CN115896019B - 一种诱导性多能干细胞诱导分化为nk细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,属于遗传工程技术领域,所述方法包括形成细胞聚集物、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34+造血干细胞、分离纯化CD34+造血干细胞、分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养。本发明以诱导性多能干细胞为来源细胞诱导得到NK细胞,来源细胞不存在伦理争议,克服取材困难的问题;本发明所述诱导方法,诱导率高,CD3‑CD56+NK细胞的比率为81.4%。本发明诱导得到的NK细胞,对靶细胞的杀伤率高,效靶比20:1时,对肝癌细胞HepG2的体外杀伤率高达91.08%。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,属于遗传工程技术领域。
背景技术
以细胞为基础的疗法治疗复发/难治性癌症已经引起了人们的兴趣和重视。除了CAR-T细胞的研究,使用从外周血或脐带血中分离的NK细胞的临床试验也在迅速扩大,而这些来源需要为每个患者收集NK细胞,导致NK细胞群体存在供体差异和异质性。相比之下,人类胚胎干细胞(hESCs)或诱导性多能干细胞(hiPSCs)来源的NK细胞提供了更同质的细胞群,可以在临床规模上生产,这些特性使hESCs/hiPSCs衍生的NK细胞成为开发标准化、“现成”免疫治疗产品的理想细胞群。
由于胚胎干细胞来源于早期胚胎,存在取材困难的问题,在临床使用上也饱受伦理学争议。而诱导性多能干细胞易于获取,克服了上述取材困难的问题,且诱导性多能干细胞的使用不存在伦理学争议。
CN102822332A涉及到将诱导性多能干细胞和人胚胎干细胞诱导成血管细胞继而诱导NK细胞的过程,其EB消化得到的单细胞接种到了添加甲基纤维素的培养体系中诱导得到血管细胞群,这一体系不利于临床级别规模化生产,且其最后的诱导效率相对较低。
CN111235105A公开一种由诱导性多能干细胞分化为NK细胞的方法,其得到的CD34+造血祖细胞比例不高,不利于后续大规模分化扩增NK细胞,且其得到的NK细胞的杀伤力较低。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明提供一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,使其具有高诱导率和高杀伤力,且来源细胞不存在伦理争议。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:
一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,所述方法包括形成细胞聚集物、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34+造血干细胞、分离纯化CD34+造血干细胞、分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养;
所述形成细胞聚集物的方法为将诱导性多能干细胞利用SFD基础培养基进行培养,当融合度达到70%时,吸弃SFD基础培养基,加入E3培养基,其中细胞密度为1×106个/mL,培养24h,形成细胞聚集物;
所述SFD基础培养基为75%Vol含双抗的IMDM培养基和25%Vol Hams F12培养基混合后,再添加终浓度为0.5%Vol的N2、1% Vol的B27、0.05% Vol的BSA、50μg/mL抗坏血酸、5ng/mL***钠;
所述诱导得到中胚层细胞的方法为,将细胞聚集物离心,弃上清,加入含有细胞因子的SFDM培养基中培养,细胞密度为1×106个/mL,培养2天后更换含有细胞因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到中胚层细胞;
所述含有细胞因子的SFDM培养基,为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL的BMP4、50ng/mL的VEGF、50ng/mL的bFGF;
所述SFDM培养基为50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F-12培养基混合后,添加终浓度为100μg/mL的聚乙烯醇、100μg/mL r-HSA、1×的MEM非必需氨基酸溶液、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液、125μM的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁、0.25μM的亚油酸、0.3×的微量元素补充剂A、0.2×的微量元素补充剂B、0.1×的微量元素补充剂C、5mM氯化钠、100μM硫代甘油、20μM的乙醇胺、100ng/mL的肝素、10ng/mL的IGF1;
所述诱导得到CD34+造血干细胞的方法为将中胚层细胞离心后,弃上清,加入含有造血支持因子的SFDM培养基培养,控制细胞密度为0.8×106个/mL,培养2天后更换含有造血支持因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到CD34+造血干细胞;
所述含有造血支持因子的SFDM培养基为SFDM培养基中添加终浓度为50ng/mLSCF、50ng/mL TPO、50ng/mL FLT-3L、20ng/mL IL-3、20ng/mL IL-6、100ng/mL肝素;
所述分化为NK细胞的方法为,收集分离纯化的CD34+造血干细胞,加入含有因子的NK细胞分化培养基,细胞密度为1×106个/mL,放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周,每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基;
所述含有因子的NK细胞分化培养基为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mLTPO、50ng/mL的FLT-3L、20ng/mL的IL-3、20ng/mL的IL-6、100ng/mL的肝素。
所述E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F-12基础培养基混合后,添加终浓度为50μg/mL的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁、5ng/mL的***钠、50ng/mL的bFGF、50ng/mL的VEGF、2μM的CHIR 99021、10μM的Blebbistatin、10μM的Y-27632。
所述NK细胞的扩增培养的方法为收集NK细胞,以2×104个/mL的密度接种至培养瓶中,加入含有因子的NK细胞扩增培养基,放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周,每三天进行半量更换含有因子的NK细胞扩增培养基;
所述含有因子的NK细胞扩增培养基为NK细胞扩增培养基添加终浓度均为10ng/mL的IL-2、IL-7、IL-15、IL-21因子。
与现有技术相比,本发明取得以下有益效果:
(1)本发明以诱导性多能干细胞为来源细胞诱导得到NK细胞,来源细胞不存在伦理争议,克服取材困难的问题;
(2)本发明所述诱导方法,诱导率高,CD3-CD56+NK细胞的比率为81.4%;
(3)本发明诱导得到的NK细胞,对靶细胞的杀伤率高,效靶比20:1时,对肝癌细胞HepG2的体外杀伤率高达91.08%。
附图说明
图1为本发明采用的hiPSCs细胞的显微镜图;
图2为实施例2纯化后的CD34+造血干细胞流式图;
图3为实施例4扩增培养2周后的NK细胞的显微镜图;
图4为实施例4获得的CD3-CD56+NK细胞的流式散点图;
图5为实施例5获得的对照CD3-CD56+NK细胞的流式散点图;
图6为NK细胞对肝癌细胞HepG2细胞的体外杀伤效率的柱状图;
图7为NK细胞对C3H小鼠肝癌肿瘤生长的抑制效率图。
具体实施方式
实施例1、诱导hiPSCs向CD34+造血干细胞分化
(1)形成细胞聚集物
本发明中hiPSCs细胞是以健康供者捐献的外周血为原料,采用专利CN108642014A中实施例1和实施例2的方法制备得到,见图1。
hiPSCs细胞先转移到利用玻连蛋白(购自北京同立海源生物科技有限公司)包被的培养瓶中,利用SFD基础培养基进行培养,当融合度达到70%时,吸弃SFD基础培养基,加入E3培养基,其中细胞密度为1×106个/mL,记为第0天,在超低附着(ULA)烧瓶中,在摇杆平台上以15转/分的速度连续搅拌,37℃、5%CO2的培养箱中培养24h,形成细胞聚集物。
其中SFD基础培养基为75%Vol含双抗的IMDM培养基和25%Vol Hams F12培养基混合后,再添加终浓度为0.5%Vol的N2(购自Gibco)、1%Vol的B27(购自Gibco)、0.05%Vol的BSA(购自Sigma)、50μg/mL抗坏血酸、5ng/mL***钠(购自Merck)。
所述含双抗的IMDM培养基为IMDM培养基中添加终浓度为100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素。
其中E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F-12基础培养基混合后(均购自Gibco公司),添加终浓度为50μg/mL的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁(Ascorbic acid 2-phosphate magnesium)、5ng/mL的***钠(Sodium selenite,购自Merck)、50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、50ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF)、2μM的CHIR 99021(糖原合酶激酶-3抑制剂)、10μM的非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂(Blebbistatin)、10μM的Y-27632(ROCK抑制剂)(其余均购自MCE)。
(2)诱导得到中胚层细胞
将诱导1天后的细胞聚集物收集到50mL离心管中,在400g下离心5min,弃上清,加入20mL含有细胞因子的SFDM培养基中培养,细胞密度为1×106个/mL,37℃、5%CO2的培养箱中培养,培养2天后更换含有细胞因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到中胚层细胞,记为第5天。
所述含有细胞因子的SFDM培养基,为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL的BMP4、50ng/mL的VEGF、50ng/mL的bFGF;
其中SFDM培养基为50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F-12培养基混合后(均购自Gibco公司),添加终浓度为100μg/mL的聚乙烯醇(购自Merck)、100μg/mL r-HSA(重组人血清白蛋白,购自MCE)、1×的MEM非必需氨基酸溶液(non-essential amino acidsupplement,购自Invitrogen)、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液(chemically-definedlipid supplement,购自Invitrogen)、125μM的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁(购自MCE)、0.25μM的亚油酸(购自MCE)、0.3×的微量元素补充剂A(Trace Elements A,货号25-021-CI,购自康宁)、0.2×的微量元素补充剂B(Trace Elements B,货号25-022-CI,购自康宁)、0.1×的微量元素补充剂C(Trace Elements C,货号25-023-CI,购自康宁)、5mM氯化钠(购自Gibco公司)、100μM硫代甘油(购自Sigma)、20μM的乙醇胺(购自Sigma)、100ng/mL的肝素(购自MCE)、10ng/mL的IGF1(购自MCE)。
(3)诱导得到CD34+造血干细胞
将诱导5天得到的中胚层细胞收集到50mL离心管中,400g离心5min,弃上清,加入含有造血支持因子的SFDM培养基培养,控制细胞密度为0.8×106个/mL,在37℃、5%CO2的培养箱中培养2天后更换含有造血支持因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到CD34+造血干细胞,记为第9天。
含有造血支持因子的SFDM培养基是指SFDM培养基中添加终浓度为50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、50ng/mL FLT-3L、20ng/mL IL-3、20ng/mL IL-6、100ng/mL肝素。
上述hiPSCs细胞诱导得到CD34+造血干细胞的诱导率为65.5%。
实施例2 免疫磁珠分离纯化CD34+造血干细胞
(1)收集CD34+造血干细胞,将其在Accutase溶液中37℃消化20分钟,获得单细胞悬液;将细胞在MACs缓冲液(PBS含5mg/mL BSA,1mM EDTA)中洗涤,通过70μm细胞滤网过滤去除聚集物。
(2)利用美天旎生产的CD34顺磁微珠标记CD34+造血干细胞,根据试剂盒说明书进行操作,收获CD34+细胞并计数。用流式细胞仪分析CD34+细胞纯度,结果表明该CD34+造血干细胞的纯度为95.8%(如图2)。
实施例3 诱导CD34+造血干细胞分化为NK细胞
细胞培养瓶先用CD16抗体进行包被,得到包被的细胞培养瓶;收集分离纯化后的CD34+造血干细胞(上述纯度为95.8%的细胞)。
接种前,用NK细胞分化培养基(购自Gibco)进行清洗包被的细胞培养瓶,将细胞以1×106个/mL的密度接种至培养瓶中,加入15mL含有因子的NK细胞分化培养基,放在37℃、低氧(5% O2)、5%CO2培养箱中培养2周,每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基,用PBS-EDTA (0.5mM)处理10min使贴壁细胞分离,重悬并收集非贴壁细胞获得总分化细胞。
所述含有因子的NK细胞分化培养基为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mL的TPO、50ng/mL的FLT-3L、20ng/mL的IL-3、20ng/mL的IL-6、100ng/mL的肝素。
其中NK细胞分化培养基为Stemspan SFEM(购自STEMCELL)中,添加终浓度为1%Vol谷氨酰胺、50U/mL的青霉素、0.05mg/mL的链霉素、250μM的抗坏血酸磷酸酯镁、2mM的烟酰胺。
实施例4 NK细胞的扩增培养
NK细胞扩增时,细胞培养瓶用抗CD3单抗(OKT3)包被。使用前,用NK细胞扩增培养基(购自北京同立海源生物科技有限公司)清洗2次,将细胞以2×104个/mL的密度接种至培养瓶中,加入含有因子的NK细胞扩增培养基,放在37℃、低氧(5%O2)、5%CO2培养箱中培养2周(如图3),每三天进行半量更换含有因子的NK细胞扩增培养基,收集扩增后的NK细胞,利用流式抗体进行细胞标志物CD3和CD56的检测,结果如图4所示,CD3-CD56+NK细胞的比率为81.4%。
所述含有因子的NK细胞扩增培养基为NK细胞扩增培养基添加终浓度均为10ng/mL的IL-2、IL-7、IL-15、IL-21因子。
实施例5 对照NK细胞的制备
以上述实施例1的hiPSCs作为诱导细胞,按照上述实施例1-4的实验步骤,改变之处为:
SFDM培养基、含造血支持因子的SFDM培养基、含有因子的NK细胞分化培养基采用专利CN114507641A公开的培养基,得到对照NK细胞,利用流式抗体进行细胞标志物CD3和CD56的检测,如图5所示,CD3-CD56+NK细胞的比率为54.7%。
该方法中hiPSCs诱导的CD34+造血干细胞的诱导率仅为34.6%。
实施例6 NK细胞杀伤活性的测定
以本发明诱导的NK细胞,对照NK细胞为效应细胞,采用LDH释放测定法(Promega公司),检测NK细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤效果。效靶比分别为20:1,10:1,5:1和1:1,靶细胞数量为1×104个/孔,根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔,取3个复孔的平均值,检测时间为细胞混合后4h。
其中各实验组和各对照组如下:
各实验组:各靶细胞+不同的NK细胞,
对照组1:靶细胞最大释放LDH,需加入一定体积的细胞裂解液;
对照组2:靶细胞自发释放LDH;
对照组3:效应细胞自发释放LDH;
对照组4:空白培养基的背景;
对照组5:体积校准的背景,空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。
检测方法:采用CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法,可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶,在细胞裂解时会释放出来,其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中,可通过30分钟偶联的酶反应来检测,在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为:
表1不同效靶比的细胞杀伤率比较
实验结果如图6和表1所示,本发明诱导的NK细胞和对照NK细胞对肝癌细胞HepG2表现出显著的特异性细胞毒性作用,并且本发明诱导的NK细胞毒性更高,对靶细胞具有高体外杀伤率,并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强,在效靶比20:1时,本发明NK细胞对靶细胞的杀伤率高达91.08%,明显高于对照NK细胞的杀伤率。
实施例7 NK细胞对C3H小鼠肿瘤生长的抑制作用
18-22g雄性C3H小鼠(购自沈阳蓝谱达斯实验用品科技有限公司)于动物房饲养(室温23±2℃,湿度50%±10%),收集对数期的肝癌细胞HepG2细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL,得到HepG2细胞悬浮液。无菌条件下,小鼠左腋下接种0.2mL肝癌细胞HepG2细胞悬浮液,观察5d,待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
C3H肝癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成3组,每组20只,开始注射治疗实验。设置以下实验:
a.对照组,尾部静脉注射同等体积的生理盐水;
b.治疗一组,尾部静脉注射2×106个细胞/对照NK细胞;
c.治疗二组,尾部静脉注射2×106个细胞/本申请诱导的NK细胞。
每周免疫上述各组小鼠一次,连续免疫两周,每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大,并记录,用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图,结果如表2和图7所示。
表2 治疗过程中小鼠肿瘤体积统计
由表2可见,本发明诱导的NK细胞可以明显抑制小鼠肿瘤的生长,且比治疗一组的抑制效果更明显快速。
Claims (2)
1.一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,其特征在于:
所述方法包括形成细胞聚集物、诱导得到中胚层细胞、诱导得到CD34+造血干细胞、分离纯化CD34+造血干细胞、分化为NK细胞、NK细胞的扩增培养;
所述形成细胞聚集物的方法为将诱导性多能干细胞利用SFD基础培养基进行培养,当融合度达到70%时,吸弃SFD基础培养基,加入E3培养基,其中细胞密度为1×106个/mL,培养24h,形成细胞聚集物;
所述SFD基础培养基为75%Vol含双抗的IMDM培养基和25%Vol Hams F12培养基混合后,再添加终浓度为0.5%Vol的N2、1%Vol的B27、0.05%Vol的BSA、50μg/mL抗坏血酸、5ng/mL***钠;
所述E3培养基为75%Vol的DMEM培养基和25%Vol F-12基础培养基混合后,添加终浓度为50μg/mL的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁、5ng/mL的***钠、50ng/mL的bFGF、50ng/mL的VEGF、2μM的CHIR 99021、10μM的Blebbistatin、10μM的Y-27632;
所述诱导得到中胚层细胞的方法为,将细胞聚集物离心,弃上清,加入含有细胞因子的SFDM培养基中培养,细胞密度为1×106个/mL,培养2天后更换含有细胞因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到中胚层细胞;
所述含有细胞因子的SFDM培养基,为SFDM培养基中添加终浓度为25ng/mL的BMP4、50ng/mL的VEGF、50ng/mL的bFGF;
所述SFDM培养基为50%Vol的IMDM培养基和50%Vol F-12培养基混合后,添加终浓度为100μg/mL的聚乙烯醇、100μg/mL r-HSA、1×的MEM非必需氨基酸溶液、0.1×的化学成分明确的脂质浓缩液、125μM的L-抗坏血酸2-磷酸酯镁、0.25μM的亚油酸、0.3×的微量元素补充剂A、0.2×的微量元素补充剂B、0.1×的微量元素补充剂C、5mM氯化钠、100μM硫代甘油、20μM的乙醇胺、100ng/mL的肝素、10ng/mL的IGF1;
所述诱导得到CD34+造血干细胞的方法为将中胚层细胞离心后,弃上清,加入含有造血支持因子的SFDM培养基培养,控制细胞密度为0.8×106个/mL,培养2天后更换含有造血支持因子的SFDM培养基,继续诱导2天得到CD34+造血干细胞;
所述含有造血支持因子的SFDM培养基为SFDM培养基中添加终浓度为50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、50ng/mL FLT-3L、20ng/mL IL-3、20ng/mL IL-6、100ng/mL肝素;
所述分化为NK细胞的方法为,收集分离纯化的CD34+造血干细胞,加入含有因子的NK细胞分化培养基,细胞密度为1×106个/mL,放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周,每三天进行半量更换含有因子的NK细胞分化培养基;
所述含有因子的NK细胞分化培养基为NK细胞分化培养基中添加终浓度为50ng/mL的SCF、50ng/mLTPO、50ng/mL的FLT-3L、20ng/mL的IL-3、20ng/mL的IL-6、100ng/mL的肝素;
所述NK细胞分化培养基,为Stemspan SFEM中,添加终浓度为1%Vol谷氨酰胺、50U/mL的青霉素、0.05mg/mL的链霉素、250μM的抗坏血酸磷酸酯镁、2mM的烟酰胺。
2.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞诱导分化为NK细胞的方法,其特征在于:所述NK细胞的扩增培养的方法为收集NK细胞,以2×104个/mL的密度接种至培养瓶中,加入含有因子的NK细胞扩增培养基,放在37℃、5%O2、5%CO2培养箱中培养2周,每三天进行半量更换含有因子的NK细胞扩增培养基;
所述含有因子的NK细胞扩增培养基为NK细胞扩增培养基添加终浓度均为10ng/mL的IL-2、IL-7、IL-15、IL-21因子。
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CN115896019A (zh) | 2023-04-04 |
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