ）を単離した。正常Ｂ６マウス由来の脾臓および肝臓におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内にエピトープ１またはエピトープ２に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を認めた（図３Ａ）。肝臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団内のＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は高かったものの、それらの絶対数は脾臓の場合よりも少なかった（データは示さず）。一方、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗをコードするＤＮＡワクチンで免疫済みのＨＢｓＡｇ_ａｙｗ ｔｇ Ｂ６マウスでは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の応答性が実証されなかった（図３Ｂ）。ＤＮＡワクチンによる３回のブースター注射（３週間の間隔）、ＨＢｓＡｇ抗原粒子およびオリゴヌクレオチドアジュバントによる繰り返し免疫のいずれも、ＨＢｓ−ｔｇマウスにおいてＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫をもたらさなかった（データは示さず）。したがって、マウスが耐性を示す対象である同じＨＢｓＡｇ変異体を用いる接種プロトコルは、有効な抗ウイルス性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫に対してプライミングしない。

実施例３：ＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡＧａｄｗ２変異体のエピトープに対するＫ^ｂ拘束性Ｔ細胞応答
タンパク質が２２６アミノ酸残基を有する、ＨＢＶ単離物由来のＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２タンパク質は、１６アミノ酸残基において異なる（ゆえにこれらのアミノ酸は９３％一致）。用いられたＨＢｓＡｇ_ａｙｗタンパク質配列は、ＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスによって発現された、導入遺伝子にコードされたＨＢｓＡｇ_ａｙｗの配列と同一である。選択したＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２のＫ^ｂ拘束性エピトープ１および２の配列は、エピトープ内の１および２のアミノ酸残基においてそれぞれ異なるが、同一のフランキング配列（図１Ａ、Ｂ）を有する。ＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２のＳ_{２０８−２１５}エピトープ１は２つの位置で異なる。すなわちａｄｗ２では、位置２でバリン（Ｖ）残基がロイシン（Ｌ）と置き換わり、かつ位置６でイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）残基と置き換わる（図１Ｂ）。Ｋ^ｂに対するエピトープ１の結合親和性は比較的低い。すなわちエピトープ１のＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２変異体は、エピトープのＨＢｓＡｇ_ａｙｗ変異体の場合よりもＫ^ｂに対してより高い結合親和性を示した（表１）。一方、Ｋ^ｂに対するエピトープ２の結合親和性は高かった（表１）。

ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗまたはｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２のＤＮＡワクチンで免疫したＢ６マウスは、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗもしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２粒子あるいは、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗもしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２における抗原ペプチドＳ_{２０８−２１５}のいずれかでパルス済みのプライミングした脾臓ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激の５時間後に認めた、Ｋ^ｂ拘束性エピトープ１に対してＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示した（図４Ａ、群２、３）。（ｉ）エピトープ１に特異的なＣＴＬをｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗまたはｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２によってプライミングし、かつ（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ_ａｙｗもしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２粒子でパルスした、またはペプチドＩＬＳＰＦＬＰＬ（ａｙｗ）もしくはペプチドＩＶＳＰＦＩＰＬ（ａｄｗ２）でパルスした細胞がプライミングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞に対してエピトープ１を提示することから、エピトープ１のａｙｗおよびａｄｗ２変異体は交差反応性を示した。したがって、８−ｍｅｒエピトープ１内の２か所の置換によって有効なプロセシング、Ｋ^ｂ拘束性またはエピトープの提示は阻害されなかった。

ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ ＤＮＡワクチンでプライミングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗまたはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２のエピトープ２（Ｓ_{１９０−１９７}）を認識した（図５Ａ；群２）。このことはＨＢｓＡｇ_ａｙｗを発現するペプチドでパルスした細胞またはトランスフェクタントを用いた再刺激の５時間後にｅｘ ｖｉｖｏで実証された。プライミングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、内因性ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２を発現するトランスフェクタントを認識しなかった。ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２ ＤＮＡワクチンによる免疫は、エピトープ２に特異的なＴ細胞（図５Ａ、群３）をプライミングしなかった。ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗではない）ＤＮＡワクチンでプライミングしたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、トランスフェクタントによって提示された未知のエピトープ／制限の特異性を有するａｄｗ２に特異的なエピトープを認識したが、これについての更なる検討は行わなかった（図５、群３）。したがって、位置５におけるアミノ酸の置換（疎水性アミノ酸バリンＶと疎水性アミノ酸アラニンＡの交換）は、エピトープ２の産生を阻害するが、Ｋ^ｂ分子によるその提示を阻害しない（［１］。

実施例４：ＨＢｓＡｇエピトープ１に対する交差反応性Ｋ^ｂ拘束性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答はＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスにおいてプライミングされる。
ＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスは、肝臓における導入遺伝子からＨＢｓＡｇ_ａｙｗを発現する。ＨＢｓ−ｔｇマウスをＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ）またはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２）で免疫した（図４、５Ｂ）。ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ ＤＮＡワクチンによるＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスの繰り返し免疫によってＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は全く得られなかった（図４、５Ｂ、群２）。一方、ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２ ＤＮＡワクチンによるＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスの免疫によってＨＢｓＡｇに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が得られた（図４Ｂ、群３）。この交差反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗもしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２粒子またはペプチド形態のエピトープ１のａｙｗもしくはａｄｗ２変異体でパルスした細胞を認識した（図４Ｂ、群３）。これらのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＲＢＬ５／Ｓ_ａｙｗトランスフェクタントまたはＫ^ｂ拘束性エピトープ２のＳ_{１９０−１９７}を認識しなかった（図５Ｂ、群３）。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＲＢＬ５／Ｓ_ａｄｗ２トランスフェクタントによって提示されるがＲＢＬ５／Ｓ_ａｙｗトランスフェクタントによって提示されない不確定の決定因子に向け、サブタイプに特異的な応答性を示した（図５Ｂ、群３）。
このことはＨＢｓＡｇ天然変異体が交差反応性Ｔ細胞免疫のプライミングによって「耐性を破壊」できることを示す。

特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団がｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２で免疫したトランスジェニックマウスの抗原を産生する肝臓において実証できるか否かの詳細について検討を行った。ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２で免疫したＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウス由来の脾臓および肝臓におけるＮＭＣでは、特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答性は数ヶ月にわたって実証可能である（図６）。したがって、養子導入のＣＤ８^＋Ｔ細胞と対照的に（図２）、ワクチンでプライミングした抗ＨＢＶに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞は、３ヶ月を超える期間にわたって抗原を産生する標的器官内で使用でき、安定的な吸収を示す。

実施例５：ＨＢｓＡｇエピトープ１に対して特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を示す免疫したＨＢｓ−ｔｇマウスの肝臓における組織病理
ＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＨＢｓＡｇを産生する肝臓において炎症性反応を誘発した。処理を施していないＢ６マウスは、正常な肝臓組織を呈した（図７Ａ、Ｂ）。ＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウス由来の肝細胞は肥大し、ヒトＨＢＶ感染症の症例にも認められる「スリガラス様肝細胞」の特徴を示す微細な顆粒状の薄い好酸性細胞質を呈した（図７Ｃ、Ｄ）。炎症性浸潤は認められなかった。

ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗではなく）ＤＮＡワクチンで免疫したＨＢｓ−ｔｇマウスは、重度の肝組織病理を呈した（図７Ｅ）。実質（図７Ｆ）および門脈周囲（図７Ｇ）領域に認めた炎症性浸潤物は主に単核球からなっていた（図７Ｆ）。極めて多くの小さいリンパ球様細胞を実質および門脈周囲領域内に分布させた。炎症性細胞の局在化された群は、アポトーシス肝細胞の周囲に存在した（図７Ｈ）。肝細胞の肥大および水腫様腫大は、免疫したＨＢｓ−ｔｇマウスでは処理していないＨＢｓ−ｔｇマウスよりも大きかった。一部の中規模から小規模の核は、凝集クロマチンおよび核周辺光輪を呈したが（図７Ｆの矢印）、それはアポトーシスの初期段階を示す。さらに、アポトーシス肝細胞を呈する極めて多くのカウンシルマン小体を認めた（図７Ｈ、矢印）。一部の肝細胞は、核の空胞変性を呈した（図７、矢印）。顕著な胆汁うっ滞は認められなかった。

実施例６：ＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングは抗原血症における低下と相関する。
処理されていないＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇは、３０〜５０ｎｇ／ｍｌの血清濃度を示す（図８Ａ）。交差反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を発現したマウスは、ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２での免疫が抗原血症の低下（５〜１５ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度）を示した後でエピトープ１に応答する一方で、ＨＢｓＡｇに特異的ないかなるＣＤ８^＋Ｔ細胞の免疫でも起こさないＨＢｓＡｇ_ａｙｗで免疫した動物は、抗原血症濃度において全く変化を示さなかった（図８Ａ）。したがって、抗原血症の部分的な制御は、免疫したトランスジェニックマウスにおける特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生と相関する。

実施例７：抗ＨＢｓＡｇ血清抗体がＨＢｓＡｇａｄｗ２で免疫されているＨＢｓａｙｗ−ｔｇマウスにおいて発生する。
Ｔ細胞免疫に加えて、液性抗ＨＢｓＡｇ免疫は、抗原血症の監視における役割を果たすことができる。ワクチン接種した正常およびトランスジェニックマウスにおいて抗ＨＢｓＡｇ血清抗体の発生を認めた。正常（非トランスジェニック）Ｂ６マウスおよびコンジェニックＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスにｐＣＬ／ＳａｙｗまたはｐＣＬ／Ｓａｄｗ２ ＤＮＡワクチンで２回免疫した。種々のサブタイプにおけるＨＢｓＡｇを測定するＩｍｘＡＵＳＡＢ試験（Ａｂｂｏｔｔ）を用いた最終の免疫の２週間後に、ＨＢｓＡｇに特異的なこれらの血清抗体力価を測定した。ｐＣＬ／ＳａｙｗまたはｐＣＬ／Ｓａｄｗ２プラスミドＤＮＡで免疫した非トランスジェニックマウスがＨＢｓＡｇに対する高い血清抗体濃度をもたらした一方で、ｐＣＬ／Ｓａｄｗ２（ｐＣＬ／Ｓａｙｗではない）プラスミドＤＮＡで免疫した後に限ってＨＢｓ−ｔｇマウスは抗ＨＢｓＡｇ血清抗体応答を示した（図８Ｂ）。ＨＢｓＡｇａｙｗまたはＨＢｓＡｇａｄｗ２粒子で免疫したマウスにおいて同様の抗体応答を認めた（データは示さず）。（ＨＢｓＡｇａｙｗまたはＨＢｓＡｇａｄｗ２粒子でコーティングしたプレートを用いた）サブタイプに特異的なＥＬＩＳＡによると、正常マウスではすべてのワクチンによって引き起こされる＞９５％の抗体応答はＨＢｓＡｇの「ａ」決定因子に向けられ、ＨＢｓ−ｔｇマウスでは＞９０％の抗体応答はａｄｗ２に特異的な決定因子に向けられる（データは示さず）。

実施例８：交差反応性Ｋ^ｂ拘束性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的なプライミングは、ＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスにおいてＨＢｓＡｇタンパク質粒子による免疫によってＨＢｓＡｇエピトープ１に応答する。
サブタイプａｙｗまたはａｄｗ２のＨＢｓＡｇタンパク質粒子による正常Ｂ６マウスの免疫は、Ｋ^ｂ拘束性エピトープ１（Ｓ_{２０８−２１５}）に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞が介在する免疫応答を引き起こす（図９Ａ）。したがって、ワクチン（タンパク質粒子またはＤＮＡ）の性質に無関係に種々の配列を含むエピトープが交差反応性Ｔ細胞応答をプライミング可能であることを示しうる。ＤＮＡワクチンによる免疫と同様に（図５）、Ｂ６マウスに対するサブタイプａｙｗのＨＢｓＡｇタンパク質粒子によるワクチン注射はＨＢｓＡｇ Ｋ^ｂ拘束性エピトープ２（Ｓ_{１９０−１９７}）に対するＣＤ８^＋細胞応答をプライミングするが、サブタイプａｄｗ２のＨＢｓＡｇタンパク質粒子によるワクチン注射はプライミングしない（図９Ａ）。

ＨＢｓ_ａｙｗ−ｔｇマウスをサブタイプａｙｗまたはサブタイプａｄｗ２のいずれかに相当するＨＢｓＡｇタンパク質粒子ワクチンで免疫した。ＨＢｓＡｇ_ａｙｗタンパク質ワクチンで繰り返し免疫した後でＣＤ８^＋Ｔ細胞応答が全く起きなかった一方で、異種のＨＢｓＡｇ_ａｄｗタンパク質抗原による免疫はエピトープ１に対するＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を引き起こした（図９Ｂ）。したがって、ＨＢｓＡｇ天然変異体は、さらにタンパク質サブユニットのワクチン接種を介する交差反応性Ｔ細胞応答のプライミングによって既存の耐性を破壊できることが実証される。

実施例９：ＨＢｓＡｇ天然変異体の混合物による免疫によるＨＢｓ−ｔｇ Ｂ６マウスにおけるＨＢｓＡｇエピトープ１に対する交差反応性Ｋ^ｂ拘束性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の効率的なプライミング
ＨＢｓ_ａｙｗ−ｔｇマウスを、３つのＨＢｓＡｇサブタイプのａｙｗ（ｐＣＩ／Ｓ_ａｙｗ）、ａｄｗ_２（ｐＣＩ／Ｓ_ａｄｗ２）およびａｄｒ（ｐＣＩ／Ｓ_ａｄｒ）をコードするＤＮＡワクチン（図１０Ａ）と、サブタイプａｙｗ、ａｄｗ_２およびａｄｒの混合物を含有するＨＢｓＡｇタンパク質粒子ワクチン（図１０Ｂ）で免疫した。ＨＢｓＡｇ天然変異体の混合物は、ＤＮＡとタンパク質粒子の両方で免疫した後、エピトープ１に対する交差反応性Ｋ^ｂ拘束性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答をプライミングした。

実施例１０：ＨＢｓＡｇ天然変異体の混合物による免疫後のＨＢｓ−ｔｇマウスにおける抗原血症の低下
処理していないＨＢｓ−ｔｇマウスでは、３０〜５０ｎｇ／ｍｌの血清濃度を認める。異種ＨＢｓＡｇワクチン（ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２）または天然ＨＢｓＡｇ変異体の混合物（ＨＢｓＡｇ_ａｙｗ＋ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２＋ＨＢｓＡｇ_ａｄｒ）による免疫後に、エピトープ１に対する交差反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を起こす動物は、抗原血症の低下（５-１７ｎｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇ濃度）を示す。相同性を示すＨＢｓＡｇ_ａｙｗ単独で免疫することで、ＨＢｓＡｇに特異的なＴ細胞の免疫を誘発できる動物では、血清中の抗原量において何の変化も認めなかった。したがって、ＨＢｓＡｇ天然変異体の混合物による免疫が抗原血症の低下をもたらす可能性がある。

実施例１１：ＨＢｓＡｇ天然変異体の混合物による免疫後のＨＢｓ−ｔｇマウスにおける抗ＨＢｓＡｇ血清抗体の誘発
正常Ｂ６マウスは、ＨＢｓＡｇ_ａｙｗ、ＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２、ＨＢｓＡｇ_ａｄｒ（示さず）とこの３つのサブタイプの混合物による免疫後に顕著な抗体応答を示す。

免疫後のＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇに特異的な血清抗体の形成について検討した。ＨＢｓ−ｔｇマウスは、天然ＨＢｓＡｇ変異体の混合物または異種のサブタイプａｄｗ_２による免疫後に限って血清抗体応答を示した。相同性を示すサブタイプａｙｗによる免疫後に抗ＨＢｓＡｇの応答は何も誘発されなかった。サブタイプに特異的なＥＬＩＳＡ（ＨＢｓＡｇ_ａｙｗおよびＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２タンパク質粒子でコーティングしたマイクロタイタープレート）は、ＨＢｓ−ｔｇマウスでは＞９０％のＨＢｓＡｇに特異的な抗体応答がａｄｗ２に特異的な決定因子に向けて生じることを示した（データは示さず）。

参考文献
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２．アンドウ Ｋ．−Ｉ．（Ａｎｄｏ、Ｋ．−Ｉ．）、グイドッティ Ｌ．Ｇ．（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ、Ｌ．Ｇ．）、ワース Ｓ．（Ｗｉｒｔｈ、Ｓ．）、イシカワ Ｔ．（Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｔ．）、ミッサーレ Ｇ．（Ｍｉｓｓａｌｅ、Ｇ．）、モリヤマ Ｔ．（Ｍｏｒｉｙａｍａ、Ｔ．）、シュライバー Ｒ．Ｄ．（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｒ．Ｄ．）、シュリヒト Ｈ．Ｊ．（Ｓｃｈｌｉｃｈｔ、Ｈ．Ｊ．）、ファン Ｓ．Ｎ．（Ｈｕａｎｇ、Ｓ．Ｎ．）、およびチサリ Ｆ．Ｖ．（Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｆ．Ｖ．）、「Ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４年 １５２：３２４５−３２５３頁
３．Ｓ．シェーファー（Ｓ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ）、Ｍ．ピオンテク（Ｍ．Ｐｉｏｎｔｅｋ）、Ｓ．Ｊ．アン（Ｓ．Ｊ．Ａｈｎ）、Ａ．パペンディーク（Ａ．Ｐａｐｅｎｄｉｅｃｋ）、Ｚ．ヤノヴィチ（Ｚ．Ｊａｎｏｗｉｃｚ）、Ｉ．ティンマーマン（Ｉ．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ）、およびＧ．ゲリッセン（Ｇ．Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ） ２００２年「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｉｎ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ−Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」 Ｇ．Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ（ｅｄ．）１７５−２１０頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ワインハイム、ドイツ
４．シルムベッグ Ｒ．（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ、Ｒ．）、ボエム Ｗ．（Ｂｏｅｈｍ、Ｗ．）、アンドウ Ｋ．−Ｉ．（Ａｎｄｏ、Ｋ．−Ｉ．）、チサリ Ｆ．Ｖ．（Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｆ．Ｖ．）、およびライマン Ｊ．（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｊ．）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｍｉｃｅ．」 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． １９９５年 ６９：５９２９−５９３４頁
５．ボエム Ｗ．（Ｂｏｅｈｍ、Ｗ．）、クーレーバー Ａ．（Ｋｕｈｒｏｅｂｅｒ、Ａ．）、ペイエ Ｔ．（Ｐａｉｅｒ、Ｔ．）、マーテンス Ｔ．（Ｍｅｒｔｅｎｓ、Ｔ．）、ライマン Ｊ．（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｊ．）、およびシルムベッグ Ｒ．（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ、Ｒ．）、「ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｔｈａｔ ｐｒｉｍｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９６年 １９３：２９−４０頁
６．トロボンジャカ Ｚ．（Ｔｒｏｂｏｎｊａｃａ、Ｚ．）、ライトホイザー Ｆ．（Ｌｅｉｔｈａｅｕｓｅｒ、Ｆ．）、モラー Ｐ．（Ｍｏｌｌｅｒ、Ｐ．）、シルムベッグ Ｒ．（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ、Ｒ．）、およびライマン Ｊ．（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｊ．）、「Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｉ．Ｌｉｖｅｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（ｂｕｔ ｎｏｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ） ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ＩＦＮγｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ＮＫＴ−ｃｅｌｌｓ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１年 １６７：１４１３−１４２２頁
７．トロボンジャカ Ｚ．（Ｔｒｏｂｏｎｊａｃａ、Ｚ．）、クロガー Ａ．（Ｋｒｏｇｅｒ、Ａ．）、ストーバー Ｄ．（Ｓｔｏｂｅｒ、Ｄ．）、ライトホイザー Ｆ．（Ｌｅｉｔｈａｅｕｓｅｒ、Ｆ．）、モラー Ｐ．（Ｍｏｌｌｅｒ、Ｐ．）、ハウザー Ｈ．（Ｈａｕｓｅｒ、Ｈ．）、シルムベッグ Ｒ．（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ、Ｒ．）、およびライマン Ｊ．（Ｒｅｉｍａｎｎ、Ｊ．）、「Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．ＩＩ．ＩＦＮ−β ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ＮＫ ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅｒ ＮＫＴ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２年 １６８：３７６３−３７７０頁
８．バス Ｓ．（Ｂｕｕｓ、Ｓ．）、ストリーン Ａ．（Ｓｔｒｙｈｎ、Ａ．）、ウィンザー Ｋ．（Ｗｉｎｔｈｅｒ、Ｋ．）、カークビー Ｎ．（Ｋｉｒｋｂｙ、Ｎ．）、およびペダーセン Ｌ．Ｏ．（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｌ．Ｏ．）、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｚｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．」 Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９９５年 １２４３：４５３−４６０頁
９．オルセン Ａ．Ｃ．（Ｏｌｓｅｎ、Ａ．Ｃ．）、ペダーセン Ｌ．Ｏ．（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｌ．Ｏ．）、ハンセン Ａ．Ｓ．（Ｈａｎｓｅｎ、Ａ．Ｓ．）、ニッセン Ｍ．Ｈ．（Ｎｉｓｓｅｎ、Ｍ．Ｈ．）、オルセン Ｍ．（Ｏｌｓｅｎ、Ｍ．）、ハンセン Ｐ．Ｒ．（Ｈａｎｓｅｎ、Ｐ．Ｒ．）、ホルム Ａ．（Ｈｏｌｍ、Ａ．）、およびバス Ｓ．（Ｂｕｕｓ、Ｓ．）、「Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．」 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４年 ２４：３８５−３９２頁
１０．Ｔ．ヴァン・ホール（Ｔ．ｖａｎ−Ｈａｌｌ）、Ｊ．ヴァン・ベルゲン（Ｊ．ｖａｎ−Ｂｅｒｇｅｎ）、Ｐ．Ａ．ヴァン・フェーレン（Ｐ．Ａ．ｖａｎ−Ｖｅｅｌｅｎ）、Ｍ．クラークマン（Ｍ．Ｋｒａａｋｍａｎ）、Ｌ．Ｃ．ホイキャンプ（Ｌ．Ｃ．Ｈｅｕｋａｍｐ）、Ｆ．コウニング（Ｆ．Ｋｏｎｉｎｇ）、Ｃ．Ｊ．メリーフ（Ｃ．Ｊ．Ｍｅｌｉｅｆ）、Ｆ．オッセンドープ（Ｆ．Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ）、およびＲ．オフリンガ(Ｒ．Ｏｆｆｒｉｎｇａ))) ２０００年．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＭＡ、ＥＬ−４、ａｎｄ ＭＬＢ−２ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｍｏｎ ｏｒｉｇｉｎ．」 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：８６９−８７７頁

図面の説明
ＨＢｓＡｇ変異体。（Ａ）小さいＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、遺伝子型Ｄに対応するａｙｗ（１）および遺伝子型Ａに対応するａｄｗ２（２）のアミノ酸配列が示される。（Ｂ）ＨＢｓＡｇのａｙｗおよびａｄｗ２に由来する、Ｋ^ｂ拘束性エピトープ配列。エピトープ１（Ｓ_{２０８−２１５}）が外因性ＨＢｓＡｇをプロセシングする細胞によってのみ提示された一方、エピトープ２（Ｓ_{１９０−１９７}）は内因性ＨＢｓＡｇをプロセシングする細胞によってのみ提示された。 エピトープ１またはエピトープ２に特異的な細胞障害性Ｔ細胞系（ＣＴＬＬ）をＨＢｓトランスジェニック（ＨＢｓ−ｔｇ）宿主に移入することによって細胞障害性Ｔ細胞系がＨＢｓトランスジェニックにおいて一時的な肝障害を引き起こす。脾臓細胞がｐＣＩ／Ｓ_ａｙｗＤＮＡで免疫されたＢ６マウスから摘出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて同質遺伝子的ＲＢＬ５細胞で再刺激された。この場合、ＲＢＬ５細胞はＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）もしくはＫ^ｂ／Ｓ_{１９０−１９７}拘束性ペプチド２（ＶＷＬＳＶＩＷＭ）でパルスされるか、またはＣｏｎＡで刺激された。５×１０^６個のＣＤ８^＋ＣＴＬＬ／マウスがＨＢｓ−ｔｇマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射され、かつ平均血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）値が測定された。 免疫されたマウスの肝臓および脾臓におけるＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞に関するＥｘ ｖｉｖｏにおける実証。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ ＤＮＡ１００μｇの単回注射によって筋肉内に免疫された。免疫の１２日後に特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在が示された。単離された肝臓単核球（ＭＮＣ）および脾臓細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）またはＫ^ｂ／Ｓ_{１９０−１９７}拘束性ペプチド２（ＶＷＬＳＶＩＷＭ）で（ブレフェルディンＡの存在下で）４時間にわたって再刺激された。１群あたりマウス４〜６匹（互いに独立の２つの実験から）におけるＣＤ８^＋ＩＦＮγ^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の平均頻度が示される。 ＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ^８Ｔ細胞のエピトープ１に対する応答。肝臓においてＨＢｓＡｇ_ａｙｗを発現するＨＢｓ−ｔｇマウスは、ＨＢｓＡｇサブタイプａｙｗ（ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ）もしくはａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２）をコードするＤＮＡワクチンまたは負の制御ベクターｐＣｌ（挿入を含まないベクター）で（４週間の間隔をあけて）筋肉内に３回免疫された。最終の免疫から１２日後に、脾臓細胞が免疫されたマウスから摘出され、かつｉｎ ｖｉｔｒｏ（ブレフェルディンＡの存在下で）においてＲＢＬ５細胞で４時間にわたって再刺激された。この場合、ＲＢＬ５細胞はａｙｗ（ＲＢＬ５／Ｓ^Ｐ _ａｙｗ）もしくはａｄｗ２（ＲＢＬ５／Ｓ^Ｐ _ａｄｗ２）のサブタイプのＨＢｓＡｇ粒子またはＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）もしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＩＶＳＰＦＩＰＬ）のＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１で再刺激された。１群あたり（互いに独立の２つの実験から）マウス４〜６匹の脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の平均数が示される。 ＨＢｓ−ｔｇマウスにおいてＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ^８Ｔ細胞のエピトープ２に対する応答。脾臓細胞が図４のキャプションにおいて記載のように免疫されたマウスから摘出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて同質遺伝子的ＲＢＬ５／Ｓ_ａｙｗもしくはＲＢＬ５／Ｓ_ａｄｗ２トランスフェクタント、またはＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＶＷＬＳＶＩＷＭ）もしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＶＷＬＳＡＩＷＭ）のＫ^ｂ／Ｓ_{１９０−１９７}エピトープ２で再刺激された。１群あたりマウス４匹の脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の平均数が示される。 Ｓ_{２０８−２１５}に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞が免疫されたＨＢｓ−ｔｇマウスの肝臓において実証された。トランスジェニックＨＢｓ−ｔｇマウスがＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２）をコードするＤＮＡワクチンで（４週間の間隔で）３回免疫された。最終の注射の１２日後に、肝臓および脾臓細胞が免疫されたマウスから摘出され、かつｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチドＩＬＳＰＦＬＰＬで再刺激された。１群あたりマウス４匹の脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の平均数が示される。 ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２ＤＮＡワクチンで免疫されているＨＢｓ−ｔｇマウス肝臓の組織病理。Ｂ６マウス（Ａ、Ｂ）では病的な肝組織は何も認められなかった。ＨＢｓ−ｔｇマウス（Ｃ、Ｄ）は中等度の細胞肥大を呈したが、その細胞質はスリガラス様を呈している（Ｄ）。肝細胞の核は中等度に多形性の様相を呈した。門脈周囲浸潤物はまれである。ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２ＤＮＡによる繰り返し免疫は、肝臓（Ｅ−Ｉ）において急性ウイルス性肝炎に相当する重度の組織形態学的変化を誘発する。炎症性浸潤物は、クッパー細胞、リンパ球および小葉実質（Ｆ）や門脈周囲領域（Ｇ）内に位置する少数の多形核顆粒球を含む。肝細胞は水症性の様相を呈し、アポトーシスの初期段階の徴候（Ｆ、矢印）である濃縮した核を有することが多い。好酸小体（Ｈ、矢印）すなわちアポトーシス肝細胞は全体に認められ、病巣の炎症性浸潤物の周囲に存在することが多い。多数の肝細胞は著明な空胞変性を呈する（Ｉ、矢印）。ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織のＨ＆Ｅ染色。オリジナル倍率：Ａ、ＣおよびＥにおいてｘ１０；Ｂ、ＤおよびＦにおいてｘ４０；Ｇ〜Ｉにおいてｘ６３。 ＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇに特異的な血清抗体応答の誘発。Ｂ６マウスおよびトランスジェニックＨＢｓ−ｔｇマウスがＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ｐＣｌ／Ｓ_ａｄｗ２）またはＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ｐＣｌ／Ｓ_ａｙｗ）をコードするＤＮＡワクチンで筋肉注射で免疫され、３週間後に同じワクチンでブーストされた。最終の注射の４週間後、血清試料がＨＢｓＡｇ抗原（Ａ）またはＨＢｓＡｇに特異的な抗体（Ｂ）に対して試験された。マウス４〜６匹／群における平均抗体力価（ｍＩＵ／ｍｌ）およびＨＢｓＡｇ血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）±標準偏差が示される。 ＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞は、正常Ｂ６およびＨＢｓ_ａｙｗ−ｔｇマウスにおけるエピトープ１（Ｓ_{２０８−２１５}）およびエピトープ２（Ｓ_{１９０−１９７}）に応答する。動物は、サブタイプａｙｗまたはａｄｗ２におけるＨＢｓＡｇタンパク質粒子（Ｓ^Ｐ）でそれぞれ筋肉注射で（２１日の間隔をおいて）３回免疫された。タンパク質ワクチンは、アジュバントとしてＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）またはＲＣ−５２９とそれぞれ混合された。ＰＢＳは負の制御として用いられた。最終の免疫の１２日後に脾臓が動物から摘出され、次いで単離された脾臓細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ（ブレフェルディンＡの存在下でにおいてＨＢｓＡｇに特異的なペプチドでパルスしたＲＢＬ５細胞で）４時間にわたって再刺激された。この目的のため、それぞれの場合にＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）もしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＩＶＳＰＦＩＰＬ）のＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１またはＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＶＷＬＳＶＩＷＭ）もしくはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＶＷＬＳＡＩＷＭ）のＫ^ｂ／Ｓ_{１９０−１９７}拘束性ペプチド２が用いられた。１群あたり（互いに独立の２つの実験から）マウス４〜６匹における脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の数が示される。 ＨＢｓ_ａｙｗ−ｔｇマウスにおけるエピトープ１（Ｓ_{２０８−２１５}）に対するＨＢｓＡｇに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞応答。Ａ．肝臓においてＨＢｓＡｇ_ａｙｗを発現するＨＢｓ−ｔｇマウスが、ＨＢｓＡｇサブタイプａｙｗ（ｐＣＩ／Ｓ_ａｙｗ）単独もしくは３つのサブタイプａｙｗ（ｐＣＩ／Ｓ_ａｙｗ）、ａｄｗ２（ｐＣＩ／ｓ_ａｄｗ２）およびａｄｒ（ｐＣＩ／Ｓ_ａｄｒ）をコードするＤＮＡワクチンまたは負の制御ベクターｐＣＩ（挿入なしのベクター）で筋肉注射で（４週間の間隔で）３回免疫された。最終の免疫の１２日後に脾臓が動物から摘出された。単離された脾臓細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ（ブレフェルディンＡの存在下で）においてＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）またはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＩＶＳＰＦＩＰＬ）のＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１でパルスしたＲＢＬ５細胞で４時間にわたって再刺激された。１群あたり（互いに独立の２つの実験から）マウス４〜６匹における脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の数が示される。Ｂ．Ａ．ＨＢｓ_ａｙｗ−ｔｇマウスがサブタイプａｙｗのＨＢｓＡｇタンパク質粒子（Ｓ^Ｐ）またはサブタイプａｙｗ、ａｄｗ２およびａｄｒのＨＢｓＡｇタンパク質粒子の混合物で筋肉注射で（２１日間の間隔で）３回免疫された。タンパク質ワクチンが、アジュバントとしてＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）またはＲＣ−５２９（サブタイプの混合物に限って示される）とそれぞれ混合された。ＰＢＳは負の制御として用いられた。最終の免疫の１２日後に脾臓が動物から摘出された。単離された脾臓細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ（ブレフェルディンＡの存在下で）においてＨＢｓＡｇ_ａｙｗ（ＩＬＳＰＦＬＰＬ）またはＨＢｓＡｇ_ａｄｗ２（ＩＶＳＰＦＩＰＬ）のＫ^ｂ／Ｓ_{２０８−２１５}拘束性ペプチド１でパルスしたＲＢＬ５細胞で４時間にわたって再刺激された。１群あたり（互いに独立の２つの実験から）マウス４〜６匹における脾臓ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞／１０^５個のＣＤ８^＋Ｔ細胞±標準偏差の数が示される。 ＨＢｓ−ｔｇマウスにおけるＨＢｓＡｇに特異的な血清抗体応答の誘発。Ｂ６マウスおよびトランスジェニックＨＢｓ−ｔｇマウスが、サブタイプａｙｗもしくはサブタイプａｄｗ２のＨＢｓＡｇタンパク質粒子ワクチン（Ｓ^Ｐ）またはサブタイプａｙｗ、ａｄｗ２およびａｄｒの混合物で筋肉注射で免疫され、３週間後に同一ワクチンでブーストされた。タンパク質ワクチンは、アジュバントとして添加物としてＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を含有した。ブースター注射の４週間後、血清試料がＨＢｓＡｇ（Ａ）およびＨＢｓＡｇに特異的な抗体（Ｂ）に対して試験された。マウス４〜６匹／群における平均抗体力価（ｍＩＵ／ｍｌ）およびＨＢｓＡｇ血清濃度（ｎｇ／ｍｌ）±標準偏差が示される。

Claims (26)

1. 少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；Ｔ細胞エピトープを含むそれらの断片であって、少なくとも１０個の共通のアミノ酸を有するがＴ細胞エピトープにおける少なくとも１個のアミノ酸は互いに異なっている断片；および／またはそれらをコードする核酸、を含み、かつＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）または同抗原をコードする核酸を全く含有しない組成物であって、
   前記各ＨＢｓＡｇが均一粒子の形態で存在し、さらに、前記ＨＢｓＡｇがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）におけるＨＢｓＡｇのＳ領域および／またはプレＳ１領域の遺伝子型と異なり、前記少なくとも２つのＨＢｓＡｇ又は断片はＴ細胞エピトープにおいて互いに異なる、組成物。
2. 前記組成物が、前記少なくとも２つのＨＢｓＡｇおよび／または前記少なくとも２つのそれらの断片を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＨＢｓＡｇの前記断片が、少なくとも５０個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記断片が、ＨＢｓＡｇのａ決定因子を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 前記第１および第２の断片が、少なくとも２０個の共通のアミノ酸を有するが、少なくとも１個のアミノ酸は互いに異なることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記組成物が、ＨＢｓＡｇまたはそれらの断片をコードする少なくとも２つの核酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
7. 前記遺伝子型が、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨから選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
8. 前記組成物が、少なくとも３つの異なるＨＢｓＡｇ、それらの断片、および／またはそれらをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記組成物が、少なくとも５つの異なるＨＢｓＡｇ、それらの断片、および／またはそれらをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
10. 前記組成物が、すべての既知のＨＢＶ遺伝子型のＨＢｓＡｇ、それらの断片、および／またはそれらをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記ＨＢｓＡｇまたはその断片をコードする核酸が、哺乳類細胞内でのＨＢｓＡｇの発現に適するプロモータの制御下で、ベクター内に存在することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記ベクターが、プラスミド、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、麻疹ウイルス、およびレトロウイルスから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記プロモータが、構成プロモータおよび誘導プロモータから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記個々の成分を混合するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を調製する方法。
15. 宿主細胞において、ＨＢｓＡｇまたはそれらの断片をコードする少なくとも２つの核酸を共発現させることを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を調製する方法。
16. 前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記酵母細胞が、メタノール資化性酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
19. ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の治療的処置のための薬物を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
20. ＨＢＶ感染症またはＨＢＶ介在性疾患の予防的処置のための薬物を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
21. 前記ＨＢＶ感染症が、慢性持続性Ｂ型肝炎であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の使用。
22. 前記ＨＢＶ介在性疾患が、急性Ｂ型肝炎感染症、肝硬変、または原発性肝細胞癌であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の使用。
23. 前記組成物が筋肉内、皮下、皮内、静脈内、粘膜、または経口を介して投与されることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の使用。
24. Ｂ型肝炎の治療的処置のための薬物の調製方法であって、
    ａ）ＨＢＶに感染した患者から採取された血液中におけるＨＢＶの遺伝子型を決定することと；
    ｂ）ａ）によって決定される前記患者のＨＢＶ遺伝子型とは異なる、ＨＢＶ遺伝子型の少なくとも１つのＨＢｓＡｇ、またはＨＢｓＡｇをコードする核酸を含む薬物を提供することとを含む、調製方法。
25. 前記遺伝子型が、ＰＣＲ法によって決定されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
26. ＨＢＶに感染した患者を治療するための医薬を製造するための少なくとも１つのＨＢｓＡｇの使用であって、前記ＨＢｓＡｇの遺伝子型は、前記患者が感染しているＨＢＶの遺伝子型とＴ細胞エピトープにおいて異なる、使用。

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