CN113208113B - 肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的nmn脂质体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体及其制备方法和在制作保健食品中的应用。本发明将NMN包覆于脂质体,并用肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖对脂质体表面进行修饰。接枝硫辛酸使得NMN脂质体具有缓释效果。接枝肉桂酸、硫辛酸提高了细胞对NMN的吸收量。修饰后的脂质体具有尺寸稳定性。本发明的脂质体,有助于NMN在人体保健领域的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品领域,具体涉及一种肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体及其制备和应用。
背景技术
随着人们年龄的增长、机体的衰老,很多健康问题随之产生,如血管功能障碍、运动能力衰退、甚至发生帕金森等病症,严重影响人们的生活质量。
烟酰胺单核苷酸(NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)反应的产物。近期研究发现,通过调节生物体内NMN的水平,对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用;另外,NMN还可通过参与和调节机体的内分泌,起到保护和修复胰岛功能,增加胰岛素的分泌,防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。
适时补充NMN对人体健康大有帮助。但NMN化学性质不稳定,对光氧非常敏感。NMN直接服用后,人体吸收率低,体内滞留时间短。这些问题极大的限制了NMN在人体保健领域的应用和推广。
目前,已有将NMN制备成胶囊制剂、脂质体形式等现有技术,如公开号为CN111789822A、CN111557910A的专利技术等。然而,NMN的吸收率以及脂质体的释放效果等都有待进一步提高。
发明内容
针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处,本发明提供了一种肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体,通过在脂质体上引入肉桂酸,增加细胞对NMN的吸收,通过在脂质体上引入硫辛酸,起到缓释作用并进一步增加细胞对NMN的吸收;通过壳聚糖修饰脂质体,提高脂质体的稳定性,客服对环境敏感的问题。
一种肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体,以质量百分比计,包括:
NMN脂质体 70%~95%,
肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖 5%~30%;
所述肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖的结构式如下式(I)所示:
其中,n为100~2000的整数。
本发明将NMN包覆于脂质体,并用肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖对脂质体表面进行修饰。接枝硫辛酸使得NMN脂质体具有缓释效果。接枝肉桂酸、硫辛酸提高了细胞对NMN的吸收量。修饰后的脂质体具有尺寸稳定性。本发明的脂质体,有助于NMN在人体保健领域的推广应用。
作为优选,所述NMN脂质体中NMN的质量百分比为10%~80%。
本发明还提供了所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体的一种优选制备方法,包括步骤:
(1)将脂质体制备材料和脂溶性成分充分溶解于有机溶剂中,得到溶液G;
(2)将溶液G进行减压旋转蒸发,除去所述有机溶剂得到脂质薄膜,均匀贴在容器壁上;
(3)将肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中,得到溶液H;将溶液H和NMN水溶液倒入上述含有所述脂质薄膜的容器内,冰水浴超声乳化分散混合,得到NMN脂质体组合物,即混合液状态的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体;
(4)选择性地进行本步骤:向所述NMN脂质体组合物中加入冻干保护剂,冷冻成固体状态后真空冻干,得到NMN脂质体组合物冻干粉末,即粉末状态的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体。
所述有机溶剂优选为氯仿和/或乙醇。
所述脂质体制备材料选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇中的至少一种,所述脂溶性成分选自维生素E、维生素A中的至少一种。
所述冻干保护剂优选为质量比为1:1的甘露糖-乳糖,用量优选为所述NMN脂质体组合物质量的15%。所述冷冻、真空冻干的温度优选为-80℃。
本发明还提供了所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体在制作保健食品中的应用。
发明人设计了含有所述肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体的SYNFECT系列成分组,并将其应用于保健食品,有助于NMN在人体环境内的缓释以及人体对NMN的持续高效吸收。
作为一个总的发明构思,本发明还提供了一种肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖,结构式如下式(I)所示:
其中,n为100~2000的整数。
本发明还提供了所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖的制备方法,包括步骤:
(a)在辣根过氧化物酶、过氧化氢的存在下,将肉桂酸接枝到壳聚糖上得到肉桂酸接枝壳聚糖,反应过程如下:
其中,HRP为辣根过氧化物酶,n为100~2000的整数;
(b)在pH=4~6、反应温度为60~80℃的条件下,将硫辛酸接枝到所述肉桂酸接枝壳聚糖上得到所述肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖,反应过程如下:
作为优选,步骤(a)具体包括步骤:
(a-1)将壳聚糖加入到乙酸水溶液中,加热搅拌充分溶解,然后调节pH至6,得到溶液A;
(a-2)将溶液A与磷酸钾缓冲溶液混匀,得到溶液B;
(a-3)向溶液B中加入肉桂酸,搅拌均匀得到溶液C;
(a-4)向溶液C中加入辣根过氧化物酶,然后分批加入过氧化氢水溶液,充分进行接枝反应,得到混合液D;
(a-5)将混合液D离心分离取沉淀物,即得所述肉桂酸接枝壳聚糖。
作为优选,步骤(b)具体包括步骤:
(b-1)将所述肉桂酸接枝壳聚糖加入到去离子水中,用乙酸调节pH至1.8使所述肉桂酸接枝壳聚糖完全溶解,得到溶液E;
(b-2)将硫辛酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于无水乙醇后,加入到去离子水中,再用乙酸调节pH至4,60℃加热得到溶液F;
(b-3)将溶液F逐滴加入到已加热至80℃的溶液E中,充分反应得到溶液G;
(b-4)向溶液G中逐滴加入无水乙醇,产生沉淀,离心收集沉淀产物;
(b-5)将所述沉淀产物在连续蒸馏水中透析后,干燥即得所述肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖。
本发明与现有技术相比,主要优点包括:本发明将NMN包覆于脂质体,并用肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖对脂质体表面进行修饰。接枝硫辛酸使得NMN脂质体具有缓释效果。接枝肉桂酸、硫辛酸提高了细胞对NMN的吸收量。修饰后的脂质体具有尺寸稳定性。本发明制备的脂质体,有助于NMN在人体保健领域的推广应用。
附图说明
图1为实施例1和对比例1~3的脂质体在模拟肠液中的释放曲线图;
图2为HT22细胞对实施例1和对比例1~3的脂质体包覆的NMN 3小时吸收结果图;
图3为HT22细胞对实施例1和对比例1~3的脂质体包覆的NMN 6小时吸收结果图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰NMN脂质体制备
S1:
1)将0.2g壳聚糖加入100ml 1%wt的乙酸水溶液中,在40℃搅拌溶解。以0.1M氢氧化钠溶液调溶液pH值到6.0,得到溶液A。
壳聚糖结构式如下:
其中,n为100~2000的整数。
2)将溶液A与105mM的磷酸钾缓冲溶液以1:9体积比例混合均匀,得到溶液B。
3)向200ml溶液B中加入1g肉桂酸,搅拌均匀得到溶液C。
4)向溶液C中,加入5mg辣根过氧化物酶,室温下每隔3分钟加入0.5ml 10%体积分数的过氧化氢水溶液,90分钟后停止反应,得到混合液D。
5)将混合液D用离心机以5000r/min的转速分离15分钟,混合液分层。收集沉淀的反应产物,即肉桂酸接枝壳聚糖。
S2:
6)将S1获得的肉桂酸接枝壳聚糖1g,加到100ml去离子水中,用乙酸调节pH至1.8使得肉桂酸接枝壳聚糖完全溶解,得到溶液E。
7)将421mg硫辛酸和300mgEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶解于5ml无水乙醇后,加入到15ml去离子水中。用乙酸调节溶液pH至4,60℃加热30min,得到溶液F。
8)将溶液E加热到80℃,将溶液F逐滴加入到溶液E中,反应6小时,得到溶液G。
9)在溶液G中逐滴加入无水乙醇,得到沉淀物。在离心机上以10000rpm转速离心5min,收集沉淀物。
10)将沉淀物装入透析袋中,在连续蒸馏水中透析48h。透析产物经过干燥后,得到肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖。
S3:
11)将大豆卵磷脂、胆固醇和维生素E充分溶解于有机溶剂氯仿或乙醇中,得到4ml溶液G。溶液G中,大豆卵磷脂浓度为40mg/ml,胆固醇浓度为10mg/ml,维生素E浓度为5mg/ml。
12)将溶液G进行减压旋转蒸发,除去有机溶剂得到脂质薄膜,均匀贴在容器壁上。
13)将S2得到的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖40mg溶解于磷酸盐缓冲液中,得到4ml溶液H。将4ml溶液H和5ml 1%wt NMN水溶液倒入含有薄膜的容器内,进行超声乳化混合。在冰水中以200W功率分散2min,得到脂质体混悬液。
14)在脂质体混悬液中加入质量分数为脂质体混悬液15%的甘露糖-乳糖(质量比1:1)冻干保护剂,置低温冰箱中-80℃预冻24小时,预冻后迅速转移至冷冻干燥机中,减压至0.2Mbar,于-80℃下真空冷冻干燥24小时。得到脂质体冻干粉末,即粉末态的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体。
对比例1肉桂酸接枝壳聚糖修饰NMN脂质体制备
与实施例1相比,区别仅在于缺少S2,直接用S1得到的肉桂酸接枝壳聚糖替代S3中的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖,其余均相同,得到肉桂酸接枝壳聚糖修饰NMN脂质体。
对比例2壳聚糖修饰NMN脂质体制备
与实施例1相比,区别仅在于缺少S1、S2,直接用壳聚糖替代S3中的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖,其余均相同,得到壳聚糖修饰NMN脂质体。
对比例3NMN脂质体制备
与实施例1相比,区别仅在于缺少S1、S2,并且S中不加入溶液H,其余均相同,得到NMN脂质体。
实施例1和对比例1~3的脂质体用去离子水稀释至一定浓度后,采用动态光散射技术测定脂质体平均粒径、多分散系数(Polydispersity index,PdI)和Zeta电位,结果如表1所示。经过修饰后的脂质体Zeta电位升高,多分散指数PDI明显降低,颗粒稳定性增加。肉桂酸和硫辛酸接枝壳聚糖修饰的脂质体,尺寸有所增加。
表1实施例1和对比例1~3脂质体尺寸、多分散指数PDI、Zeta电位
为了比较不同脂质体的释放性能,将实施例1和对比例1~3制备的脂质体密封于透析袋中(截留分子量8000-4000Da)在30ml模拟肠液中透析(模拟肠液组成:吐温80250ml,0.2mol KH2PO4 250ml,0.2mol NaOH118ml,去离子水1000ml,pH6.8),温度控制37℃。每隔1小时,用HPLC检测模拟肠液中NMN的浓度,绘制释放曲线如图1所示。与未经修饰的脂质体、肉桂酸接枝壳聚糖修饰的脂质体、壳聚糖修饰的脂质体相比,经过硫辛酸接枝壳聚糖修饰的脂质体,NMN释放明显减慢,12小时的累计释放率为30%,有效增加了体内滞留时间。
为比较细胞对不同脂质体包覆的NMN的吸收情况,HT22(小鼠海马神经元细胞)在37℃培养24小时后,培养基中加入荧光探针香豆素标记的NMN脂质体,在培养一定时间后,用磷酸缓冲盐溶液清洗3次细胞。加入500ml细胞裂解溶液培养2小时后,取100ml细胞裂解物测定香豆素标记的NMN的含量。在HT22细胞对脂质体的吸收量如图2、3所示。在培养的3小时和6小时内,HT22细胞对肉桂酸接枝壳聚糖修饰的脂质体的吸收量,明显高于NMN脂质体和壳聚糖修饰的NMN脂质体。肉桂酸接枝壳聚糖修饰的脂质体有效促进了对NMN的吸收。并且,经硫辛酸接枝后所得的脂质体可进一步促进对NMN的吸收。
此外应理解,在阅读了本发明的上述描述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体,其特征在于,所述NMN脂质体中NMN的质量百分比为10%~80%。
3.根据权利要求1或2所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(1)将脂质体制备材料和脂溶性成分充分溶解于有机溶剂中,得到溶液G;
(2)将溶液G进行减压旋转蒸发,除去所述有机溶剂得到脂质薄膜,均匀贴在容器壁上;
(3)将肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖溶解于磷酸盐缓冲液中,得到溶液H;将溶液H和NMN水溶液倒入上述含有所述脂质薄膜的容器内,冰水浴超声乳化分散混合,得到NMN脂质体组合物,即混合液状态的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体;
(4)选择性地进行本步骤:向所述NMN脂质体组合物中加入冻干保护剂,冷冻成固体状态后真空冻干,得到NMN脂质体组合物冻干粉末,即粉末状态的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂为氯仿和/或乙醇。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述脂质体制备材料选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、胆固醇中的至少一种,所述脂溶性成分选自维生素E、维生素A中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖修饰的NMN脂质体在制作保健食品中的应用。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,步骤(a)具体包括步骤:
(a-1)将壳聚糖加入到乙酸水溶液中,加热搅拌充分溶解,然后调节pH至6,得到溶液A;
(a-2)将溶液A与磷酸钾缓冲溶液混匀,得到溶液B;
(a-3)向溶液B中加入肉桂酸,搅拌均匀得到溶液C;
(a-4)向溶液C中加入辣根过氧化物酶,然后分批加入过氧化氢水溶液,充分进行接枝反应,得到混合液D;
(a-5)将混合液D离心分离取沉淀物,即得所述肉桂酸接枝壳聚糖。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法,其特征在于,步骤(b)具体包括步骤:
(b-1)将所述肉桂酸接枝壳聚糖加入到去离子水中,用乙酸调节pH至1.8使所述肉桂酸接枝壳聚糖完全溶解,得到溶液E;
(b-2)将硫辛酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于无水乙醇后,加入到去离子水中,再用乙酸调节pH至4,60℃加热得到溶液F;
(b-3)将溶液F逐滴加入到已加热至80℃的溶液E中,充分反应得到溶液G;
(b-4)向溶液G中逐滴加入无水乙醇,产生沉淀,离心收集沉淀产物;
(b-5)将所述沉淀产物在连续蒸馏水中透析后,干燥即得所述肉桂酸、硫辛酸共接枝壳聚糖。
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