CN113082026B - 一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用，具体的是DHA27制备多粘菌素抗铜绿假单胞菌增效剂中的应用，并筛选出DHA27发挥抗菌增敏作用的最佳药物配伍。

Description

一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用，特别是治疗铜绿假单胞菌感染的用途。

背景技术

随着临床上抗菌药物的大量使用，导致细菌耐药情况愈发严重。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)作为在自然界、人体皮肤、呼吸道和医院环境中广泛存在的革兰阴性菌，是引发院内感染的最主要病原菌之一。由于PA具有天然耐药和后天获得性耐药的特点，也使得PA感染的治疗成为国内外抗感染研究的一项巨大挑战。中国细菌耐药监测网(CHINET)数据表明，铜绿假单胞菌近年来临床分离率一直排名在前五之内。随着碳青霉烯类抗菌药物临床上的大量使用，使得铜绿假单胞菌对现有治疗其感染的最后一道防线的药物也产生了耐药，目前我国临床分离菌株对抗生素耐药形势严峻，延缓耐药菌的传播迫在眉睫。

青蒿琥酯作为重要的青蒿素衍生物，具有抗疟疾、抗肿瘤、抗炎和抗菌增敏作用。DHA27是在青蒿琥酯基础上，保留母核结构，对其支链进行改造获得的新型青蒿素衍生物。在大肠埃希菌中联合β-内酰胺类抗生素具有明显抗菌增敏作用，对其作用机制进行研究发现DHA27可抑制AcrAB-TolC外排泵而增加药物积聚，从而发挥抗菌增敏作用。

目前并未有青蒿素衍生物协同多粘菌素抗菌增敏的报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，研究青蒿素衍生物DHA27在临床常见细菌中与多种抗生素的抗菌增敏作用，特别是可以大大增强铜绿假单胞菌对多黏菌素类抗生素敏感性的生物学活性。

本发明的目的之一是提供一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用。

具体的，所述青蒿素衍生物为DHA27，制备方法如第三军医大学《基于青蒿琥酯抗菌增敏作用的新型AcrB抑制剂的设计、合成及作用研究》报道的方法合成，其结构式如下所示：

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进一步的，所述抗菌增效剂为抗铜绿假单胞菌增效剂。

进一步的，所述抗菌增效剂主要由多粘菌素B和青蒿素衍生物混合而成。

再进一步的，多粘菌素B和青蒿素衍生物的质量比为200:7.5～30。

优选的，多粘菌素B和青蒿素衍生物的质量比为200:7.5、200:15、200:30。

本发明还有一个目的是提供一种含多粘菌素的药物组合物，主要由多粘菌素B和青蒿素衍生物混合而成，所述青蒿素衍生物为DHA27。

具体的，多粘菌素B和DHA27的质量比为200:7.5～30。

优选的，多粘菌素B和青蒿素衍生物的质量比为200:7.5、200:15、200:30。

本发明的工作原理及有益效果：多黏菌素药物从上世纪50年代起用于养殖业和临床治疗，但是由于其肾毒性使其临床应用受到限制。随着多重耐药铜绿假单胞菌和耐碳青霉烯类肠杆菌的出现，多黏菌素的应用重新受到重视。临床上较为常用的多黏菌素类抗生素为多黏菌素B，多黏菌素发挥抗菌作用的主要机制为：多黏菌素带有正电荷，革兰阴性菌外膜脂多糖上类脂A的磷酸基团带负电荷，两者通过静电作用，破坏细菌外膜完整性，增加膜的通透性，从而导致细菌死亡。

虽然根据以往的报道多粘菌素出现耐药的几率较低，且都为细菌染色体上基因突变导致、不会在不同细菌间传播。然而，最近有报道称一些大肠杆菌会产生多粘菌素抗性，而且可在不同菌株中水平传播，为了防止其他细菌例如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金葡菌等产生多粘菌素抗性，从而使临床治疗细菌感染变得复杂和困难，甚至濒临无药可用的境地，因此，探索新的策略和方法已成为当务之急。

申请人在此基础上研究DHA27与多种抗菌药物联合使用对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金葡菌的协同抗菌作用，并筛选出DHA27发挥抗菌增敏作用的最佳药物配伍。

附图说明

图1为DHA27明显增强多黏菌素B对铜绿假单胞菌的体外抗菌增敏活性示意图；

图2为DHA27联合多黏菌素B对PA感染小鼠死亡率的改善示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

在本实施方案中首先参考2020年美国临床和实验室标准协会(Clinical andLaboratory Standards Institute，CLSI)药物敏感标准判断，选择质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853，临床分离菌株来源于贵州遵义地区。

实施例1：DHA27与β-内酰胺类抗生素、头孢菌素类抗生素、碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、多黏菌素类抗生素、氟喹诺酮类抗生素单独使用时，对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)的影响。

采用微孔二倍稀释法，调整细菌浓度为1×106CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，加入各药物至含有细菌培养孔内，根据溶解度依次倍比稀释，置37℃培养箱孵育18～24h，读取阳性和阴性对照孔，阴性对照孔清亮，阳性对照孔混浊。药物对细菌的MIC为抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度。此次实验结果表明DHA27单独使用不能完全抑制细菌生长，并观察了β-内酰胺类抗生素哌拉西林、头孢菌素类抗生素头孢他啶、碳青霉烯类抗生素亚胺培南、氨基糖苷类抗生素庆大霉素、多黏菌素类抗生素多黏菌素B、氟喹诺酮类抗生素环丙沙星对该铜绿假单胞菌的抑菌效力，结果示于表1。

表1 DHA27和不同抗生素单独使用时对铜绿假单胞菌ATCC27853的MIC

实施例2：DHA27与氟喹诺酮类抗生素环丙沙星、碳青霉烯类抗生素亚胺培南和多黏菌素类抗生素多黏菌素B联合应用后对铜绿假单胞菌MIC的影响。

采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为1×106CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，将对氟喹诺酮类抗生素环丙沙星、碳青霉烯类抗生素亚胺培南和多黏菌素类抗生素多黏菌素B与不同浓度DHA27分别配伍，观察配伍后的药物对铜绿假单胞菌ATCC27853 MIC的影响，具有协同效应用联合抑菌指数说明。联合抑菌指数是指在2种或多种药物同时使用的情况下，各种药物的联合用药时的最低抑菌浓度(MIC)与单独用药时的MIC的比值之和(FIC)，是评价药物具有联合效应的金标准。一般情况下，FIC≤0.5为协同作用；0.5～4.0为无关作用；＞4.0为拮抗作用。

FIC＝抗生素联用时的MIC/抗生素单用时的MIC+DHA27联合抗生素的MIC/DHA27单独的MIC

此次实验结果表明DHA27单独使用虽然不能完全抑制细菌生长，但与多黏菌素类抗生素联合应用后可明显降低多黏菌素类抗生素的MIC，说明DHA27可以增加铜绿假单胞菌ATCC27853对多黏菌类抗生素多黏菌素B的敏感性。但在目前环丙沙星、庆亚胺培南的MIC，DHA27未增加铜绿假单胞菌ATCC27853对氟喹诺酮类抗生素环丙沙星、碳青霉烯类抗生素亚胺培南的敏感性，结果见表2。

表2氟喹诺酮类抗生素环丙沙星、碳青霉烯类抗生素亚胺培南和多黏菌素类抗生素多黏菌素B与DHA27联合使用时对铜绿假单胞菌ATCC27853的影响，(FIC为评判标准)

实施例3：DHA27和多黏菌类抗生素多黏菌素B及其联合使用时对铜绿假单胞菌MIC生长情况的影响。

采用抑菌曲线法，调整细菌浓度为1×106CFU/mL，DHA27(1/16MIC、1/32MIC)、多黏菌素B(1/4MIC)的浓度加入到细菌悬浮液中。于加入药物后的2h、4h、8h、12h、24h测量OD值。

此次结果表明DHA27明显增强了多黏菌类抗生素多黏菌素B对铜绿假单胞菌的体外抗菌增敏活性，结果见图1。

实施例4：DHA27与多黏菌素类抗生素单独使用时，对铜绿假单胞菌临床分离菌株的最低抑菌浓度(MIC)的影响。

采用微孔二倍稀释法，调整细菌浓度为1×106CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，加入各药物至含有细菌培养孔内，根据溶解度依次倍比稀释，置37℃培养箱孵育18～24h，读取阳性和阴性对照孔，阴性对照孔清亮，阳性对照孔混浊。药物对细菌的MIC为抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度。此次实验结果表明DHA27单独使用不能完全抑制细菌生长，并观察了多黏菌素类抗生素多黏菌素B对20株铜绿假单胞菌临床分离菌株的抑菌效力，结果示于表3、表4。

表3多黏菌素B单独使用时对20株铜绿假单胞菌临床分离菌株的MIC

表4 DHA27单独使用时对20株铜绿假单胞菌临床分离菌株的MIC

实施例5：DHA27与多黏菌素类抗生素多黏菌素B联合应用后对20株铜绿假单胞菌临床分离菌株MIC的影响

采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为1×106CFU/mL，接种于96孔无菌培养板内，将对多黏菌素类抗生素多黏菌素B与不同浓度DHA27分别配伍，观察配伍后的药物对铜绿假单胞菌临床分离菌株MIC的影响，具有协同效应用联合抑菌指数说明。联合抑菌指数是指在2种或多种药物同时使用的情况下，各种药物的联合用药时的最低抑菌浓度(MIC)与单独用药时的MIC的比值之和(FIC)，是评价药物具有联合效应的金标准。一般情况下，FIC≤0.5为协同作用；0.5～4.0为无关作用；＞4.0为拮抗作用。

FIC＝抗生素联用时的MIC/抗生素单用时的MIC+DHA27联合抗生素的MIC/DHA27单独的MIC

此次实验结果表明虽然临床分离菌株耐药情况与质控菌株相比更加严重，但是绝大部分临床分离菌株中发现DHA27与多黏菌素类抗生素联合应用后可明显降低多黏菌素类抗生素的MIC，说明DHA27可以增加铜绿假单胞菌临床分离株对多黏菌素类抗生素联合应用后可明显降低多黏菌素类抗生素多黏菌素B的敏感性，结果见表5。

表5多黏菌素类抗生素多黏菌素B与DHA27联合使用时对20株铜绿假单胞菌临床分离菌株的影响，(FIC为评判标准)

实施例6：探究DHA27联合多黏菌素B对铜绿假单胞菌感染模型小鼠的7天死亡率的影响。

SPF级雄性BALB/c小鼠140只，周龄为4～6周，体重18.0～22.0g，随机数字法将动物分成7组，每组20只，分组如下：

第1组：Control组；

第2组：菌液组(5×107CFU/mL)；

第3组：菌液(5×107CFU/mL)+DHA27(30mg/kg/d)组；

第4组：菌液(5×107CFU/mL)+多黏菌素B(200mg/kg/d)组；

第5组：菌液(5×107CFU/mL)+多黏菌素B(200mg/kg/d)+DHA27(7.5mg/kg/d)组；

第6组：菌液(5×107CFU/mL)+多黏菌素B(200mg/kg/d)+DHA27(15mg/kg/d)组；

第7组：菌液(5×107CFU/mL)+多黏菌素B(200mg/kg/d)+DHA27(30mg/kg/d)组。

DHA27和抗生素均为肌肉注射给药，给药体积为0.05ml/10g体重，活菌为腹腔注射给菌，给菌体积为0.1ml/10g体重。于给菌后4h开始第一次给药，每天给药两次，同时给予抗生素，直至小鼠死亡或持续7天。

此次实验结果表明通过小鼠7天死亡率观察DHA27联合多黏菌素B对该细菌建立的脓毒症模型小鼠具有保护作用，结果见图2。

由以上结果可知：DHA27对于铜绿假单胞菌标准菌株和临床分离菌株均没有单独抗菌作用，但与多黏菌素类抗生素联合应用后均明显降低多黏菌素类抗生素的MIC，说明DHA27可以增加铜绿假单胞菌对多黏菌类抗生素多黏菌素B的敏感性；并在体内实验中发现DHA27联合多黏菌素B对铜绿假单胞菌感染模型小鼠具有保护作用，DHA27联合多黏菌素B对铜绿假单胞菌具有抗菌增敏作用。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (2)

1.一种青蒿素衍生物在制备多粘菌素抗菌增效剂中的应用，其特征在于：所述青蒿素衍生物为DHA27，所述菌为铜绿假单胞菌，DHA27和多粘菌素联合使用时，MIC小于1/4，多粘菌素B和DHA27的质量比为200:7.5~30；其中DHA27的结构式如下所示：

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2.一种含多粘菌素的抗铜绿假单胞菌增效剂，其特征在于：由多粘菌素B和青蒿素衍生物混合而成，所述青蒿素衍生物为DHA27，多粘菌素B和DHA27的质量比为200:7.5~30；其中DHA27的结构式如下所示：

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