CN111616403A - 一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

发明公开了一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用，属于烟草醇化技术领域。本发明从醇化烟叶上分离获得一株能产多种酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。该菌株适合烤烟发酵，有利于促进不同香型、品质的烟叶醇化过程，提高品质，缩短醇化时间。本发明菌株易培养、生长速度快，能够耐受苛条件、高活性、能产多种酶具备降解高分子物质的能力等特点。通过适当调节生物制剂处理烟叶的条件，可获得降低烟叶刺激性、减弱杂气、增加甜味等效果。

Description

一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用，属于烟草醇化技术 领域。

背景技术

烟叶醇化(又称陈化)是卷烟工业的重要生环节。由于当年新收原烟在品质上会存在一 定程度的缺陷，如青杂气重、杂气掩盖香气、刺激性大、烟气粗糙，尤其是低等烟叶存在有 苦、辣、涩等不良感受。为了改善烟叶品质，增加烟叶制造卷烟的可用性和适用性，必须对 烟叶进行醇化处理。烟叶醇化即是经过贮存方式使烟叶在微生物、酶及化学成分的共同作用 下发生一系列生化反应，如一些不具有香气特性的大分子化合物如淀粉、蛋白质、果胶、纤 维素、木质素、烟碱、香气前体物(萜类)等发生分解转化，形成具有香气特征的小分子化 合物如还原糖、有机酸、氨基酸、羰基化合物等成分，进而促使烟叶香气和吸味品质的改善。 但工业上烟叶自然醇化效率低，通常时间长达2～3年，从而导致库存管理成本加大，烟叶周 转周期长、流动资金占用大，而且还会有部分次等烟叶在醇化后品质仍达不到生产使用要求。 对此，人工醇化方式正逐渐被研究者及行业关注。

烟叶中高分子物质的含量偏高，常会影响烟叶质量，如淀粉含量偏高时，影响烟叶燃烧 速度和完全性，并产生一定的焦糊味；蛋白质含量偏高时，在燃烧时也会产生烧羽毛的臭味， 并有辛辣、苦涩感；而烟叶中果胶物质含量偏高会增加烟叶焦油生成量，增加烟气中的有害 物质甲醛、乙醛等的含量。同时，淀粉、果胶、蛋白质等物质降解产生的水溶性糖、还原糖、 氨基酸等小分子物质，能平衡酸碱味，在一定的条件下能促进美拉德反应产物的生成，减少 烟气的刺激性，利于烟气的吃味、香味。所以，利用含有相应降解酶的微生物或商品水解酶 制剂单独或搭配作用，有利于促进醇化过程。2006年赵铭钦等人制备了含巨大芽孢和枯草芽 孢杆菌，外加糖化酶、蛋白酶的复合烟草增质剂；2012年潘佳华等人研究由植物乳杆菌和热 醋酸杆菌搭配的复合菌剂；2011年毅等人使用了一株能高产淀粉酶的菌株芽孢杆菌的菌剂； 2006年李琳等，陈守人等分别研制了适用于上部烟叶的枯草芽孢杆菌、高地芽孢杆菌的菌剂。 相关研究虽较多，各具特色，但方法不同效果不一，存在菌剂制备过程复杂、生产成本高、 工业化应用操作可行性小、对不同烟叶品种的普适性低等问题。

发明内容

为了解决目前烟叶自然醇化效率低、时间长、对次等劣质烟叶处理效果不佳等现状，本 发明从醇化烟叶上筛选获得了一株能产淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等多种酶的菌株， 产酶综合能力强，省去了在生物制剂制备中搭配其他菌剂或酶制剂来平衡地高分子物质的降 解作用；该菌株对对烟叶的提质也具有较好的普适性，能对处于醇化初期的烟叶及经醇化两 年仍不能达到使用要求的烟叶均有较好的提质效果。

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株已于2020年3 月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60982，保藏地址为广 州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明提供了一种生物制剂，所述生物制剂由所述解淀粉芽孢杆菌制成。

本发明提供了所述生物制剂的制备方法，将所述解淀粉芽孢杆菌接种至含烟叶提取液的 LB液态培养基中，35～38℃振荡培养20～25h至菌液浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL，离心后 弃上清，收集菌泥，将菌泥用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍，再加入终浓度3～7％ (v/v)的海藻糖、终浓度4～8％(v/v)蔗糖溶液做保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备得到菌 剂干粉，即为生物制剂。

本发明提供了一种加速烟叶纯化的方法，所述方法是将所述生物制剂加水稀释后或将所 述解淀粉芽孢杆菌菌液，喷洒至烟叶表面，培养20～25h。

在本发明的一种实施方式中，将所述生物制剂加水稀释至菌体浓度为 1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL。

在本发明的一种实施方式中，将所述生物制剂稀释后，按10～25％(w/w)喷至烟叶表面。

在本发明的一种实施方式中，将烟叶在35～40℃、湿度65～75％的环境中进行培养。

在本发明的一种实施方式中，所述烟叶包括清香型未醇化烟叶，或次等浓香型，或次等 中间香型烟叶。

本发明还提供一种提升烟叶香味的方法，所述方法是将所述生物制剂加水稀释后或将所 述解淀粉芽孢杆菌菌液，喷洒至烟叶表面，培养12～25h。

本发明还保护所述解淀粉芽孢杆菌，或所述生物制剂，或加速烟叶纯化的方法在烟叶醇 化中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的菌株源于醇化烟叶自身的生态***，制备成的生物制剂作用于烟叶不 会引入外源微生物；

(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌，菌株生长速度快、不易感染杂菌、耐受苛刻条件的能力 强、易培养；能分泌淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等多种酶，淀粉酶、糖化酶、中性蛋白 酶、酸性蛋白酶酶活分别可达90.92U/g·min，38.52U/g·h，64.33U/g·h、25.27U/g·h，能实现 烟叶中多种高分子物质的降解，促成丰富的小分子致香物质的生成；

(3)菌株作用时间为12h～48h，相对已报道类似单菌株制剂作用时间短；

(4)本发明的解淀粉芽孢杆菌可适用于不同的烟叶，通过感官品吸及HS-SPME-GC/MS 技术分析醇化烟叶中致香组分评价，得知均能改善烟叶品质，降低烟叶刺激性、杂气、增加 甜味，达到提质增香效果，有助于烟叶中各类挥发性组分的增加。

生物材料保藏

解淀粉芽孢杆菌，分类学命名为Bacillus amyloliquefaciens，已于2020年3月23日保藏 于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60982，保藏地址为广州市先烈中 路100号大院59号楼5楼。

具体实施方式

结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例用于说明本发明，但 不用来限制本发明的范围。

淀粉酶酶活测定：采用碘显色法测定淀粉酶酶活，酶活力定义为每克干烟叶的水提酶液， 在60℃条件下，1min水解1mg可溶性淀粉溶液，定义为一个酶活力单位，计为：U/g·min。

糖化酶酶活测定：采用3,5二硝基水杨酸(DNS)显色法测定糖化酶酶活，酶活力定义为每 克干烟叶的水提酶液，在40℃、pH4.6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，定义为一个酶活力单位，计为：U/g·h。

果胶酶酶活测定：采用DNS显色法测定果胶酶酶活，酶活力定义为每克干烟叶的水提酶 液，在50℃条件下，1h水解果胶溶液产生1mg半乳糖醛酸，定义为一个酶活力单位，计为：U/g·h。

中性蛋白酶酶活测定：采用福林酚法测定中性蛋白酶酶活，酶活力定义为每克干烟叶的 水提酶液，在40℃、p H7.2条件下，每小时水解酪蛋白生成1μg酪氨酸定义为1个酶活单 位。计为：U/g·h。

酸性蛋白酶酶活测定：方法同中性蛋白酶，区别在于，将酶作用pH改为3。

HS-SPME-GC/MS技术平台测定醇化烟叶中挥发性、半挥发性致香组分：

(1)样品处理：将醇化烟叶用研磨仪70Hz处理90s，过60目筛。准确称取烟叶粉末2.000g，装入20mL顶空瓶中，加入1μL氚代萘-二氯乙烷内标溶液，充分混合均匀后盖上 磁性顶空瓶盖待测。将待测醇化烟叶样品及对照样分组，每组6个平行样。

(2)顶空固相微萃取：采用膜厚为50/30μm，二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头；孵化温度：60℃，萃取时间：30min。

(3)GC/MS色谱条件：采用配有自动进样器的Thermo Trace1310-ISQ GC/MS气相色谱/质谱联用仪。采用高惰***联弱极性HP-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；

(4)致香检测结果分析：通过对检测结果进行数据处理，对比分析利用生物制剂对烟叶 进行处理后，对烟叶中挥发性致香成分的影响。

实施例1：菌株的分离和鉴定

步骤一：醇化烟叶微生物的分离：

筛选菌株所用的烟叶来自于四川凉山，由四川中烟工业有限责任公司提供。

(1)烟叶表面微生物收集：

从醇化箱中选择无霉变、无虫蛀、无损烟叶样品10g浸入装有200毫升0.1M，pH 7.2无菌磷酸盐缓冲液的250mL锥形瓶中，在220rpm和30℃下振荡2小时。用两层无菌纱布 过滤，收集含烟叶表面微生物的滤出液。

(2)微生物分离：取上述菌液稀释后，取100μL均匀涂布于含有烟叶提取液的LB固态培养基上，37℃恒温培养1天，待长出的菌落数量种类不变。用无菌接种针转接于新的LB平板上，37℃恒温培养12～14h，再从平板上挑取单菌落至新的LB平板上，如此连续培养2～3 代，直至获得稳定的单菌落菌株。

步骤二：目的菌株筛选

(1)平板初筛：在LB基础培养基中添加2％(v/v)的可溶性淀粉、1％(v/v)果胶、2％(v/v)酪蛋白分别获得能产淀粉酶、果胶降解酶、蛋白降解酶的初筛培养基。将所分离的各菌株纯培养制成1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/mL菌液，点种至初筛平板，考察各菌株降解不溶性高分 子物质形成透明圈的能力。

(2)酶活检测复筛：

对能形成较大透明圈的菌株在LB培养基中37℃恒温培养1天，获得的菌液进行淀粉酶、 糖化酶、果胶酶、蛋白酶酶活测定，考察产酶情况。

选取产酶酶种较多且酶活较高的菌株，所述菌株产酶情况如表1。

表1优选菌株产酶情况

步骤三：菌株鉴定

筛选菌种接种于含烟叶提取液的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h，得到菌液，将 菌液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌 泥2～3遍。采用细菌基因组提取试剂盒提取菌体DNA，用作PCR扩增模板。

采用16s rDNA通用引物27F和1492R，进行PCR扩增：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，30个循环，退火72℃10min。

27F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，(SEQ ID NO.2)

1492R：5’TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’，(SEQ ID NO.3)。

将获得的PCR产物进行凝胶电泳检验合格后，送至上海生工生物工程公司进行测序，再 在NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库 中进行比对，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(序列如SEQ ID NO.1所示)， 与NC_014551.1相似百分比为99.52％。

步骤四：菌株保藏

将菌株送至于广东省微生物菌种保藏中心保藏。

实施例2：生物制剂的制备

将实施例1中筛选得到的菌株接种于含烟叶提取液(在100mL，pH7.2磷酸缓冲溶液中 添加过40目的10g烟叶粉末，室温下浸提1h，用纱布过滤低温贮存备用)的LB液态培养基中，37℃振荡培养24h至菌液浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL，发酵液在10000g，4℃条件下离心10min，弃上清收集菌泥，用无菌0.85％的生理盐水洗涤菌泥2～3遍。再加入终浓度3～7％(w/w)的海藻糖、终浓度4～8％(w/w)蔗糖溶液做保护剂，进行真空冷冻浓缩，制备菌剂干粉，4℃保藏待用。

实施例3：生物制剂对未经醇化的清香型烟叶中的应用

1、生物制剂醇化烟叶

将实施例2制备得到的生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL后， 按10％(w/w)的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控 温控湿培养箱中培养24h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％ (w/w)，终止菌株继续代谢。

在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。

2、烟叶品吸质量评价：

水分平衡：将醇化烟叶放置温度为22℃，湿度为65％的条件下平衡水分48h。

品吸评价参照标准YC/T138-1998《烟草及烟草制品-感官评价方法》、YC/T496-2014《卷 烟感官舒适性评价方法》，组织专业品吸人员7人对烟叶的感官质量进行评定。具体评价结 果见表2。

表2烟叶处理前后感官品吸质量的变化

由品吸结果可知，原有烟叶品吸的整体特征为有明显的刺激性和杂气，香气显得昏杂， 但清甜感尚有，整体有一定甜度。经生物制剂处理后烟气变得柔和细腻，香韵变得更为丰富， 多了一点蜜甜香韵，甜感增加，能较好地促进烟叶品质提升，能缩短烟叶醇化时间。

3、烟叶致香成分检测分析：

采用HS-SPME-GC/MS技术平台测定醇化烟叶中挥发性、半挥发性致香组分。

(1)样品处理：将醇化烟叶用研磨仪70Hz处理90s，过60目筛；准确称取烟叶粉末2.000g，装入20mL顶空瓶中，加入1μL氚代萘-二氯乙烷内标溶液，充分混合均匀后盖上 磁性顶空瓶盖待测。将待测醇化烟叶样品及对照样分组，每组6个平行样；

(2)顶空固相微萃取：采用膜厚为50/30μm，二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头；孵化温度：60℃，萃取时间：30min；

(3)GC/MS色谱条件：采用配有自动进样器的Thermo Trace1310-ISQ GC/MS气相色谱 /质谱联用仪；采用高惰***联弱极性HP-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)；

(4)检测结果分析：对检测结果数据处理后，对比分析利用解淀粉芽孢杆菌生物制剂对 烟叶进行处理，烟叶中挥发性致香成分变化情况。

如表3所示，经过处理后的烟叶较对照组在醇、酚类、酯类、羰基类、杂环类等挥发性 物质的含量都有所提高，其中羰基类和杂环类分别较对照提高了35.7％和35.3％。

如表4所示，经过处理后的烟叶在富有花香、清香等对风味有促进作用的物质都较对照 有所提升，而不利于风味或一些对风味贡献不大的高分子物质含量有所减少，说明该菌能对 高分子物质进行降解及转化，促进小分子风味物质的形成，对提高烟叶品质具有较好作用。

表3烟叶处理前后挥发性物质各分类含量分析(μg/100g干基)

注：对照为未经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶，处理的烟叶为经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶

表4烟叶处理前后重要挥发性物质含量分析(μg/100g干基)

注：NA：表示未检测出物质的量；以上各物质风味特征评价参考史宏志等，烟草香味学，北京：中国农业出版社，2011.

表5处理前后烟叶六项常规物质含量

通过对烟叶中六项常规物质含量测定可知，处理后的烟叶还原糖，总糖含量有较大幅度 增加，分别较对照提高了39.3％和36.9％；总植物碱、总氮含量虽也增加，但能与糖含量形成 合适的糖碱比，糖氮比，氯，钾含量合适，对平衡烟叶香味，增加烟香浓度起着重要作用。

实施例4：生物制剂在提升次等浓香型烟叶品质中的应用

具体实施方式同实施例3，其区别在于：选用次等烟叶(自然醇化2年品质仍未达到最 低使用要求的浓香型烟叶)进行人工醇化。

醇化条件为将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/mL后，按20％ (w/w)的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培 养箱中培养48h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终 止菌株继续代谢。

在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。

对烟叶品质进行评价：

对照烟叶品吸整体特征为香气较昏杂，有明显的土腥气木质气，甜感较弱，烟气有一定 浓度，浓度尚有但劲头并不十分显著，喉部刺激明显。经生物制剂处理后达到香气浓度增加， 劲头略有下降，透发感增加，对韵调、质感均保留得较好等效果。具体品吸结果见表6。

如表7所示，经过处理后的烟叶较对照组在醇、酚类、酸类、酯类、羰基类、杂环类、烷烃类挥发性物质的含量都有所提高，其中酸类较对照提高了24.5％。

如表8所示，经过处理后的烟叶在富有花香、清香等对风味有促进作用的物质都较对照 有所提升，而不利于风味或一些对风味贡献不大的高分子物质含量有所减少，说明该菌能对 高分子物质进行降解及转化，促进小分子风味物质的形成，对提高烟叶品质具有较好作用。

表6烟叶处理前后感官品吸质量的变化

表7烟叶处理前后挥发性物质各分类含量分析(μg/100g干基)

注：对照为未经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶，处理的烟叶为经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶 表8烟叶处理前后重要挥发性物质含量分析(μg/100g干基)

注：NA：表示未检测出物质的量；以上各位置风味的评价参考史宏志等，烟草香味学，北京：中国农业出版社，2011.

表9处理前后烟叶六项常规物质含量

通过对烟叶中六项常规物质含量测定可知，经处理后的烟叶还原糖，总糖含量有所增加， 对平衡烟叶香味，增加烟香浓度起着良好的促进作用。

实施例5：生物制剂在提升次等中间香型烟叶品质中的应用

具体实施方式同实施例3，其区别在于：选用次等烟叶(自然醇化2年品质仍未达到最 低使用要求的中间香型烟叶)进行人工醇化。

醇化条件为将生物制剂加无菌水稀释至菌体浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL后按20％ (w/w)的添加量均匀地喷洒至烟叶表面，并混合均匀，37℃，湿度70％条件下在控温控湿培 养箱中培养48h后，取出烟叶放置烘箱中将烟叶在80～90℃温度下烘干水分至13～14％，终 止菌株继续代谢。

在烟叶上喷洒等量无菌水，在相同培养条件下发酵，获得实验对照样。

对照烟叶品吸整体特征为香气量饱满，质感好，但烟气浓度偏大，劲头明显，刺激偏大， 口感舒适性欠佳，香气中碱性气息稍明显，舌面残滞较明显。

经生物制剂处理后能达到较好改善劲头、刺激性，口感舒适性变好、质均保留得较好等 效果。具体品吸结果见表10。

表10烟叶处理前后感官品吸质量的变化

如表11所示，经过处理后的烟叶较对照组在醇、酚类、酯类、羰基类、杂环类、烷烃类 挥发性物质的含量都有所提高，其中羰基类和杂环类较对照分别提高了21.9％和25.2％。

表11烟叶处理前后挥发性物质各分类含量分析(μg/100g干基)

注：对照为未经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶，处理的烟叶为经解淀粉芽孢杆菌处理的烟叶

如表12所示，经过处理后的烟叶在富有花香、清香等对风味有促进作用的物质都较对照 有所提升，而不利于风味或一些对风味贡献不大的高分子物质含量有所减少，说明该菌能对 高分子物质进行降解及转化，促进小分子风味物质的形成，对提高烟叶品质具有较好作用。

表12烟叶处理前后重要挥发性物质含量分析(mg/100g干基)

注：NA：表示未检测出物质的量；以上各位置风味的评价参考史宏志等，烟草香味学，北京：中国农业出版社，2011.

表13处理前后烟叶六项常规物质含量

通过对烟叶中六项常规物质含量测定可知，经处理后的烟叶还原糖，总糖含量有所增加， 对平衡烟叶香味，增加烟香浓度起着良好的促进作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

四川中烟工业有限责任公司

<120> 一种加速烟叶醇化及提升烟叶品质的生物制剂及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1457

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

gccaggggcg ggggtgctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60

atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120

ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg 180

tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240

gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 360

ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 420

ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac 480

ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 540

tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 600

ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 720

tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 1140

tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1260

acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttag gagccagccg 1440

ccgaaggtga acagagg 1457

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2020年3月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60982。

2.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂由权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌制成。

3.权利要求2所述生物制剂的制备方法，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌培养至菌液菌体浓度达到1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL，离心后弃上清，收集菌泥，将菌泥用生理盐水洗涤菌泥2～3遍，再加入保护剂进行真空冷冻浓缩，制备得到菌剂干粉，即为生物制剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述保护剂为海藻糖和蔗糖。

5.一种加速烟叶醇化的方法，其特征在于，所述方法是将所述权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的菌液，添加至烟叶表面；或将权利要求2所述的生物制剂加水稀释后添加至烟叶表面。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌的菌液浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL，或所述生物制剂加水稀释至菌体浓度为1.0×10⁷～1.0×10¹⁰cfu/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将菌液或稀释后的生物制剂按质量比10～25％添加至烟叶表面。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将烟叶在30～40℃、湿度60～80％的环境中进行培养。

9.一种提升烟叶香味的方法，其特征在于，所述方法是将所述权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的菌液，添加至烟叶表面；或将权利要求2所述的生物制剂加水稀释后添加至烟叶表面。

10.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌，或权利要求2所述生物制剂，或权利要求5～9任一所述方法在烟叶醇化中的应用。