CN113185580A - 一种黄花蒿内生真菌来源的环肽化合物及其作为抗肿瘤药物的应用 - Google Patents
一种黄花蒿内生真菌来源的环肽化合物及其作为抗肿瘤药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种黄花蒿内生真菌来源的环肽化合物及其作为抗肿瘤药物的应用。所述环肽化合物具有式I所述结构：
Description
技术领域
本发明属于天然产物领域，具体涉及一种黄花蒿内生真菌来源的环肽化合物及其作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
癌症是一个重大公共卫生问题，已成为全球第二大死亡原因，仅次于心脑血管疾病。自20世纪40年代，临床上应用第一个抗肿瘤药物--氮芥成功治疗恶性淋巴瘤以来，化学抗肿瘤药物的研究已取得巨大的发展，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的实体瘤还缺乏有效治疗药物。耐药性和恶性肿瘤侵袭/转移是当前化疗药物面临的重大挑战，越来越多的研究致力于开发新颖的化疗药物。尽管现代组合化学与高通量药物筛选技术交叉结合加快了抗肿瘤新药的研制，但从天然产物中寻找抗肿瘤活性先导化合物仍然是发现新药的主要途径。
与非选择性地同时抑制正常和肿瘤组织细胞生长的传统小分子化疗药物相比，天然肽类化合物具有无可比拟的性质：其通常含有5～50个氨基酸残基，易于化学合成和修饰；一些选择性活性肽常表现出最小的脱靶效应；天然活性肽常见多靶点作用机制，能抵抗某些方式的耐药性。天然肽类化合物已成为化疗药物的新兴来源，在临床中表现出抗耐药和广谱抗肿瘤活性的优势。一些活性肽化合物及其衍生物因其显著的抗肿瘤作用进入临床试验，而Polatuzumab、Plitidepsin等的成功上市预示着将有更多活性肽化合物成为有效化疗药物或药物先导物。
发明内容
本发明提供一种式I结构的环肽化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于式I结构如下：
本发明的另一实施方案提供一种制备上述式I化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将真菌Myrothecium roridum IFB-E091接入PD培养基中，于28℃、140rpm摇床培养5-7天，得种子液；
(2)将步骤(1)培养的真菌Myrothecium roridum IFB-E091进行发酵培养；将步骤(1)得到的种子液接种于固体发酵培养基中，于28-30℃静置培养28-30天，得固体发酵产物；
(3)将步骤(2)得到的固体发酵产物粉碎阴干后用体积比1:1的氯仿/甲醇混合溶剂浸提2-3次，合并浸提液后减压浓缩得到发酵产物浸膏；
(4)步骤(3)得到的发酵产物浸膏经色谱分离即得式I化合物。
步骤(1)所述PD培养基的制备方法为：去皮马铃薯200g，切碎成丁，加水煮沸30min，以纱布滤去残渣，滤液加水补足至1000mL，加20g葡萄糖溶解，分装，121℃灭菌20min，备用；培养条件为：旋转式摇床，28℃，140rpm，培养5-7天。
步骤(2)所述固体发酵培养基的配方为：15mL水、7.5g小米、7.5g麸皮、0.5g酵母膏、0.1g酒石酸钠、0.1g谷氨酸钠、0.01g绿矾和0.1mL玉米油。
步骤(4)中所述色谱分离为本领域常规的色谱分离方法，优选正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC制备中的一种或几种组合。此处所述一种或几种组合，包括同一分离手段的重复使用。所述色谱分离进一步优选将发酵产物浸膏先经正相硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱(v/v 100:0→0:100)，得到8个极性组分Fr.1～Fr.8；其中Fr.5组分再经正相硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱(v/v 100:0→100:30)得到6个组分Fr.5-1～Fr.5-6；其中Fr.5-3组分经HPLC制备即得式I化合物。其中HPLC制备条件为：HITACHIPrimaide高效液相色谱仪，Sinochrom ODS-AP液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，波长254nm，流动相为甲醇:水(v/v)＝85:15,流速为1mL/min。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物中的应用。尤其是在制备抗胃癌药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制人胃癌细胞株SGC-7901、AGS或MGC-803药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制SGC-7901细胞迁移药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物先导化合物中的应用。尤其是在制备抗胃癌药物先导化合物中的应用。
本发明的另一实施方案提供上述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物候选药物中的应用。尤其是在制备抗胃癌药物候选药物中的应用。
本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述式I化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物组合物还包括药学上可接受的辅料，其剂型优选固体制剂、液体制剂或半固体制剂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明式I化合物为新环十肽化合物，由申请人首次从黄花蒿Artemisia annua(Asteraceae)内生真菌Myrothecium roridum IFB-E091中分离获得，其表现出极强的抗肿瘤活性(SGC-7901、AGS或MGC-803)，有望开发用于制备抗胃癌药物。
附图说明
图1是式I化合物对SGC-7901细胞细胞周期的影响图；
图2是式I化合物对SGC-7901细胞凋亡率的影响图；
图3是体外细胞划痕实验观察式I化合物对SGC-7901细胞迁移能力的影响图(100×)；
图4是Transwell体外迁移实验观察式I化合物对SGC-7901细胞迁移能力的影响图(100×)；
图5是式I化合物的1H-NMR谱图(CDCl3，600MHz)；
图6是式I化合物的13C-NMR谱图(CDCl3，150MHz)；
图7是式I化合物的HSQC谱图；
图8是式I化合物的HMBC谱图；
图9是式I化合物的1H-1H COSY谱图。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好地理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1黄花蒿内生真菌Myrothecium roridum IFB-E091的分离与鉴定
菌株IFB-E091是2006年7月采自江苏南京郊外的健康黄花蒿Artemisia annua(Asteraceae)根部分离获得的一株内生真菌，其分离纯化按照常规方法进行，例如可按照如下步骤：
将新鲜的植株样本用自来水长时间冲洗，洗净表面的灰尘污物，稍晾干后叶片切成1cm2小块；根与茎切成1cm左右的小段，两端均需有切口。在超净工作台把上述叶片和根茎段依次浸泡于75％酒精1min，1％次氯酸钠溶液(含游离氯>2.5％)10～15min，75％酒精再1min进行表面消毒，然后以无菌水浸洗3次后在无菌滤纸上吸干水分，无菌条件下用镊子放置于分离平板表面，轻压，每皿放4片(或段)，按来源依次编号，将培养皿倒置于28℃培养箱中培养，逐日观察。待菌丝从植物材料切口内长出至培养基上后，及时以接种针小心地挑取菌落边缘的尖端菌丝(连同小块培养基)转至新鲜平板，顺序编号记录，继续进行分离。根据菌落形态、颜色差异和长出时间不同，用接种针挑取各平板上菌落边缘米粒大小的琼脂块，转移至新鲜培养基上培养，重复操作直至获得纯菌落。
根据菌株IFB-E091形态学特征和18S rDNA序列比较(Genbank accessionNo.GU074399)，鉴定其为Myrothecium roridum(Planta Medica,2010,76(10):1004-1006)。公众可按照本实施例中记载的分离鉴定方法或相关研究论文中记载的方法获得本发明所述“黄花蒿内生真菌Myrothecium roridum IFB-E091”。
实施例2式I化合物的分离鉴定
(1)黄花蒿内生真菌Myrothecium roridum IFB-E091的培养
首先将真菌Myrothecium roridum IFB-E091接入20个各装有400mL PD培养基(去皮马铃薯200g，切碎成丁，加水煮沸30min，以纱布滤去残渣，滤液加水补足至1000mL，加20g葡萄糖溶解，分装，121℃灭菌20min，备用)的1000mL锥形瓶中，于旋转式摇床(28℃、140rpm)振荡培养7天，得种子液。
(2)黄花蒿内生真菌Myrothecium roridum IFB-E091的发酵
将步骤(1)所得种子液接种于400个已灭菌的含固体培养基(15mL水、7.5g小米、7.5g麸皮、0.5g酵母膏、0.1g酒石酸钠、0.1g谷氨酸钠、0.01g绿矾和0.1mL玉米油)的250mL广口瓶中，每瓶15mL。然后静置于28℃的温室培养30天，得固体发酵产物。
(3)化合物的提取分离鉴定
将步骤(2)得到的固体发酵产物粉碎阴干后用氯仿/甲醇(1:1，v/v)混合溶剂浸提三次，减压去除溶剂得粗浸膏38g。粗浸膏经硅胶柱分离，氯仿/甲醇梯度洗脱(v/v 100:0→0:100)得到8个组分Fr.1～Fr.8。Fr.5再经硅胶柱分离，氯仿/甲醇梯度洗脱(v/v 100:0→100:30)得到6个组分Fr.5-1～Fr.5-6；其中Fr.5-3经HPLC制备，HITACHI Primaide高效液相色谱仪，Sinochrom ODS-AP液相色谱柱(4.6×250mm，5μm)，波长254nm，流动相为甲醇:水(v/v)＝85:15，流速为1mL/min，得到本发明式I化合物(20mg)。经结构确证(Marfey、LC-MS、HR-ESI-MS、一维、二维NMR等数据)，式I化合物结构如下：
式I化合物分子式：C54H82N10O12，白色粉末。高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)显示[M+Na]+1085.5995和[M-H]-1061.6024，确定其分子量为1062，分子式为C54H82N10O12。其1H-和13C-NMR谱数据见表1。
表1式I化合物的1H-和13C-NMR谱数据(AVANCE 600，CDCl3,δ：ppm，J：Hz)
*overlapped signal
本发明采用Marfey法确定式I化合物的立体构型，具体方法如下：
Marfey法与LC-MS分析：化合物(1mg)溶于2mL 6N盐酸，110℃加热20h，然后冷却至室温、减压去除溶剂。水解产物溶于500μL水，用200μL 2％1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alaninamide(FDAA)丙酮溶液(w/v)和100μL 1N碳酸氢钠处理。混合物40℃加热6h，冷却到室温，用1N盐酸(100μL)处理至中性，所得混合物加入1000μL乙腈，即得需要分析的样品。化合物水解产物FDAA衍生物和氨基酸对照品FDAA衍生物分别用Agilent TQ-MS进行LC-MS分析，Betasil C18液相色谱柱(150×4.6mm,5μm)，波长340nm，梯度洗脱(流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：10％-50％流动相B，洗脱时间75min)，流速0.5mL/min。
实验发现，LC-MS不能区分NMe-L-Ala与NMe-D-Ala的FDAA衍生物，因此，这两种氨基酸的衍生化采用改良marfey法，即用FDLA(1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-leuciamide)替代FDAA作为衍生化试剂。D,L-氨基酸对照品FDAA(或FDLA)衍生物的保留时间和式I化合物水解产物FDAA(或FDLA)衍生物的保留时间分别列于表2和表3中，分析表2和表3可知，式I化合物水解产物中的氨基酸全部是L-型，即式I化合物结构中的氨基酸皆是L-型氨基酸(甘氨酸无手性)。
表2氨基酸对照品衍生物的保留时间
*改良marfey法
表3式I化合物水解产物衍生物的保留时间
*改良marfey法
实施例3本发明式I化合物对人胃癌细胞株的增殖抑制作用
实验使用的人胃癌细胞株SGC-7901、AGS和MGC-803由上海生命科学研究院细胞库提供。采用MTT法测定式I化合物对这三株人胃癌细胞株的增殖抑制活性，阳性对照药为顺铂。将对数生长期细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；每孔中分别加入一定浓度的化合物及阳性对照药，阴性对照组和空白对照组分别加入100μL的培养基；培养48h后，每孔加入20μL MTT，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4h；吸出液体，每孔加入100μL DMSO溶解，微震10min，使用酶标仪于490nm波长处读取吸光度(OD)值。化合物对肿瘤细胞的增殖抑制率计算公式如下：
采用改良寇氏法计算化合物的半数抑制浓度(IC50)。
表4本发明式I化合物对人胃癌细胞株的增殖抑制活性
由表4可知，式I化合物对人胃癌细胞株SGC-7901、AGS和MGC-803均具有显著的增殖抑制作用，且与阳性对照药顺铂相当。
实施例4本发明式I化合物对SGC-7901细胞细胞周期的影响
采用流式细胞术分析式I化合物对SGC-7901细胞细胞周期的影响。调整对数生长期细胞浓度为1.0×106个/mL并接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养箱内培养24h；每孔分别加入一定浓度化合物干预48h。收集细胞后用预冷的70％乙醇4℃固定18h以上，2400rpm离心10min去上清，PBS洗两次，将细胞重悬于0.4mL含RNaseA的PI染液中，37℃孵育30min，400目网筛过滤后进行流式细胞仪分析，应用ModFit LT3.0软件分析细胞周期中各期细胞所占总细胞的百分率。
如图1所示，与对照组相比，式I化合物干预后，SGC-7901细胞的G1期细胞比例显著增加、且呈一定浓度依赖性；50μg/mL时，处理组细胞的G1期细胞比例为(59.06±8.62)％(P<0.05)，表明：式I化合物可诱导SGC-7901细胞G1期细胞周期阻滞；其对SGC-7901细胞的增殖抑制作用可能与其诱导细胞G1期周期阻滞相关。
实施例5本发明式I化合物对SGC-7901细胞的诱导凋亡作用
采用Annexin V-FITC/PI双染色法观察式I化合物对SGC-7901细胞凋亡的影响。调整对数生长期细胞浓度为1.0×106个/mL并接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，分别加入一定浓度化合物干预48h，收集细胞至1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，PBS洗涤两遍，弃上清，每管加入500μL 1×binding buffer重悬细胞；每管加入5μL FITC AnnexinV和5μL PI并混匀，避光室温孵育15min；流式细胞仪进行检测，应用FlowJo VX软件分析细胞凋亡率。
如图2所示，与对照组相比，式I化合物处理后细胞凋亡率明显上升，50μg/mL时，处理组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分别增加至(18.07±2.18)％(P<0.001)和(4.97±2.84)％，提示：式I化合物能剂量依赖性地促进SGC-7901细胞凋亡；其对SGC-7901细胞的增殖抑制作用可能与其诱导细胞凋亡作用相关。
实施例6本发明式I化合物抗SGC-7901细胞迁移作用
采用体外细胞划痕实验观察化合物对肿瘤细胞迁移能力的影响。预先用marker笔在6孔板底部画好十字线，调整对数生长期细胞浓度为1.0×106个/mL并接种于6孔板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，待显微镜下观察到单细胞层形成，采用10μL白色枪头尽量垂直marker笔标记的横线划痕细胞，PBS洗涤2～3次后，随后每孔分别加入一定浓度的化合物进行干预，分别在24h和48h时拍照记录化合物处理后细胞的情况。如图3所示，24h后，对照组划痕处细胞密度有所增加，划痕宽度明显减小、划痕一定程度愈合；48h后，对照组划痕处细胞密度进一步增加，划痕宽度显著减小、划痕将要愈合；与对照组相比，式I化合物处理24h和48h后，各浓度组划痕宽度基本没有明显变化，划痕愈合程度明显低于对照组。上述现象表明，式I化合物能显著抑制划痕愈合，降低SGC-7901细胞的迁移能力。
采用Transwell体外迁移实验进一步观察式I化合物对SGC-7901细胞迁移能力的影响。调整对数生长期细胞浓度为1.0×105个/mL并接种于transwell上室，待细胞贴壁后，上室的每孔分别加入一定浓度的化合物进行干预，下室加入600μL含20％FBS的培养基，继续放入37℃、5％CO2培养箱中培养48h，取出小室，棉签将上室底膜上的细胞擦洗干净，PBS洗涤2次，1～2min后，100％甲醇固定10min，吸去固定液，用PBS洗涤2～3次，结晶紫染色液染色10min，弃去结晶紫染色液，PBS洗涤2～3次，待上室自然风干后，100倍倒置显微镜下观察并拍照。如图4所示，与对照组相比，式I化合物处理48h后，20和50μg/mL浓度组过膜细胞数量明显下降，说明式I化合物能显著降低SGC-7901细胞的迁移能力。
Claims (10)
1.一种式I结构的环肽化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于式I结构如下：
2.一种制备权利要求1所述式I化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将真菌Myrothecium roridum IFB-E091接入PD培养基中，于28℃、140rpm摇床培养5-7天，得种子液；
(2)将步骤(1)培养的真菌Myrothecium roridum IFB-E091进行发酵培养；将步骤(1)得到的种子液接种于固体发酵培养基中，于28-30℃静置培养28-30天，得固体发酵产物；
(3)将步骤(2)得到的固体发酵产物粉碎阴干后用体积比1:1的氯仿/甲醇混合溶剂浸提2-3次，合并浸提液后减压浓缩得到发酵产物浸膏；
(4)步骤(3)得到的发酵产物浸膏经色谱分离即得式I化合物。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)所述PD培养基的制备方法为：去皮马铃薯200g，切碎成丁，加水煮沸30min，以纱布滤去残渣，滤液加水补足至1000mL，加20g葡萄糖溶解，分装，121℃灭菌20min，备用；培养条件为：旋转式摇床，28℃，140rpm，培养5-7天。
4.权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于步骤(2)所述固体发酵培养基的配方为：15mL水、7.5g小米、7.5g麸皮、0.5g酵母膏、0.1g酒石酸钠、0.1g谷氨酸钠、0.01g绿矾和0.1mL玉米油。
5.权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述色谱分离为正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、HPLC制备中的一种或几种组合。
6.权利要求1所述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗癌药物、先导化合物、候选药物中的应用。尤其是在制备抗胃癌药物中的应用。
7.权利要求1所述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制人胃癌细胞株SGC-7901、AGS或MGC-803药物中的应用。
8.权利要求1所述式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制SGC-7901细胞迁移药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以权利要求1所述式I化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。
10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
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| GR01 | Patent grant | ||
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