CN113201526B - 一种双功能光酶协同催化剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双功能光酶协同催化剂及其制备方法与应用，该双功能光酶协同催化剂的制备方法是利用不稳定配体通过配体交换来修饰金属有机骨架材料，然后通过热处理过程除去不稳定配体得到中孔金属有机骨架材料，接着利用光催化剂通过配体交换来修饰中孔金属有机骨架材料，得到具有光催化性能的中孔金属有机骨架材料；然后将脂肪酶包裹在具有光催化性能的中孔金属有机骨架材料内部。所述双功能光酶协同催化剂可用于催化2‑芳基吲哚及其衍生物与酮类化合物的不对称光酶协同反应。本发明的双功能光酶协同催化剂具有非均相性，即具有光催化性又具有酶催化性，同时提高了酶的催化效率。

Description

一种双功能光酶协同催化剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种双功能光酶协同催化剂及其制备方法和应用，属于光催化和生物催化技术领域。
背景技术
当前，面对日益严重的能源短缺和环境污染等问题，新技术和高效过程被认为是解决环境问题的有效手段。作为绿色化学的关键因素，提高催化效率受到了广泛的关注。协同催化是一种高效、环保、可持续的化学合成策略，反应底物可以同时被不同的活性位点活化，使反应能垒显著降低，从而提高反应效率和选择性。协同催化剂具有两个及以上不同的活性位点，现已广泛应用于光催化、有机催化、电催化和酶催化等。在光酶协同催化体系中，同时存在光反应活性和酶的对映体选择性位点，将光催化和酶催化相结合可以实现不对称有机合成。
酶是由氨基酸的线性序列组成的生物大分子催化剂，具有出色的催化效率、化学对映体和区域选择性，因此可作为有机合成中可生物降解的绿色生物催化剂。当前，酶在食品、医药和精细化学品行业中有着重要作用，工业流程的优化处理使得酶可以催化促进生物可再生能源、聚合物、以及各类化学。在迅速发展的现代生物技术中，多功能脂肪水解酶起着重要的作用，不仅可以在温和的反应条件下使用，而且可以利用多种底物。
然而，由于酶在有机介质中的稳定性差，缺乏长期稳定性以及回收利用等方面的困难，使酶在工业上的广泛应用受到了限制。此外，脂肪酶和可见光光催化剂的协同催化反应的发展仍处于起步阶段。大多数反应通常在有机溶剂进行，这可能导致二者的活性有不同程度的损失，而且这种损失是不可逆的。除此之外，光酶协同催化反应通常是在均相中进行，催化剂几乎不具有可回收性，当反应需要高温下进行时，酶面临着失活乃至变性的风险。
作为促进酶工业化应用的一种解决方案，将酶固定在固体载体上受到了广泛的关注。设计固体支持物可以提高酶的稳定性和可回收性，从而降低生产成本，提高工业价值。迄今为止，研究人员开发出各种提高酶稳定性的策略，并且部分已经成功地应用在商业领域。目前，金属有机骨架(MOF)材料作为固体支持物进行了酶的固定化研究。
现阶段，已开发出多种酶在MOF上的固定化策略，例如表面吸附和共价锚定已被证明可以改善酶在恶劣的化学条件下的稳定性，然而由于酶被固定在MOF的表面，所以基本上不受MOF的保护。其他策略如共沉淀和生物矿化，酶分子和MOF前体在溶剂热步骤中结合，同时进行晶体生长和酶的包裹过程，然而酶分子在复合晶体中的不均匀分布，很难探究每个酶分子周围的直接环境。因此，通过酶在MOF中的后合成扩散的固定化策略，最明显的好处是最明显的好处是对酶失活及变性的物理抑制，即防止酶在加热、脱水或溶液离子强度发生变化时而发生的变性。若酶的大小和MOF孔之间相匹配，封装也可以防止酶的浸出。此外，MOF可用来构建有机催化和光催化的活性中心。常见的可见光光催化剂主要是由Ru(Ⅱ)、Ir(Ⅲ)过渡金属与小分子如联吡啶(bpy)等络合而成，而基于Ru(Ⅱ)的分子催化剂也可以其引入MOF结构中并显示出催化活性。MOF还可将活性客体引入孔或笼等结构，同时允许底物进入内部活性位点，不仅可以满足实际的催化应用，还可以赋予MOF更高的性能。
在现有均相技术体系中，有机体系和生物体系通常同时使用酸和碱催化剂来催化反应。同时含有酸性和碱性催化中心的单一均相体系的开发引入了一个问题，即均相体系中的酸性组分和碱性组分相互中和，从而抑制了催化剂的活性。然而在非均相体系中，通过将不同的催化活性位固定在一个底物上，不仅保持了独立的功能，同时允许在一个反应序列中的一个或多个步骤的合作或独立的催化。固定一个酸性和碱性催化位阻止两个催化剂物理相互作用和中和对方最终保持多功能催化剂的活性。MOF材料的独特空间结构及规则排列为通过MOF构筑非均相多功能催化剂提供了机会。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了一种双功能光酶协同催化剂，本发明的第二目的是提供一种该双功能光酶协同催化剂的制备方法，本发明的第三目的是提供该双功能光酶协同催化剂在不对称光酶协同反应中的应用。
技术方案：本发明所述的一种双功能的光酶协同催化剂，所述双功能的光酶协同催化剂为内部包裹脂肪酶的金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH为二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌键合在正八面体HP-UiO-67-GH的任意一条或多条棱上，所述正八面体HP-UiO-67-GH为中孔的UiO-67-GH结构，所述中孔的平均孔径为8～12nm。
进一步地，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH粒子的平均粒径为500～3000nm，粒子的粒径为正八面体对角之间的距离。所述正八面体HP-UiO-67-GH中的HP代表中孔。
进一步地，所述脂肪酶为猪胰腺脂肪酶、小麦胚芽脂肪酶或米赫毛霉脂肪酶。
进一步地，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH骨架上Ru元素含量为0.5～1.0μmol·mg-1，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH包裹脂肪酶的含量为1～2mg·mg-1。
进一步地，所述猪胰腺脂肪酶尺寸为8nm×8nm×25nm。
本发明所述的一种双功能光酶协同催化剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用ZrCl4和配体4,4′-联苯二甲酸和冰醋酸制备UiO-67；
(2)利用UiO-67和配体bpdc-[NO2]2制备UiO-67-GH，并将其真空活化，经热处理得到中孔结构HP-UiO-67-GH；
(3)利用中孔结构HP-UiO-67-GH和配体Ru(II)配合物制备金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH，并将其真空活化；
(4)将脂肪酶包裹于经活化过的金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH内部，制得双功能光酶协同催化剂。
进一步地，步骤(3)中包括以下步骤：
(3.1)将中孔结构HP-UiO-67-GH和配体Ru(II)配合物溶于DMF中，超声处理，得到混合物；
(3.2)将混合物置于高压反应釜中，在烘箱中反应，产物经离心分离后，分别用DMF和丙酮进行洗涤，得到金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH；
(3.3)将金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH用丙酮浸泡，真空活化；
进一步地，步骤(3.1)中，所述中孔结构HP-UiO-67-GH与配体Ru(II)配合物的质量比为4:1～12:1。
进一步地，步骤(4)中包括以下步骤：
将脂肪酶溶于水中得到脂肪酶溶液，在脂肪酶溶液中加入金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH，在室温下静置，产物经离心分离，用水洗涤，冷冻干燥得到双功能光酶协同催化剂。
进一步地，所述脂肪酶与金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH的质量比为2.5:1～5:1。
本发明所述的一种双功能光酶协同催化剂在2-芳基吲哚及其衍生物与酮类化合物的不对称光酶协同反应的应用。
进一步地，所述2-芳基吲哚及其衍生物为2-苯基吲哚、5-溴-2-苯基-1H-吲哚、5-甲基-2-苯基-1H-吲哚、5-甲氧基-2-苯基-1H-吲哚、1-甲基-2-苯基-1H-吲哚或1-氯-2-苯基-1H-吲哚，所述酮类化合物为丙酮或2-丁酮。
进一步地，所述的一种双功能光酶协同催化剂在2-芳基吲哚及其衍生物与酮类化合物的不对称光酶协同反应的应用，包括以下步骤：
(1)将2-芳基吲哚及其衍生物和双功能的光酶协同催化剂混合，再加入酮类化合物和乙醇；
(2)在室温和O2氛围下，用白光灯照射反应；
(3)采用薄层色谱法对反应进行监测，反应完成后过滤，滤液在真空条件下浓缩，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，用柱色谱法对残留物进行纯化，得到催化产物。
进一步地，步骤(1)中，所述2-芳基吲哚及其衍生物与双功能的光酶协同催化剂的质量比为1.16:1～5.8:1，所述酮类化合物和乙醇的体积比为1.5:1～2.5:1，步骤(3)中，所述反应的时间为70～90h。
本发明所述双功能光酶协同催化剂在不对称光酶协同反应中的机理：Ru(II)配合物可作为光敏剂在可见光照射下被激发为Ru(II)自由基，在氧气的作用下完成光氧化还原催化循环，在这个过程中，底物2-苯基吲哚及其衍生物作为还原猝灭剂转化为2-苯基-3H-吲哚-3-酮及其衍生物。随后2-苯基-3H-吲哚-3-酮及其衍生物被中孔结构HP-UiO-67-GH内脂肪酶的活性中心活化，形成质子化亚胺中间体，底物2-苯基吲哚及其衍生物和酮类化合物在脂肪酶的活性中心作用下形成具有烯醇基的丙酮阴离子。最后，具有烯醇基的丙酮阴离子攻击质子化亚胺中间体得到不对称光酶协同产物。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
(1)本发明合成的中孔UiO-67的平均孔径与脂肪酶的尺寸相匹配，解决了固定化及后续反应过程中酶的浸出问题，减少了酶活性的损失。
(2)本发明用Ru(II)配合物修饰中孔UiO-67，使中孔UiO-67结合了光催化位点，具有了可见光光催化剂的性质，解决了光催化剂在有机溶剂中活性损失的问题。
(3)本发明所制备的双功能光酶协同催化剂在不对称光酶协同反应中具有良好的催化活性。
(4)本发明所制备的双功能光酶协同催化剂具有非均相性，解决了均相反应体系产率低的问题，提高了不对称光酶协同反应的效率。
附图说明
图1为双功能光酶协同催化剂结构示意图；
图2为UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH粉末X射线衍射图；
图3为UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH扫描电镜图；
图4为Ru-HP-UiO-67-GH的粉末X射线能谱图；
图5为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的粉末X射线衍射图；
图6为Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的N2吸附-脱附等温线图；
图7为Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的孔径分布图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
1、制备配体2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二甲酸(bpdc-[NO2]2)
(1)将5.00g(18.5mmol)的(1,1’-联苯)-4,4’-二羧酸二甲酯加入50mL浓硫酸溶液中混合，混合物在室温下搅拌5min，得到第一种混合物。将3mL硝酸加入6mL浓硫酸中混合，然后将硝酸和浓硫酸的混合溶液滴加到第一种混合物中，在室温下滴加持续约15min，得到第二混合物。第二混合物在室温下搅拌1.5h，然后倒入冰中有米黄色的固体生成。
(2)通过真空过滤收集米黄色固体，用水洗涤米黄色固体，得到米黄色固体产物为2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二羧酸二甲酯，其结构式如下：
(3)将2.00g(5.6mmol)的2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二羧酸二甲酯溶于50mL四氢呋喃和50mL4％KOH中混合。混合物被加热到60℃，过夜。冷却后分液，水层用浓盐酸酸化，得到白色固体产物。通过真空过滤收集白色固体，用水洗涤白色固体，得到不稳地配体2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二甲酸(bpdc-[NO2]2)，其结构式如下：
2、制备二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌([Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2)
(1)将160mg(0.33mmol)化合物cis-双(2,2-二吡啶)二氯化钌(II)和101mg(0.42mmol)2,2'-联吡啶-5,5'-二羧酸加入20mL到乙醇和水的混合溶液(V/V＝1:1)中混合，混合物在N2下回流12h后浓缩得到固体。固体用20mL甲醇和***的混合溶液(V/V＝1:9)重结晶，得到Ru(II)配合物为二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌([Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2)，其结构式如下：
3、合成UiO-67
称取67mg的ZrCl4、90mg的4,4′-联苯二甲酸(H2bpdc)和3.0mL的冰醋酸溶于DMF(15mL)中，混合物经超声处理30min后，将混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120℃烘箱中反应24h。产物经冷却至室温后，离心分离纯化，分别用DMF和丙酮(3×10mL)进行清洗，得到UiO-67。
4、合成UiO-67-GH
称取120mg的UiO-67、60mg的配体bpdc-[NO2]2溶于DMF(20mL)中。超声处理30min后，将混合物置于50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120℃烘箱中反应24h。配体交换后，离心分离产物，分别用DMF和丙酮(3×10mL)进行洗涤。然后在150℃的真空条件下干燥12h活化，除去溶剂，得到活化后的UiO-67-GH。
5、合成HP-UiO-67-GH
将活化后的UiO-67-GH(约120mg)置于管式炉中，在420℃的氩气氛中加热30min。冷却至室温后，得到产物HP-UiO-67-GH，将其置于150℃的真空条件下再次活化12h，得到活化后的HP-UiO-67-GH。
6、制备Ru-HP-UiO-67-GH
称取120mg活化后的HP-UiO-67-GH和30mg的配体[Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2溶于DMF(20mL)中。超声处理30min后，将混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120℃烘箱中反应24h。产物经离心分离后，分别用DMF和丙酮(3×10mL)进行洗涤得到Ru-HP-UiO-67-GH，然后用丙酮浸泡3天，在120℃动态真空下活化24h，得到活化后的Ru-HP-UiO-67-GH。
7、制备PPL@Ru-HP-UiO-67-GH
称取50mg的猪胰腺脂肪酶PPL(阿拉丁，货号9001-62-1)溶于10mL去离子水中，得到5mg/mL的脂肪酶溶液。然后在溶液中加入20mg活化后的Ru-HP-UiO-67-GH。混合物在室温下静置2h。然后，产物经离心分离，用蒸馏水洗涤3次。最后采用冷冻干燥法干燥获得产物PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，结构示意图如图1所示。
实施例2制备PPL@Ru-HP-UiO-67-GH
1、配体2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二甲酸(bpdc-[NO2]2)、二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌([Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2)、UiO-67、UiO-67-GH和HP-UiO-67-GH的制备同实施例1.
2、制备Ru-HP-UiO-67-GH
称取120mg活化后的HP-UiO-67-GH和10mg的配体[Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2溶于DMF(20mL)中。超声处理30min后，将混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，在120℃烘箱中反应24h。产物经离心分离后，分别用DMF和丙酮(3×10mL)进行洗涤得到Ru-HP-UiO-67-GH，然后用丙酮浸泡3天，在120℃动态真空下活化24h，得到活化后的Ru-HP-UiO-67-GH。
3、制备PPL@Ru-HP-UiO-67-GH
称取50mg的猪胰腺脂肪酶PPL(来自阿拉丁，货号9001-62-1)溶于10mL去离子水中，得到5mg/mL的脂肪酶溶液。然后在溶液中加入20mg活化后的Ru-HP-UiO-67-GH。混合物在室温下静置2h。然后，产物经离心分离，用蒸馏水洗涤3次。最后采用冷冻干燥法干燥获得产物PPL@Ru-HP-UiO-67-GH。
实施例3制备PPL@Ru-HP-UiO-67-GH
1、配体2,2’-二硝基-(1,1’-联苯基)-4,4’-二甲酸(bpdc-[NO2]2)、二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌([Ru(bpy)2(5,5’-dcbpy)]Cl2)、UiO-67、UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH和Ru-HP-UiO-67-GH的制备同实施例1.
2、制备PPL@Ru-HP-UiO-67-GH
称取100mg的猪胰腺脂肪酶PPL(阿拉丁，货号9001-62-1)溶于10mL去离子水中，得到10mg/mL的脂肪酶溶液。然后在溶液中加入20mg活化后的Ru-HP-UiO-67-GH。混合物在室温下静置2h。然后，产物经离心分离，用蒸馏水洗涤3次。最后采用冷冻干燥法干燥获得产物PPL@Ru-HP-UiO-67-GH。
实施例4金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH骨架上Ru元素含量测定
将实施例1得到金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP)测试骨架上Ru元素含量，实施例1得到金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH骨架上Ru元素含量为0.5μmol·mg-1。
实施例5金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH包裹脂肪酶的含量测定
将实施例1得到产物PPL@Ru-HP-UiO-67-GH用酶标仪测定其脂肪酶的含量。在595nm处的吸光度值，在5mL考马斯亮蓝溶液中加入100μL残酶液和900μL去离子水。显色几分钟后测定上清液在595nm处的吸光度值，与标准酶含量做对比，实施例1得到得到金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH包裹脂肪酶的含量为1.45mg·mg-1。
实施例6对UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行粉末X射线衍射
对实施例1中得到的UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行粉末X射线衍射，结果如图2所示，图2为UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH粉末X射线衍射图，其中Simulated所示曲线为UiO-67粉末X射线衍射模拟结果。由图2可知，在2θ为5-10°区间，UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH均出现了UiO-67结构的特征峰，表明所制备的UiO-67-GH具有优异的结晶度，HP-UiO-67-GH其在热处理配体去除过程中保持了结晶度，Ru-HP-UiO-67-GH结晶度得到了保持，PPL@Ru-HP-UiO-67-GH在酶固定化过程中其结晶度得到了保持。
实施例7对UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行电子显微镜扫描
对实施例1中得到的UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行电子显微镜扫描，结果如图3所示。图3为UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH扫描电镜图，其中a为UiO-67-GH，b为HP-UiO-67-GH，c为Ru-HP-UiO-67-GH，d为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH。由图3可知，UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH均显示了结构完整的八面体或近八面体形态，UiO-67-GH、HP-UiO-67-GH、Ru-HP-UiO-67-GH及PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的粒子平均粒径分别为1000nm、1000nm、1000nm、2000nm，实验过程中未出现坍塌的情况，立体结构得以保持。
实施例8Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行粉末X射线能谱分析
将实施例1中得到的Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH进行X射线能谱分析，Ru-HP-UiO-67-GH的X射线能谱分析图像如图4所示。图4为Ru-HP-UiO-67-GH的粉末X射线能谱图，其中，a为Ru-HP-UiO-67-GH能谱分析区域，b为Ru-HP-UiO-67-GH中的Zr元素，c为Ru-HP-UiO-67-GH中的O元素，d为Ru-HP-UiO-67-GH中的Ru元素。由图4可知，在Ru-HP-UiO-67-GH存在的区域，图4b中显示的锆元素和图4d中显示的钌元素在固体表面分散良好，表明改性后的具有均匀的结构和化学性能，也说明Ru配合物作为配体成功交换至骨结构上，而不是单纯的进入Ru-HP-UiO-67-GH的孔内。PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的粉末X射线衍射图谱如图5所示。图5为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的粉末X射线衍射图，其中，a为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH能谱分析区域，b为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH中的Zr元素，c为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH中的O元素，d为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH中的Ru元素，e为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH中的S元素。由图5可知，图5b和图5c中显示的Zr元素和O元素为PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的骨架结构的存在，图5d中Ru元素的均匀分布，证明了Ru配合物作为配体成功与4,4-联苯二甲酸交换，而且在脂肪酶固定化后并没有Ru配合物的浸出。图5e中S元素的均匀分布，证明了脂肪酶成功进行了固定化。
实施例9Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的氮气吸附-脱附测试
对实施例1中得到的固定化酶前后样品Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的氮气吸附-脱附测试，结果分别如表1、图6和图7所示。
表1固定化酶前后样品的氮气吸附-脱附测试结果
由表1可知，在脂肪酶PPL固定化后，复合材料PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的N2吸收能力明显低于支持材料Ru-HP-UiO-67-GH，Brunauer-Emmet-Teller(BET)比表面积从294.0降至34.8m2/g，孔体积从0.119633降低至0.014540cm3/g，证明脂肪酶进入了Ru-HP-UiO-67-GH的孔结构内。
图6为Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的N2吸附-脱附等温线图，由图6可知，Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH均表现出典型的IV型等温线，这表明固定化前样品Ru-HP-UiO-67-GH中存在中孔结构，固定化后PPL@Ru-HP-UiO-67-GH可能存在没有包封脂肪酶的孔结构，导致其表现出IV型等温线。
图7为Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的孔径分布图，由图7可知，Ru-HP-UiO-67-GH在10nm处存在明显的高峰，而PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的孔径分布图中，在10nm处的高峰消失，仅在1-2nm处有小峰出现，这表明在Ru-HP-UiO-67材料内存在中孔结构，且孔径为10nm，而PPL@Ru-HP-UiO-67-GH的中孔消失，仅微孔仍得以保持，表明PPL位于Ru-HP-UiO-67-GH的中孔结构内。
实施例10对不同2-芳基吲哚及其衍生物的不对称光酶协同反应
1、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
2、称取81.0mg的5-溴-2-苯基-1H-吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-5-溴-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有Chiralcel OD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
3、称取61.8mg的5-甲基-2-苯基-1H-吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-5-溴-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有Chiralcel OD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
4、称取66.6mg的5-甲氧基-2-苯基-1H-吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-5-甲氧基-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有Chiralcel OD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.值如表2所示。
5、称取61.8mg的1-甲基-2-苯基-1H-吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-(对甲苯基)吲哚-3-酮。采用具有Chiralcel OD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
6、称取67.8mg的1-氯-2-苯基-1H-吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(4-氯苯基)-2-(2-氧丙基)吲哚-3-酮。采用具有Chiralcel OD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
7、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2.4mL2-丁酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(3-氧丁酮-2-基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。其中，所用手性柱和液相条件以及所得产物的e.e.％值如表2所示。
表2不对称光酶协同反应的产物e.e.％值及其高效液相色谱条件
由表2可知，由于位置和电子性质的影响，使产物的e.e.％值表现出不同的结果。5-溴-2-苯基-1H-吲哚、1-氯-2-苯基-1H-吲哚具有吸电子基团，其催化产物(S)-5-溴-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮、(S)-2-(4-氯苯基)-2-(2-氧丙基)吲哚-3-酮的e.e.％值要高于催化5-甲基-2-苯基-1H-吲哚和5-甲氧基-2-苯基-1H-吲哚、1-甲基-2-苯基-1H-吲哚得到的产物。而2-苯基吲哚与2-丁酮反应得到的(S)-2-(4-氯苯基)-2-(2-氧丙基)吲哚-3-酮，因其空间位阻较大，导致其e.e.％值较低。由此可以证明，该双功能光酶协同催化剂对不对称光酶协同反应具有一定的适用范围。
实施例11不同实验条件下不对称光酶协同反应对比实验
1、本试验方法：称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
2、未包裹脂肪酶实验：称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
3、未键合称Ru元素实验：取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
4、N2代替O2实验：称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和N2氛围(N2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
5、空气代替O2实验：称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和空气氛围下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
6、黑暗条件下实验：称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其结果如表3所示。
表3不同条件下不对称光酶协同反应的产物情况
No. 条件变化 产率/％ e.e./％
1 PPL@Ru-HP-UiO-67-GH 27 93
2 Ru-HP-UiO-67-GH代替PPL@Ru-HP-UiO-67-GH N.R. --
3 PPL@HP-UiO-67-GHPPL@Ru-HP-UiO-67-GH N.R. --
4 N2替代O2 N.R. --
5 空气替代O2 trace --
6 黑暗条件下 N.R. --
由表3可知，不改变反应条件时，产物的产率为27％，e.e.％值为93％。在Ru-HP-UiO-67-GH和PPL@HP-UiO-67-GH作为催化剂，即没有脂肪酶PPL或Ru配合物存在的情况下，没有观察到反应的发生。反应在N2氛围下进行时，没有检测到产物，当反应在空气氛围下进行时，只得到微量的产物，而反应在黑暗中进行时，同样没有检测到产物。以上表明，可见光的照射、光催化剂、脂肪酶PPL和O2对不对称光酶协同反应起着至关重要的作用。
实施例12对2-苯基吲哚与丙酮的不对称光酶协同反应
1、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和10mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其e.e.％值为46％。产率为5％。
2、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和50mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其e.e.％值为34％。产率为14％。
3、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入1.5mL丙酮(20mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其e.e.％值为78％。产率为19％。
4、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2.5mL丙酮(34mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其e.e.％值为38％。产率为25％。
5、称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)和20mg的PPL@Ru-HP-UiO-67-GH，加入2mL丙酮(34mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应90h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，通过过滤从反应混合物中除去催化剂，有机相在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值，其e.e.％值为56％。产率为28％。
对比例1与现有技术不对称光酶协同反应对比实验
按照现有技术，称取58.0mg的2-苯基吲哚(0.3mmol，1.0eq)，29mg的PPL，5mg的Ru(bpy)3Cl2·6H2O，加入2mL丙酮(27mmol)和1mL乙醇，在室温和O2氛围(O2气球)下，用36W荧光灯照射反应70h。采用薄层色谱法对反应进行监测。反应完成后，加入10mL乙酸乙酯，用水洗涤。有机相在无水Na2SO4上干燥，过滤后在真空条件下浓缩。以石油醚/乙酸乙酯(20:1-5:1)为洗脱剂，用柱色谱法在硅胶上对残留物进行纯化，得到催化产物。采用具有ChiralpakAD-H色谱柱的高效液相色谱测定e.e.％值。同实施例1中产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮的产率和e.e.％值相比较，结果如表4所示。
表4均相、非均相的不对称光酶协同反应产物的情况对比
名称 反应体系 产率/％ e.e./％
实施例1 非均相 27 93
对比例1 均相 9 97
由表4可知，PPL@Ru-HP-UiO-67-GH催化的非均相反应，其产物(S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮的产率为27％，而脂肪酶和Ru(bpy)3Cl2·6H2O共同催化的均相反应，其产率仅为9％。此外，非均相反应产物的e.e.％值为93％，与均相反应相类似。结果表明，固定化酶PPL@Ru-HP-UiO-67-GH可同时起到可见光光催化剂和酶催化剂的双重作用。

Claims (3)

1.一种双功能的光酶协同催化剂，其特征在于，所述双功能的光酶协同催化剂为内部包裹猪胰腺脂肪酶的金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH为二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌键合在正八面体HP-UiO-67-GH的任意一条或多条棱上，所述正八面体HP-UiO-67-GH为中孔的UiO-67-GH结构，所述中孔的平均孔径为8~12 nm，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH骨架上Ru元素含量为0.5μmol·mg-1，所述金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH包裹猪胰腺脂肪酶的含量为1.45 mg·mg−1。
2.权利要求1所述的一种双功能光酶协同催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用ZrCl4和配体4,4′-联苯二甲酸和冰醋酸制备UiO-67；
（2）利用UiO-67和配体bpdc-[NO2]2在120℃烘箱中反应24h 进行配体交换，用DMF 和丙酮(3×10mL)进行洗涤。然后在150℃的真空条件下干燥12h 活化，除去溶剂，得到UiO-67-GH，，在420℃的氩气氛中加热30min，冷却，再于150℃的真空条件下再次活化12h，得到中孔结构HP-UiO-67-GH；
（3）利用中孔结构HP-UiO-67-GH和二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌溶于DMF 中，在120℃烘箱中反应24h，用DMF 和丙酮(3×10mL)进行洗涤得到Ru-HP-UiO-67-GH，然后用丙酮浸泡3 天，在120℃动态真空下活化24h，得到活化后的Ru-HP-UiO-67-GH，所述中孔结构HP-UiO-67-GH与二(2,2’-联吡啶)-(5,5’-二羧基-2,2’-联吡啶)氯化钌的质量比为4 : 1；
（4）将猪胰腺脂肪酶包裹于经活化过的金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH内部，制得双功能光酶协同催化剂，所述猪胰腺脂肪酶与金属有机骨架材料Ru-HP-UiO-67-GH的质量比为2.5: 1。
3.权利要求1所述的一种双功能光酶协同催化剂在2-芳基吲哚及其衍生物与酮类化合物的不对称光酶协同反应中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将2-芳基吲哚及其衍生物和双功能的光酶协同催化剂混合，再加入酮类化合物和乙醇，所述2-芳基吲哚及其衍生物与双功能的光酶协同催化剂的质量比为1.16 : 1~5.8 :1，所述酮类化合物和乙醇的体积比为1.5 : 1 ~ 2.5 : 1；
（2）在室温和O2氛围下，用36W 荧光灯照射反应70h；
（3）采用薄层色谱法对反应进行监测，反应完成后过滤，滤液在真空条件下浓缩，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，用柱色谱法对残留物进行纯化，得到催化产物，所述反应的时间为70 ~ 90 h；
所述2-芳基吲哚及其衍生物为2-苯基吲哚、5-溴-2-苯基-1H-吲哚、5-甲基-2-苯基-1H-吲哚、5-甲氧基-2-苯基-1H-吲哚、1-甲基-2-苯基-1H-吲哚或1-氯-2-苯基-1H-吲哚，所述酮类化合物为丙酮或2-丁酮，
所述酮类化合物为丙酮，所述2-芳基吲哚及其衍生物为2-苯基吲哚、5-溴-2-苯基-1H-吲哚、5-甲基-2-苯基-1H-吲哚、5-甲氧基-2-苯基-1H-吲哚、1-甲基-2-苯基-1H-吲哚或1-氯-2-苯基-1H-吲哚时，得到的催化产物分别为 (S)-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮、(S)-5-溴-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮、 (S)-5-溴-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮、(S)-5-甲氧基-2-(2-氧丙基)-2-苯基吲哚-3-酮、 (S)-2-(2-氧丙基)-2-(对甲苯基)吲哚-3-酮、 (S)-2-(4-氯苯基)-2-(2-氧丙基)吲哚-3-酮；
所述酮类化合物为2-丁酮，所述2-芳基吲哚及其衍生物为2-苯基吲哚时，得到的催化产物为(S)-2-(3-氧丁酮-2-基)-2-苯基吲哚-3-酮。
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