CN113215062A - 解淀粉酶芽孢杆菌、获取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了解淀粉酶芽孢杆菌、获取方法及其应用，属于烟草加工技术领域；所述解淀粉酶芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61457。本发明提供的菌株源于烤烟表面微生物，制备成的生物制剂作用于烟叶不会引入外源微生物；菌株均能分泌较高活性淀粉酶，能够降解烟叶中淀粉类物质，增加烟叶的甜润感，提高烟叶品质。
Description
技术领域
本发明涉及烟草加工技术领域，尤其涉及解淀粉酶芽孢杆菌、获取方法及其应用。
背景技术
烟叶是一种经济价值较高的商品，是卷烟工业的主要原料。近几年，随着卷烟工业的发展和“中式卷烟”的提出，对烟叶质量提出了更高的要求，在烟叶仓储方面除了要做好烟叶的防霉、杀虫工作，更要以“提高烟叶醇化质量”为中心，最大可能地提高烟叶的醇化质量，获得最佳的烟叶香气，减少烟叶杂气和刺激性，并在适宜的醇化期内使用，最大限度地发挥烟叶质量的效能。
烟叶醇化也称为“陈化”，是一种比较温和、缓慢的烟叶发酵方法，是改善烟叶内在品质、提高烟叶可用性的一种重要手段。烟叶醇化，是经过贮存的方式使烟叶内含成分继续发生分解和转化的过程，主要表现是烟叶化学成分的变化，如大分子物质的降解、棕色化反应及低分子刺激性成分的散失等。其主要特征为一些不具有香气特性的大分子化合物如淀粉、还原糖、蛋白质、氨基酸、烟碱、高级脂肪酸、香气前体物等发生分解与转化，形成具有香气特征的小分子化合物如挥发性酸、挥发性羰基化合物以及各种挥发性香气成分，进而促使烟叶香气和吸味品质得以明显改善。由于烟叶醇化过程中发生的反应较为复杂，因此现有理论研究对烟叶醇化机理还未能阐述透彻。从现有理论研究来看，一般认为烟叶醇化过程主要存在3种作用，即化学催化、微生物及酶的作用。
烟叶的醇化过程根据是否进行人为干预，分为自然醇化和人工醇化两种方式。人工醇化(发酵)是根据烟叶本身的品质特点，有针对性地在适当的温度、湿度条件下，发挥强化微生物菌株功能对烟叶增香提质的方法。和自然醇化相比，能加速醇化过程，缩短醇化时间，有针对性地改善烟叶品质。烟草研究者已在使用生物制剂的人工醇化方面做了大量的工作，从烟叶生态***中分离筛选具有一定功能的微生物，扩大培养后制备成菌剂，喷洒烟叶表面发挥功能。希望通过所筛选的微生物菌株制备生物制剂对烟叶进行人工醇化，利用强化菌剂功能有针对地改变烟叶原有品质缺陷，提高原料适用性和利用率。
本发明从醇化烟叶上筛选获得了一株微生物，采用适当条件作用于处于醇化初期的烟叶及经醇化两年仍不能达到使用要求的劣质烟叶，均能促进烟叶中淀粉的降解，得到还原糖的积累，丰富烟叶香味提高烟叶品质。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株能实现促进烟叶中淀粉的降解、得到还原糖的积累、丰富烟叶香味提高烟叶品质的解淀粉酶芽孢杆菌。本发明的第二目的在于提供所述解淀粉酶芽孢杆菌的获取方法。本发明的第三目的在于提供所述解淀粉酶芽孢杆菌在烟叶生产中的应用。本发明的第四目的在于提供所述解淀粉酶芽孢杆菌在烟株组织发酵中的应用
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明的第一目的是这样实现的：一株解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens strain)，与Bacillus amyloliquefaciens相似百分比(Per.Ident)为99.86％。是从烟株组织中分离得到，已于2021年4月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070)，其保藏编号为GDMCC No：61457。
本发明的第二目的是这样实现的：一种解淀粉酶芽孢杆菌的获取方法，具体包括以下步骤：
(1)烟叶表面微生物收集：
从醇化箱中选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10～50g浸入装有100～200毫升0.85％生理盐水中，在200～220rpm和室温下振荡2～4小时；用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液；
(2)具有淀粉降解能力的微生物初筛
在500～10000g离心力作用下对滤出液进行梯度离心，以去除烟叶原料碎片及大分子杂质，最后用0.85％生理盐水洗涤、重悬沉淀，获得烟叶表面微生物的菌悬液；
(3)具有淀粉降解能力的微生物分离：
上述菌液分别取100～200μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB、固态培养基上，30～37℃恒温培养2～3天，待长出的菌落数量种类不变；采用微生物挑选***QPixTM400(Molecular Devices)无菌转接至250mL摇瓶中，培养24h后，转速3000rpm离心10min，取上清液，并测定各菌株淀粉酶活力。
(4)纯化及菌株鉴定
将所筛选具有较高淀粉酶能力的菌种，接种于LB液态培养基中，30～40℃振荡培养24～36h，发酵液在8000～10000g，4℃条件下离心5～10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；采用细菌基因组提取试剂盒，提取菌体DNA，进行16srDNA PCR扩增获得的产物凝胶电泳检验合格后测序，再在NCBI(National Center forBiotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行比对，得知该菌种为解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)。
本发明的第三目的是这样实现的：一种解淀粉酶芽孢杆菌在烟叶生产中的应用，具体包括以下步骤：
(1)生物制剂制备
将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用；
(2)生物制剂应用于烟叶醇化
将生物制剂与无菌水混合，制备成1×108～10cfu/mL的菌悬液，按20％～30％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，30～40℃，湿度70～80％条件下培养12～48h，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢；
(3)烟叶品吸质量评价
水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h；
品吸评价参照标准《YC/T138-1998烟草及烟草制品感官评价方法》、《YC/T496-2014卷烟感官舒适性评价方法》，组织专业品吸人员对烟叶的感官质量进行评定。
本发明的第四目的是这样实现的：一种解淀粉酶芽孢杆菌在烟株组织发酵中的应用。所述的烟株组织为烤烟的叶片和/或茎。
本发明还提供了一种生物制剂，所述生物制剂包括上述的解淀粉酶芽孢杆菌。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的菌株源于烤烟表面微生物，制备成的生物制剂作用于烟叶不会引入外源微生物；
本发明的菌株具有生长速度快、不易感染杂菌、耐受苛刻条件的能力强、易培养等优势。
本发明的菌株均能分泌较高活性淀粉酶，能够降解烟叶中淀粉类物质，增加烟叶的甜润感，提高烟叶品质；
本发明的生物制剂的主体成分为一种微生物菌株，菌株制备过程简单、易操作，降低了生产成本；该菌株作用时间为12h～48h，相对已报道用于人工醇化的单菌株制剂作用时间短；
该生物制剂对烟叶进行人工发酵，通过感官品吸能一定程度改善烟叶品质，能增加烟叶甜味，丰富香气，增加烟气饱满感，能一定程度降低烟叶刺激感。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一株解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61457。
所述菌株源于烤烟表面微生物，制备成的生物制剂作用于烟叶不会引入外源微生物；能分泌较高活性淀粉酶，能够降解烟叶中淀粉类物质，增加烟叶的甜润感，提高烟叶品质；
所述菌株的获取方法，具体包括以下步骤：
(1)烟叶表面微生物收集：
从醇化箱中选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10～50g浸入装有100～200毫升0.85％生理盐水中，在200～220rpm和室温下振荡2～4小时；用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液；
(2)具有淀粉降解能力的微生物初筛
在500～10000g离心力作用下对滤出液进行梯度离心，以去除烟叶原料碎片及大分子杂质，最后用0.85％生理盐水洗涤、重悬沉淀，获得烟叶表面微生物的菌悬液；
(3)具有淀粉降解能力的微生物分离：
上述菌液分别取100～200μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB、固态培养基上，30～37℃恒温培养2～3天，待长出的菌落数量种类不变；采用微生物挑选***QPixTM400(Molecular Devices)无菌转接至250mL摇瓶中，培养24h后，转速3000rpm离心10min，取上清液，并测定各菌株淀粉酶活力。
(4)纯化及菌株鉴定
将所筛选具有较高淀粉酶能力的菌种，接种于LB液态培养基中，30～40℃振荡培养24～36h，发酵液在8000～10000g，4℃条件下离心5～10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；采用细菌基因组提取试剂盒，提取菌体DNA，进行16srDNA PCR扩增获得的产物凝胶电泳检验合格后测序，再在NCBI(National Center forBiotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行比对，得知该菌种为解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)。
所述菌株在烟草加工中的应用，具体包括以下步骤：
(1)生物制剂制备
将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用；
(2)生物制剂应用于烟叶醇化
将生物制剂与无菌水混合，制备成1×108～10cfu/mL的菌悬液，按20％～30％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，30～40℃，湿度70～80％条件下培养12～48h，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢；
(3)烟叶品吸质量评价
水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h；
品吸评价参照标准《YC/T138-1998烟草及烟草制品感官评价方法》、《YC/T496-2014卷烟感官舒适性评价方法》，组织专业品吸人员对烟叶的感官质量进行评定。
下面结合具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明：
实施例1
菌株的获取及鉴定保藏：
醇化烟叶微生物的分离：
(1)烟叶表面微生物收集：
从醇化箱中不同的位置，采用五点取样法选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10g浸入装有200毫升0.1M，0.85％生理盐水的250mL锥形瓶中，在220rpm和30℃下振荡3小时。用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液。
(2)微生物分离：上述菌液分别取100～200μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB、固态培养基上，30～37℃恒温培养2～3天，待长出的菌落数量种类不变。采用微生物挑选***QPixTM400(Molecular Devices)无菌转接至250mL摇瓶中，培养24h后，转速3000rpm离心10min，取上清。按照实验方法测定各菌株淀粉酶活力。洗涤菌体沉淀加无菌水制成菌悬液，通过平板分离纯化菌株，培养获得菌悬液后与50％甘油按1:1比例混合，保藏于-80℃的超低温冰箱中备用。
筛选培养基：蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、酵母提取物5g/L，pH 7.2。培养基中其他成分经121℃、20min灭菌后冷却，在接种前，在培养基中迅速添加叶黄素溶液。
纯化及菌株鉴定
将所筛选具有较高淀粉类降解能力的菌种，接种于LB液态培养基中，30℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍。采用细菌基因组提取试剂盒提取菌体DNA，用作PCR扩增模板。采用16srDNA通用引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′),1492R(5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′)，预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，30个循环，退火72℃10min条件下扩增，获得的产物进行凝胶电泳检验合格后，送至上海生工生物工程公司进行测序，再在NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行比对，得知该菌种为解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens strain)，与Bacillus amyloliquefaciens相似百分比(Per.Ident)为99.86％。保藏于广东省微生物菌种保藏中心(保藏编号为GDMCC No：61457)。
实施例2
生物制剂的制备及菌株在烟叶生产中的应用：
生物制剂制备
将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍。再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用。
菌株产酶性能测试
测定菌株对淀粉降解酶的分泌情况。发现菌株只对蛋白有降解能力，并能分泌较高酶活的淀粉酶。
表1菌株产酶能力测试
| 酶种类 | 淀粉酶(U/g·h) |
| 酶活 | 92.36±2.01 |
人工醇化未经醇化的烟叶
将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1×1010cfu/mL后按20％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培养箱中培养24h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢。在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。
烟叶品吸质量评价：
水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h。
品吸评价参照标准《YC/T138-1998烟草及烟草制品感官评价方法》、《YC/T496-2014卷烟感官舒适性评价方法》、及相关企业单料烟及评价标准，组织专业品吸人员7人对烟叶的感官质量进行评定。由品吸结果可知，原有烟叶品吸的整体特征为有明显的刺激性和杂气，香气显得昏杂，但清甜感尚有，整体有一定甜度，经生物制剂处理后烟气刺激性、杂气有所下降，增加香气浓度、饱满感提升，能较好地促进烟叶品质提升，能缩短烟叶醇化时间。
实施例3
生物制剂在烟叶生产中的应用(省略的步骤与实施例2相同)：
按实施例2制得生物制剂，对次等烟叶(自然醇化2年品质仍未达到最低使用要求的浓香型烟叶)进行人工醇化。醇化条件为将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1×108 ～10cfu/mL后按20％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培养箱中培养48h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢。在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。对烟叶品质进行评定。原有烟叶品吸整体特征为喉部刺激明显，杂气明显，甜感弱。经生物制剂处理后能明显增加甜度，增加了香气饱满度，烟叶刺激性下降。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 四川中烟工业有限责任公司
<120> 解淀粉酶芽孢杆菌、获取方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1457
<212> DNA
<213> 解淀粉酶芽孢杆菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gccaggggcg ggggtgctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60
atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120
ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg 180
tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240
gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360
ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 420
ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 540
tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600
ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660
gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720
tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780
ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1020
acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1260
acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttag gagccagccg 1440
ccgaaggtga acagagg 1457
Claims (5)
1.一株解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61457。
2.一种权利要求1所述的解淀粉酶芽孢杆菌的获取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)烟叶表面微生物收集
从醇化箱中选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10～50g浸入装有100～200毫升0.85％生理盐水中，在200～220rpm和室温下振荡2～4小时；用两层无菌纱布过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液；
(2)具有淀粉降解能力的微生物初筛
在500～10000g离心力作用下对滤出液进行梯度离心，以去除烟叶原料碎片及大分子杂质，最后用0.85％生理盐水洗涤、重悬沉淀，获得烟叶表面微生物的菌悬液；
(3)具有淀粉降解能力的微生物分离
上述菌液分别取100～200μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB、固态培养基上，30～37℃恒温培养2～3天，待长出的菌落数量种类不变；采用微生物挑选***QPixTM400(Molecular Devices)无菌转接至250mL摇瓶中，培养24h后，转速3000rpm离心10min，取上清液，并测定各菌株淀粉酶活力。
(4)纯化及菌株鉴定
将所筛选具有较高淀粉酶能力的菌种，接种于LB液态培养基中，30～40℃振荡培养24～36h，发酵液在8000～10000g，4℃条件下离心5～10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；采用细菌基因组提取试剂盒，提取菌体DNA，进行16srDNA PCR扩增获得的产物凝胶电泳检验合格后测序。
3.一种如权利要求1所述的解淀粉酶芽孢杆菌在烟叶生产中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)生物制剂制备
将筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清液收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍；再加入适量海藻糖、蔗糖溶液保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，低温保藏待用；
(2)生物制剂应用于烟叶醇化
将生物制剂与无菌水混合，制备成1×108～10cfu/mL的菌悬液，按20％～30％的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，30～40℃，湿度70～80％条件下培养12～48h，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终止菌株继续代谢；
(3)烟叶品吸质量评价
水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h；
品吸评价参照标准《YC/T138-1998烟草及烟草制品感官评价方法》、《YC/T496-2014卷烟感官舒适性评价方法》，组织专业品吸人员对烟叶的感官质量进行评定。
4.一种如权利要求1所述的解淀粉酶芽孢杆菌在烟株组织发酵中的应用。
5.一种生物制剂，所述生物制剂包括权利要求1-4任一项所述的解淀粉酶芽孢杆菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210806 |
|
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