CN109022312B - 一种利用复合生物制剂改善卷烟抽吸品质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种由高地芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合生物制剂及其在烟叶发酵中的应用，所述复合生物制剂采用中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC24238的高地芽孢杆菌和保藏号为CICC10732的枯草芽孢杆菌，经菌种活化、制备发酵液、离心、复配等步骤制备而成。

Description

一种利用复合生物制剂改善卷烟抽吸品质的方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种复合生物制剂及其在烟叶发酵中的应用。
背景技术
19世纪50年代，苏联科学家涅斯列尔和什列晋格提出烟叶发酵是空气中氧对烟叶成分的氧化过程；19世纪80年代，什列晋格之子小什列晋格提出了烟叶的微生物发酵假说,他认为烟叶发酵初期是由微生物起主导作用，后续过程才是在无机催化剂的作用下进行；同时期，列夫还提出的烟叶发酵中包含大量酶作用的说法。现在普遍认为，许多烟叶的发酵过程离不开其表面存在大量并且种类繁多的微生物，在烟叶发酵过程中，这些微生物可以将烟叶中的一些大分子物质如蛋白质、淀粉降解为单糖和氨基酸等一些小分子，然后这些小分子物质在经过一系列反应可以生成醇、醛、酸、酯、酮等香味成分，从而提升烟叶的吸食品质。
已有许多研究烟叶发酵微生物以及使用微生物改善发酵品质的常识：REID等人发现，烘烤后的雪茄烟叶表面存在大量的细菌和霉菌。KOLLER最先尝试在烟叶上接种微生物，通过在雪茄烟叶接种酵母菌发现可以加速发酵进程，使发酵更为彻底。黄静文从烟叶表面分离出一种短小芽孢杆菌用于烟叶发酵，发现可以提升烟香、醇和烟气、降低刺激性和掩盖杂气。Gong 从种植烟草的土壤中分离得到一株红球菌(Rhodococcus sp.)，发现该细菌可以有效的降解烟叶中烟碱的含量。Chen从醇化多年的烟叶表面分离出一株假单胞菌Nic22(Pseudomonas sp.)，并将其接种至以烟碱为唯一碳源和氮源的培养基，在30℃，220rpm的摇床中发酵2d，结果发现烟碱的降解率超过70％。
发明内容
本发明目的在于提供一种由两种微生物复配而成的生物制剂，旨在为探索微生物固态发酵烟叶，改善其内在品质的方法，并为进一步研究提供理论和数据支持。
本发明的技术方案具体如下所述。
本发明提供了一种由高地芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合生物制剂，其特征在于，通过如下生产步骤制备获得：
(1)菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化；
(2)制备发酵液，将步骤(1)中活化后的菌种分别接种到发酵培养基中发酵制备发酵液；
(3)离心，将步骤(2)中所制备的发酵液离心；
(4)菌株复配，将步骤(3)中发酵液离心后除去上清液，收集湿菌体，然后用无菌去离子水对湿菌体进行重悬，使用分光光度计确定稀释倍数，使两菌株的菌体浓度稳定一致，然后按0.9：1至1.1:1的比例进行复配即得复合生物制剂。
优选地，所述发酵菌株为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC24238的高地芽孢杆菌和保藏号为CICC 10732的枯草芽孢杆菌。
优选地，所述步骤(4)中的复配比例为1：1。
优选地，步骤(1)中，所述活化培养基为PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、去离子水1000ml、自然pH；活化培养2至3日。
优选地，步骤(2)中，所述发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5.0g/L、NaCl10g/L，pH＝7；所述的发酵条件为：在35至40℃、100-150rpm的摇床中发酵12至36小时。
优选地，步骤(3)中，在8000-12000r/min进行离心5至15min。
优选地，步骤(4)中，菌体浓度稳定时吸光度为OD600＝1.45，此时菌体浓度稳定在108 cfu/ml。
本发明还提供了上述由高地芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合生物制剂在烟叶发酵中的应用。
优选地，应用中按料液比，烟叶(干基)：复合生物制剂＝1g：0.28ml，将复合生物制剂喷洒至烟叶表面。
优选地，应用中喷洒微生物制剂后，在37℃、相对湿度75％，发酵48小时。
经复合生物制剂发酵后，改善了烟叶的糖碱比，使卷烟的香气更加细腻，烟气透发性更好，增加了烟气的甜润感，同时减轻刺激性，口感发涩程度减小，余味纯净舒适，劲头适中，卷烟的吸食品质得到了较好改善。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。
实验物料：
2016年贵州兴义复烤后烟叶，等级：B3F，由广西中烟工业有限责任公司提供；
实验设备及检测方法：
使用AA3型连续流动分析仪(德国SEALAnalytical)对烟梗常规化学成分使用进行分析；方法采用：《YCT160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、《YCT162-2011烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》、《YCT 173-2003烟草机烟草制品中钾的测定法火焰光度法》、《YCT 159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》测定烟叶中的总糖、还原糖、烟碱、钾和氯的含量。
实施例
CICC 24238的高地芽孢杆菌和保藏号为CICC 10732的枯草芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心网站(CICC 24238 2017年07月12日收藏，CICC 10732于2013年08月13 日收藏)
(1)活化后，用接种环将菌株从活化培养基中接种2环到100ml LB液体培养基，在37℃， 120r/min摇床中培养24h；
(2)将得到的发酵液在4℃，10000r/min离心10min；
(3)将步骤(2)离心后的发酵液弃上清液收集湿菌体，用无菌去离子水对湿菌体进行重悬，使用分光光度计确定稀释倍数，使菌体浓度稳定在108cfu/ml，测得此时OD600＝1.45，然后按各吸取5ml菌悬液进行复配即得复合生物制剂；
(4)将步骤(3)组成的复合生物制剂均匀喷洒在36g(干基)烟叶上，对照组喷洒等量无菌去离子水，将处理好的烟叶置于37℃，相对湿度75％的条件下发酵48小时后备用。处理编号如表1所示
表1试验编号
Figure BDA0001751992730000031
实验检测
以未经任何处理的烟叶作为空白组，以喷洒等量无菌去离子水的烟叶为对照组，以实施例中处理后的烟叶作为试验组，将对照组和试验组的烟叶置于37℃，相对湿度75％的条件下发酵48h后备用，对烟叶的常规化学成分进行分析，具体如表2所示；将发酵后的烟叶进行切丝、卷制，感官评价结果如表3所示。
表2：样品处理前后常规化学成分的比较：
Figure BDA0001751992730000032
Figure BDA0001751992730000041
烟叶水溶性总糖含量与烟碱含量应保持适当的比例，简称糖碱比。糖碱比例协调能使烟气在醇和的同时又保持具有香气、吃味及适宜的浓度和劲头。一般烤烟的糖碱比以8-15为宜，糖碱比过低，卷烟烟气口感差，杂气多，刺激性大。由表2中数据可以看出，对照组和试验组烟叶的烟碱含量均有下降，总糖和还原糖的含量与空白相比均上升，这是因为在发酵过程中烟叶内淀粉发生了分解，但试验组总糖和还原糖的含量要低于对照组，这是因为在烟叶表面接种的微生物以烟叶中的糖类作为碳源用于自身生长发育；由表3可知，试验组的糖碱比最佳为9.08。
表3：样品处理前后感官评析：
对处理后的烟叶进行切丝、卷制，然后将各组卷烟样品(每支烟只总重0.80±0.01g) 在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)％的恒温恒湿箱中平衡24h后，依据单料烟评价标准对卷烟进行质量评吸鉴定和评价。
具体评价结果如下表所示。
Figure BDA0001751992730000042
从上述评价结果可以看出，经复合生物制剂发酵后，改善了烟叶的糖碱比，使卷烟的香气更加细腻，烟气透发性更好，增加了烟气的甜润感，同时减轻刺激性，口感发涩程度减小，余味纯净舒适，劲头适中，卷烟的吸食品质得到了较好改善。

Claims (5)

1.一种由高地芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组成的复合生物制剂在烟叶发酵中的应用，其特征在于，所述复合生物制剂通过如下生产步骤制备获得：
(1)菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化；
(2)制备发酵液，将步骤(1)中活化后的菌种分别接种到发酵培养基中发酵制备发酵液；
(3)离心，将步骤(2)中所制备的发酵液离心；
(4)菌株复配，将步骤(3)中发酵液离心后除去上清液，收集湿菌体，然后用无菌去离子水对湿菌体进行重悬，使用分光光度计确定稀释倍数，使两菌株的菌体浓度稳定一致，然后按高地芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌0.9：1至1.1：1的比例进行复配即得复合生物制剂；
其中高地芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC 24238的高地芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC10732的枯草芽孢杆菌；
其中步骤(4)中的复配比例为1：1；
所述应用包括按料液比，干基烟叶：复合生物制剂＝1g：0.28ml，将复合生物制剂喷洒至烟叶表面；
喷洒复合生物制剂后，在37℃、相对湿度75％，发酵48小时。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述活化培养基为PDA培养基，其配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、去离子水1000ml、自然pH；活化培养时间为2至3日。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5.0g/L、NaCl 10g/L，pH＝7；所述发酵的条件为：在35至40℃、100-150rpm的摇床中发酵12至36小时。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，在8000-12000r/min进行离心5至15min。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，菌体浓度稳定一致时吸光度为OD600＝1.45，此时菌体浓度为108cfu/ml。
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