CN113181194A

CN113181194A - 二甲双胍与米诺环素联用在治疗鲍曼不动杆菌感染中的应用

Info

Publication number: CN113181194A
Application number: CN202110557949.1A
Authority: CN
Inventors: 郭停停; 孙晓利; 李国才
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2021-07-30
Also published as: AU2021103201A4

Abstract

本发明涉及二甲双胍与米诺环素联用在治疗鲍曼不动杆菌感染中的应用，具体为在制备预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用，还涉及用于预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的组合物及其应用。本发明首次验证发现二甲双胍可以破坏鲍曼不动杆菌的细菌外膜、增强其膜电位、增强其氧化应激反应从而辅助增加米诺环素的抗菌作用，且证实二甲双胍能够协同米诺环素发挥抗鲍曼不动杆菌的作用，减少米诺环素的用量，并可治疗米诺环素耐药鲍曼不动杆菌引发的感染。当二甲双胍和米诺环素联用时，超过50％的鲍曼不动杆菌在12h内被杀死，每毫升CFU在12h之后降低大于2log10，这证明二甲双胍可以协同米诺环素发挥抗菌作用。

Description

二甲双胍与米诺环素联用在治疗鲍曼不动杆菌感染中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及二甲双胍与米诺环素联用在治疗鲍曼不动杆菌感染中的应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一种专性需氧的非发酵革兰阴性杆菌，是医院内最常见的病原菌之一，对多种抗菌药物具有耐药性。鲍曼不动杆菌可引起严重感染，如呼吸机相关性肺炎(VAP)、血液、尿路和伤口感染，更令人担忧的是，这种微生物对多种抗菌剂产生抗药性的能力使得在某些临床条件下很难治疗，特别是在危重患者中。因此，目前只有几种抗生素被认为对治疗由鲍曼不动杆菌引起的感染有效。

四环素类药物，包括多西环素、米诺环素和替加环素等其他衍生物也不断进入临床应用，在治疗鲍曼不动杆菌感染方面显示出良好的临床和微生物学效果。这些四环素类药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有广谱抗菌活性。据报道，在71.9％的呼吸道感染和87.5％的血液感染中，四环素与其他抗生素联合使用成功，已成为治疗多药耐药鲍曼不动杆菌感染的重要选择，特别是由碳青霉烯耐药菌株引起的感染。根据最近的一项全球调查，鲍曼不动杆菌对米诺环素的敏感性一般保持良好。

由于抗生素的普遍应用及滥用，出现了越来越多的细菌耐药性，这对世界公众健康构成了严重威胁。研究发现新型抗生素佐剂能恢复现有抗生素效力、减少抗生素使用以及耐药性的发生并改善感染性疾病患者临床效果，这是对抗超级细菌的一种经济有效的策略。二甲双胍是一种人工合成的双胍，目前是世界各地治疗糖尿病最推荐的药物之一。它主要抑制肝脏的糖异生肠道葡萄糖吸收，增加肌肉中葡萄糖的消耗以及增加胰岛素敏感性进而控制血糖。二甲双胍除了控制血糖的作用外也可用于非糖尿病的情况，研究数据已证实二甲双胍对多种癌症具有抗癌活性，它也适用于炎症性皮肤病、神经病变、多囊卵巢等。除此之外发现二甲双胍也有抗菌作用，研究发现二甲双胍通过诱导线粒体ROS的产生抑制细胞内分枝杆菌的生长，限制疾病免疫病理，增强其他抗结核药物的疗效，并可用于耐药结核病的联合治疗。二甲双胍可增强利福平对牛分枝杆菌的活性。最近研究揭示二甲双胍可作为一种抑制耐药大肠杆菌的新型四环素佐剂，可避开多药耐药细菌病原体，改善顽固性感染的治疗。

但目前并未有研究涉及二甲双胍是否能在治疗鲍曼不动杆菌感染中起到辅助作用，也未有研究涉及二甲双胍与米诺环素的联用是否能够有效治疗鲍曼不动杆菌感染。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明首次验证二甲双胍作为佐剂参与米诺环素的抗菌作用及其抗菌机制，二甲双胍能够协同米诺环素抑制鲍曼不动杆菌的感染，两者联用可有效抑制鲍曼不动杆菌的感染而发挥抗细菌的作用效果，尤其适用于米诺环素耐药鲍曼不动杆菌的感染。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供二甲双胍在制备预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

进一步地，所述二甲双胍作为抗生素佐剂，所述抗生素为米诺环素。

本发明的第二个方面是提供二甲双胍作为抗生素佐剂的应用，其中所述抗生素为米诺环素。

进一步地，所述应用包括但不限于：二甲双胍和米诺环素联用来预防和治疗鲍曼不动杆菌的感染。

在上述两种应用中，进一步地，所述二甲双胍可破坏鲍曼不动杆菌的细菌外膜、增强膜电位、增强鲍曼不动杆菌的氧化应激反应从而协同米诺环素抑制鲍曼不动杆菌的感染。

在上述两种应用中，进一步地，所述鲍曼不动杆菌包括：米诺环素敏感鲍曼不动杆菌、米诺环素中介鲍曼不动杆菌、米诺环素耐药鲍曼不动杆菌。

本发明的第三个方面是提供一种用于预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的组合物，其中所述组合物包括二甲双胍和米诺环素。

进一步地，在所述组合物中，所述二甲双胍的质量浓度为0.15625～20g/L，优选0.625～20g/L，更优选5～20g/L；所述米诺环素的质量浓度为0.5～32mg/L，优选0.5～8mg/L，更优选0.5～4mg/L。

进一步地，所述鲍曼不动杆菌包括：米诺环素敏感鲍曼不动杆菌、米诺环素中介鲍曼不动杆菌、米诺环素耐药鲍曼不动杆菌。

进一步地，所述组合物包括4mg/L米诺环素及5g/L二甲双胍、8mg/L米诺环素及5g/L二甲双胍、或者32mg/L米诺环素及20g/L二甲双胍，以分别适用于治疗米诺环素敏感鲍曼不动杆菌、米诺环素中介鲍曼不动杆菌、米诺环素耐药鲍曼不动杆菌的感染。

本发明的第四个方面是提供一种任一上述的组合物在制备预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

进一步地，所述二甲双胍和米诺环素分别为独立包装，其采用溶剂溶解。其中，所述溶剂优选ddH₂O。

进一步地，所述药物的剂型包括但不限于：注射剂型、口服剂型，更优选为注射剂型。

进一步地，所述药物还可包括药学上可接受的制剂。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明首次验证发现二甲双胍可以破坏鲍曼不动杆菌的细菌外膜，并增强其膜电位，增强其氧化应激反应从而辅助增加米诺环素的抗菌作用，且通过实验研究证实二甲双胍能够协同米诺环素发挥抗鲍曼不动杆菌的作用，减少米诺环素的用量，以及治疗米诺环素耐药鲍曼不动杆菌引发的感染，具体地，当二甲双胍和米诺环素联用时，超过50％的鲍曼不动杆菌在12h内被杀死，每毫升CFU在12h之后降低大于2log10，这证明二甲双胍可以协同米诺环素发挥良好的抗菌作用。

附图说明

图1为本发明一实施例中二甲双胍和米诺环素联合的棋盘实验的结果示意图；其中，A部分为所用菌株米诺环素敏感菌株A1棋盘实验，B部分为米诺环素中介菌株A163棋盘实验，C部分为米诺环素耐药菌株A133棋盘实验；上述菌株均在37℃孵育18h后，用酶标仪测定每个孔在600nm处的光密度值，颜色深浅代表抑制率的高低。

图2为本发明一实施例中二甲双胍和米诺环素单独或联合用药的鲍曼不动杆菌的时间杀菌曲线；其中A部分为菌株A1经过4种不同的药物处理方式后在12h内的细菌数量变化趋势，B部分为菌株A163经过4种不同的药物处理方式后在12h内的细菌数量变化趋势，C部分为A133经过4种不同的药物处理方式后在12h内的细菌数量变化趋势。

图3为本发明一实施例中二甲双胍作用于鲍曼不动杆菌的机制研究的结果示意图；其中A、B、C部分分别代表采用二甲双胍单独处理A133菌株对细菌外膜完整性、膜电位、ROS水平的影响；D、E、F部分分别为米诺环素联合二甲双胍处理A133菌株对细菌外膜完整性、膜电位、ROS水平的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

在下述实施例中，鲍曼不动杆菌优选为米诺环素不同敏感性的鲍曼不动杆菌，具体采用的米诺环素敏感菌株A1、中介菌株A163和耐药菌株A133均为临床分离株，均保藏于扬州大学病原微生物学实验室。二甲双胍购于SellecK公司，米诺环素购于索莱宝公司。通过下述实施例的研究：发现二甲双胍可以破坏细菌外膜、增强膜电位、增强细菌的氧化应激反应而辅助增加抗生素的抗菌作用；二甲双胍能够显著降低鲍曼不动杆菌对米诺环素的MIC值，使得大部分菌株的米诺环素MIC值降低，这证明二甲双胍可以协同米诺环素发挥抗菌作用，从而使得两者的联用可用于预防和治疗鲍曼不动杆菌的感染。

实施例1-棋盘试验检测二甲双胍与米诺环素的协同

本实施例采用临床分离株米诺环素敏感菌株A1、中介菌株A163和耐药菌株A133，采用的米诺环素和二甲双胍的溶剂均为ddH₂O，配置成母液后用MH肉汤培养基稀释成所需浓度(27g/1000mL蒸馏水)。二甲双胍浓度需求高时，也可直接溶MH用于实验。

本实施例检测了上述菌株A1、A163、A133的二甲双胍的最小抑菌浓度，根据CLSI2015指南，采用标准的肉汤微量稀释法测定所有化合物的最低抑菌浓度(MIC)。药物在MHB中加倍稀释，在无菌的96孔板中与等量的鲍曼不动杆菌悬液混合，其中细菌浓度大约为1.5×10⁶CFU/mL。37℃孵育18h后，用酶标仪测定每个孔在600nm处的光密度。MIC值定义为无明显细菌生长的抗生素最低浓度。根据检测结果得知上述菌株的MIC值分别为：A1：20mg/ml、A163：20mg/ml、A133：80mg/ml，这表明二甲双胍的单独抑菌作用较弱。

本实施例还采用棋盘试验检测二甲双胍对米诺环素的协同作用。米诺环素沿纵坐标稀释(0～32μg/mL)，二甲双胍沿横坐标稀释(0～80mg/mL)。细菌生长至0.5麦克浊度标准，然后在MH肉汤中稀释为1：100。将100μL的MH分配到96孔板的孔中。在37℃孵育18h后，用酶标仪测定每个孔在600nm处的光密度。

协同抑菌指数(FICI)按下述公式计算：

FICI＝MIC_{米诺环素(联合)}/MIC_{米诺环素(单药)}+MIC_{二甲双胍(联合)}/MIC_{二甲双胍(单药)}

当FICI≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用，且FICI指数越小，协同作用越强；0.5<FICI≤4时认为两药之间作用无关；当FICI>4时两药产生拮抗作用。

上述棋盘实验的结果如图1和表1所示：

表1-二甲双胍与米诺环素联用对米诺环素不同敏感性鲍曼不动杆菌的协同抑菌指数

由图1所示结果可知，不同浓度的二甲双胍均显著降低了3株鲍曼不动杆菌的米诺环素的MIC值，由表1所示结果可知，菌株A1与A163米诺环素MIC值降低4倍，A133菌株米诺环素MIC值降低8倍，且FICI均≤0.5，表明二甲双胍和米诺环素之间具有协同作用，这提示二甲双胍可以协同米诺环素发挥抗菌作用，可用来治疗米诺环素耐药的鲍曼不动杆菌感染。

实施例2-时间杀菌曲线检测二甲双胍与米诺环素的协同效果

为了进一步证明二甲双胍与米诺环素的协同作用，本发明分别选取实施例1所示的棋盘实验中证明有效的三株菌A1、A163、A133分别进行时间杀菌实验，将上述三株菌在MH肉汤培养基中稀释1/1000过夜，37℃培养4h(指数期)，A1和A133起始细菌浓度为5×10⁷CFU/mL，A163起始细菌浓度为1×10⁶CFU/mL；然后分别用米诺环素和二甲双胍或两者联合作用12h，每隔2h取出100μL等份，离心后再悬浮于100μL无菌磷酸缓冲液中。然后将10倍连续稀释的悬浮液放在MHA平板上，在37℃下孵育过夜，计数细菌菌落数，计算菌落数(CFU/mL)。其中，各菌株的用药方案如下所示：

敏感株A1培养液中加入终浓度为4μg/ml米诺环素及5mg/ml二甲双胍单独或联合药物处理；中介株A163培养液中加入终浓度8μg/ml米诺环素及5mg/ml二甲双胍单独或联合药物处理处理；耐药株A133培养液中加入终浓度32μg/ml米诺环素及20mg/ml二甲双胍单独或联合药物处理。

上述时间杀菌实验的结果如图2所示，A1、A163、A133菌株的时间杀菌曲线实验中，相比于单独用药组，联合用药组中超过50％的细菌在12h内被杀死，细菌减少的数量大于2log10，进一步证明二甲双胍可以协同米诺环素发挥抗菌作用。

实施例3-二甲双胍与米诺环素的协同机制

本实施例以A133菌株作为实验研究对象，分别研究了二甲双胍单独处理A133菌株、米诺环素联合二甲双胍处理A133菌株对鲍曼不动杆菌细胞膜影响的机制研究，其具体包括：

1)外膜完整性：细菌生长至0.5麦克浊度标准，离去上清，加入磷酸盐缓冲液重悬，分别用不同浓度二甲双胍(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml)单独处理及不同浓度米诺环素(8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml)联合20mg/ml二甲双胍处理1h，然后离去上清，加入磷酸盐缓冲液，加入终浓度为10×10^-6M 1-苯基萘胺(NPN)染料。孵育30min后，在黑色96孔板中加入200μL菌悬液，酶标仪检测荧光强度，激发波长350nm，发射波长420nm。

2)膜电位：细菌生长至0.5麦克浊度标准，离去上清，加入磷酸盐缓冲液重悬，分别用不同浓度二甲双胍(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml)单独处理及不同浓度米诺环素(8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml)联合20mg/ml二甲双胍处理1h，然后离去上清，加入磷酸盐缓冲液，加入终浓度为0.5×10^-6M DiSC3染料。孵育30min后，在黑色96孔板中加入200μL菌悬液，用酶标仪检测荧光强度，激发波长622nm，发射波长670nm。

3)ROS水平：细菌生长至0.5麦克浊度标准，离去上清，加入磷酸盐缓冲液重悬，分别用不同浓度二甲双胍(10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、80mg/ml)单独处理及不同浓度米诺环素(8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml)联合20mg/ml二甲双胍处理1h，然后离心去上清，加入磷酸盐缓冲液，孵育1h后，加入终浓度10×10^-6M DCFH-DA立即测量荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为525nm。

上述实验以A133菌株作为实验研究对象，其结果如图3所示。由图3的A、B、C部分可知，采用二甲双胍单药处理时，在不同浓度二甲双胍处理后，细菌显示不同程度的外膜完整性降低，膜电位升高，ROS水平升高，即荧光强度越强膜完整性越差，膜电位及ROS水平越高；由图3的D、E、F部分可知，采用米诺环素联合二甲双胍处理时，在二甲双胍浓度一定时，随着米诺环素浓度增高外膜完整性降低，膜电位无明显变化，ROS水平升高。由上述实验结果可知，二甲双胍可以破坏细菌外膜、增强膜电位、增强细菌的氧化应激反应而辅助增加抗生素的抗菌作用。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

Claims

1.二甲双胍在制备预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二甲双胍作为抗生素佐剂，所述抗生素为米诺环素。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述二甲双胍可破坏鲍曼不动杆菌的细菌外膜、增强膜电位、增强鲍曼不动杆菌的氧化应激反应从而协同米诺环素抑制鲍曼不动杆菌的感染。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，所述鲍曼不动杆菌包括：米诺环素敏感鲍曼不动杆菌、米诺环素中介鲍曼不动杆菌、米诺环素耐药鲍曼不动杆菌。

5.一种用于预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的组合物，其特征在于，包括二甲双胍和米诺环素。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述二甲双胍的质量浓度为0.15625～20g/L，所述米诺环素的质量浓度为0.5～32mg/L。

7.一种如权利要求5～6中任一项所述的组合物在制备预防和治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述二甲双胍和米诺环素分别为独立包装，其采用溶剂溶解。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂型、口服剂型。